CC BY
106
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 575.1
Поздняя репликация инактивированной Х-хромосомы в плюрипотентных стволовых клетках человека не зависит от степени компактизации ее хромосомной территории
А. В. Панова, Е. Д. Некрасов, М. А. Лагарькова, С. Л. Киселёв, А. Н. Богомазова*
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, Москва, ул. Губкина, 3 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 20.12.2012
РЕФЕРАТ В женских соматических клетках млекопитающих работает эпигенетический механизм до-зовой компенсации, включающий инактивацию одной из двух Х-хромосом через формирование факультативного гетерохроматина. В отличие от плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) мыши, статус Х-хромосомы в плюрипотентных клетках человека является эпигенетически пластичным признаком. Известно, что для гетерохроматина свойственна поздняя репликация в поздней S-фазе клеточного цикла после репликации эухроматина. Это характерно и для факультативного гетерохроматина инактивированной Х-хромосомы. Принято считать, что неактивная Х-хромосома в клетках млекопитающих всегда имеет большую конденсацию в интерфазном ядре. Предполагается, что именно плотная упаковка определяет позднюю репликацию инактивированной Х-хромосомы. Методом полнохромосомной ДНК-гибридизации in situ на интерфазных ядрах мы показали, что ПСК человека с инактивированной Х-хромосомой могут иметь как релаксированную, так и компактную хромосомную территорию неактивной Х-хромосомы. Поздняя репликация инактивированной Х-хромосомы также не зависит от степени компактизации ее хромосомной территории. Тем не менее для перехода Х-хромосомы к активному состоянию при ее реактивации и для синхронной репликации необходимым условием является декомпактизация хромосомной территории Х-хромосомы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА репрограммирование, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипо-тентные стволовые клетки, хромосомные территории, Х-хромосома, поздняя репликация.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЭСК - эмбриональные стволовые клетки; ИПСК - индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки; ПСК - плюрипотентные стволовые клетки; DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол; H3K27me3 - трижды метилированный лизин 27 гистона Н3; H3K4me2 - дважды метилированный лизин 4 гистона Н3; H3K9me3 - трижды метилированный лизин 9 гистона Н3; Xi - инактивированная Х-хромосома; Xa - активная Х-хромосома; FISH - флуоресцентная гибридизация in situ; BrdU - 5-бромо-2-дезоксиуридин.
ВВЕДЕНИЕ денсированного эухроматина происходит в начале
Структура хроматина и архитектура ядра являются S-фазы, в то время как зоны конденсированного хро-важнейшими элементами регуляции основных ядер- матина реплицируются в конце S-фазы [2]. Т. Ryba ных генетических процессов: транскрипции и репли- и соавт. предположили, что поздняя репликация кации. Известно, что хромосомы в интерфазном ядре плотно упакованных хроматиновых доменов может занимают определенные, не перекрывающиеся друг быть обусловлена трудным доступом к этим регио-с другом области, формируя так называемые хромо- нам факторов инициации репликации [3]. сомные территории, причем более плотно упакован- Один из примеров массивного гетерохромати-ный гетерохроматин располагается преимуществен- нового домена внутри ядра в женских соматиче-но в периферийной и приядрышковой зонах ядра ских клетках млекопитающих - инактивирован-[1]. Репликация деконденсированного эухроматина ная X-хромосома, которая в результате действия и плотно упакованного гетерохроматина разнесена механизмов дозовой компенсации утрачивает спои в пространстве, и во времени. Репликация декон- собность к транскрипции, формирует компактное
тельце Барра на периферии ядра и реплицируется в конце S-фазы [4].
Интересную возможность для изучения связи различных эпигенетических состояний хроматина, организации хромосомных территорий в интерфазном ядре и регуляции репликации предоставляет вариабельность статуса инактивации Х-хромосомы в женских плюрипотентных стволовых клетках (ПСК) человека [5-7].
В настоящее время описаны линии женских эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека с двумя активными Х-хромосомами, с одной инактивированной Х-хромосомой, а также линии ЭСК человека с инактивированной Х-хромосомой без классических цитологических признаков инактивации. По поводу индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека на сегодня нет однозначного мнения о возможности полной реактивации Х-хромосомы и долговременного поддержания этого активного статуса в культуре, но, несомненно, Х-хромосома при репрограммировании претерпевает ряд значительных эпигенетических изменений, связанных, по крайней мере, с частичной реактивацией [8-10]. Целью нашего исследования стал поиск взаимосвязи между временем репликации Х-хромосом в ПСК человека с разным статусом инактивации Х-хромосомы и степенью компактизации их хромосомных территорий.
Наши результаты показывают, что репликация неактивной Х-хромосомы в поздней S-фазе клеточного цикла может быть не связана с компактной организацией хромосомной территории, и поздно реплицирующаяся и транскрипционно неактивная Х-хромосома в женских ПСК может находиться в ре-лаксированном состоянии. Тем не менее при переходе Х-хромосомы в активное состояние, сопровождающееся синхронизацией репликации гомологичных Х-хромосом, происходит релаксация ее хромосомной территории.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные культуры
Линии ЭСК человека hESM01, hESM04 описаны ранее [11]. Линия HUES 9 любезно предоставлена ее автором Дугласом Мелтоном (Гарвардский университет, США) [12]. Линия эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) получена согласно [13]. Линии ИПСК, клоны iPS-6, iPS-7 с неполным репрограммированием и клон iPS-12 с полным репрограммированием получены из клеток HUVEC с помощью лентивирусной трансфекции четырьмя факторами транскрипции: KLF4, OCT4, SOX2 и C-MYC [14], и описаны в [15]. Линия ИПСК МА-02
получена из фибробластов кожи по ранее описанной методике [16].
Линии ПСК культивировали в среде mTeSRl (StemCell Technologies) на чашках Петри, покрытых матригелем (Matrigel, BD). Линию HUVEC культивировали в DMEM/F12 с добавлением 15% FBS, 5 нг/мл hrbFGF (Peprotech), 20 нг/мл hrVEGF (Peprotech), 1% заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина и 50 нг/мл стрептомицина (все от Hyclone). Все клеточные линии культивировали в 5% CO2 при 37 C.
Иммуноокрашивание
Иммуноокрашивание ядер и метафазных хромосом проводили, как описано [8]. Использовали первичные антитела: поликлональные антитела кролика к H3K27me3 (Millipore, разведение 1 : 500), поликлональные антитела кролика к H3K4me2 (Abcam, 1 : 200) и моноклональные антитела мыши к H3K4me2 (Abcam, 1 : 100), поликлональные антитела кролика к H3K9me3 (Abcam, 1 : 200). Использовали вторичные козьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 546 (Invitrogen, 1 : 1000) или вторичные козьи антитела к IgG мыши, конъюгированные с Al-exa Fluor 488 (Invitrogen, 1 : 1000). ДНК ядер и ме-тафазных хромосом окрашивали DAPI, наносили на препарат Vectashield (Vector Laboratories), покрывали препарат покровным стеклом.
РНК-FISH
РНК-FISH проводили, как описано в [17], с флуоресцентно меченными ДНК-пробами BAC-клонов (Empire Genomics). Использовали следующие BAC-клоны: RP11-13M9 для локуса XIST и RP11-1104L9 для локуса POLA1.
Гибридизация in situ с полнохромосомной пробой (пейнтинг)
Для приготовления препаратов интерфазных ядер клетки обрабатывали трипсином (0.05% Trypsin, Hyclone). Трипсин инактивировали с помощью FBS (Hyclone). Обрабатывали гипотоническим раствором (0.075 M KCl) в течение 18 мин при 37 C. Клетки фиксировали двумя фиксаторами (смесью метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 6 : 1 и в соотношении 3 : 1 соответственно). Фиксированные клетки хранили в фиксаторе (3 : 1) при -20°C. Суспензию фиксированных клеток наносили на холодное мокрое стекло, готовые препараты сушили на воздухе в течение 1 сут. Для улучшения качества FISH препараты инкубировали в 0.25% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре, предобработанные препараты дегидратировали последовательно в 70, 80 и 96% этаноле, а затем обра-
батывали 0.002% раствором пепсина (Sigma) в 0.01 M HCl в течение 30 с при 37°С и снова дегидратировали в этаноле. Денатурацию проводили в 70% формамиде в двукратном SSC-буфере в течение 5 мин при 75°C с последующей дегидратацией в этаноле. Полнохромосомные пробы к хромосомам Х и 8 были произведены компанией MetaSystems. Далее препараты окрашивали DAPI, наносили на препарат Vectashield (Vector Laboratories), покрывали препарат покровным стеклом.
Детекция времени репликации с использованием 5-бромо-2-дезоксиуридина (BrdU)
Клетки инкубировали в присутствии 5-бромо-2-дезоксиуридина в конечной концентрации 1 мкМ в течение 20 мин за 6-10 ч до фиксации. Колцемид (Demicolcine solution, Sigma) в конечной концентрации 0.2 мкг/мл добавляли в среду с культивируемыми клетками за 1 ч до фиксации. Препараты ме-тафазных хромосом готовили так же, как описано выше для интерфазных ядер. Для денатурации ДНК препараты метафазных хромосом обрабатывали 70% формамидом в двукратном SSC-буфере в течение 5 мин при 75°C, далее их дегидратировали в этаноле и инкубировали с первичными мышиными антителами к BrdU (Sigma, 1 : 1000) в течение 2 ч при 37°C. Отмывку производили в растворе PBS-0.1% Твин-20. Затем препараты инкубировали с вторичными козьими антителами к IgG мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 546 (Invitrogen, 1 : 1000), в течение 1 ч при комнатной температуре и окрашивали DAPI. Идентификацию Х-хромосомы проводили по инвертированному DAPI-бэндингу или с помощью FISH с Х-специфической пробой.
Микроскопия и фотографирование
Препараты метафазных хромосом и интерфазных ядер анализировали на эпифлуоресцентном микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss). Цветные фотографии микрообъектов в псевдоцветах получали с помощью программы AxioVision (Carl Zeiss).
Сравнение степени компактизации хромосом, расчет дисперсии
Для объективного сравнения степени компактизации двух Х-хромосом в каждой отдельной клетке мы использовали программу, специально разработанную для данного эксперимента. Объяснение алгоритма обсчета приведено ниже.
Рассмотрим канал микрофотографии интерфазных ядер, в котором хранится информация о яркости свечения окрашенных хромосомных территорий.
Пусть х, y - координаты на плоскости точек изображения, а P (х, у) - функция яркости точки изо-
бражения от координаты. Сначала отсекали фоновый уровень свечения линейным преобразованием:
Р(х, у) = к ■ Р (х, у) + Ь.
Обозначим область изображения, в которой находится анализируемая хромосомная территория, как G. Для каждой хромосомной территории вычисляли параметры Р , х , у0 следующим образом:
Уо
P0 = ff P ( y)dxdy
G
= P ff (x ■ P(x,y^dxdy
P0 G
= P ff (y 'p (x y))dxdy.
0 G
После чего выполняли замену переменных Р(х, у) Р(г, ф) согласно формулам перехода, приведенным ниже:
[ X - х0 = Г • соб(^) [ у - Уо =г • ^пО).
Данная замена переменных есть не что иное, как переход в полярные координаты с центром в точке Х Уо)-
Затем проводили усреднение функции Р(г, ф) по переменной ф таким образом - Р(г, ф) ^ Р(г). Формула усреднения приведена ниже.
P( r ) =
2п
/ P(r ,v)dy
2п
Функцию P(r) нормировали P(r) P (r).
P(r )
P (r ) =
J P(r )dr
Функцию Р (г) аппроксимировали нормальным распределением N(г) методом наименьших квадратов:
V2
e2о ,
по
т.е. подбирали такое значение а, при котором:
f (P (Г ) - N(Г ))2 )'
min.
x
r
1
Таблица 1. Сводная таблица оценки статуса Х-хромосом в плюрипотентных и соматических клетках человека, использованных в работе
Линия клеток Н3К4те2, марка активного хроматина H3K27me3, марка гетерохроматина Н3К9те3, марка гетерохроматина РНК-FISH Статус Х-инактивации
XIST-облако Экспрессия РОЬЛ1
HUES 9 + - Отдельные бэнды - Биаллельная ХаХа*
hESM01 + - + - Моноаллельная ХаХi *
hESM04 - + + + Моноаллельная ХаХi
iPS MA-02 + - - - Биаллельная ХаХа
HUVEC - + + + Моноаллельная ХаХi
iPS-6 - + + + То же ХаХi
iPS-7 - + + + «-« ХаХi
iPS-12 + + + + «--« ХаХi
*ХаХа - линии с двумя активными Х-хромосомами, ХаХi - линии, в которых одна Х-хромосома неактивна.
Параметр о2 является дисперсией нормального распределения, именно он выдавался программой в качестве результата анализа и далее использовался для оценки компактизации хромосомных территорий. В работе получены значения о2 для каждой фотографии Х-хромосомы каждого ядра во всех линиях клеток.
Для каждого отдельно взятого ядра рассчитывали отношение дисперсии хромосомы с большим значением о2 к дисперсии с меньшим значением о2. В качестве контроля и определения пороговых значений отношения дисперсий двух хромосом о12/о12 использовали сравнение со значением о12/о12 для двух ау-тосом в одной клетке. В результате сравнения ауто-сом было выявлено пороговое значение о12/о12 = 2.1. Таким образом, все клетки со значением о12/о12 < 2.1 для Х-хромосом считались обладателями двух де-компактизованных (релаксированных) хромосомных территорий. В результате анализа отношения дисперсий Х-хромосом в плюрипотентных клетках (линия, описанная ранее как линия с одной неактивной Х-хромосомой, hESM04 [11]) выявлено и второе пороговое значение о12/о12 = 3. Таким образом, все
клетки со значением о12/о12 > 3 для Х-хромосом считались обладателями одной компактной и одной ре-лаксированной хромосомной территории. На основе этого анализа были получены данные, приведенные в табл. 2 ниже. В каждой линии клеток анализировали от 50 до 100 ядер.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика статуса инактивации Х-хромосомы в ЭСК и ИПСК человека
Статус Х-хромосом во всех использованных в работе линиях клеток был охарактеризован ранее при помощи обычных критериев: наличия/отсутствия облака ХКТ-РНК в интерфазном ядре, наличия/отсутствия фокального окрашивания антителами к Н3К27те3 в интерфазных ядрах; мо-ноаллельной/биаллельной экспрессии гена POLA1. Данные, в том числе опубликованные нами ранее для некоторых линий [8, 11], обобщены в табл. 1. Основным и определяющим критерием состояния Х-хромосом была моноаллельная или биаллельная экспрессия гена POLA1.
Как видно из табл. 1, не полностью репрограм-мированные, так называемые несовершенные клоны ИПСК iPS-6 и iPS-7 проявляли все признаки инактивированной Х-хромосомы, как и исходные соматические клетки: облако XIST-РНК и фокус H3K27me3 в интерфазном ядре; в них наблюдалась моноаллельная экспрессия гена POLA1. Полностью репрограммированный клон iPS-12 проявлял признаки частичной реактивации по наличию H3K4me2 на обеих Х-хромосомах [8], но имел моноаллельную экспрессию POLA1. Линия ЭСК hESM01 содержала транскрипционно неактивную Х, но утратила такие маркеры инактивации, как облако XIST-РНК и фокус H3K27me3 в интерфазных ядрах.
Линию ИПСК MA-02 и линию ЭСК HUES 9 по всем этим критериям можно отнести к линиям с активной Х-хромосомой. В этих линиях не выявлено XIST-облака методом РНК-FISH; фокального окрашивания антителами к H3K27me3 в интерфазных ядрах; наблюдалось окрашивание антителами к маркеру активного хроматина H3K4me2 на обеих Х-хромосомах и биаллельная экспрессия гена POLA1. Следует отметить, что реактивация Х-хромосомы при репрограммировании клеток человека - довольно редкое событие. Большинство клонов, получаемых при обычном репрограммировании, имеют одну Х-хромосому в неактивном состоянии [9, 18 и собственные наблюдения].
Во всех приведенных в табл. 1 линиях ЭСК и ИПСК проведен анализ времени репликации Х-хромосом.
Время репликации Х-хромосом
Известно, что для гетерохроматина свойственна поздняя репликация, а именно, репликация в поздней S-фазе клеточного цикла после репликации эухроматина. В частности, это характерно и для факультативного гетерохроматина инактивированной Х-хромосомы [2]. Для определения времени репликации Х-хромосом в S-фазе клеточного цикла был проведен эксперимент по включению BrdU в ново-синтезируемые цепи ДНК при репликации.
После фиксации клеток и приготовления препаратов метафазных хромосом включенный BrdU выявляли с помощью иммуноцитохимического окрашивания антителами против BrdU.
Мы получили картины поздней репликации Х-хромосомы во всех линиях с инактивированной Х-хромосомой, как в соматических клетках HUVEC, так и в линиях ЭСК (hESM01 и hESM04) и ИПСК (iPS-6, iPS-7, iPS-12). На рис. 1 показаны два типа включения BrdU в цепи ДНК, наблюдаемые при поздней репликации Х-хромосомы. В первом варианте наблюдается включение BrdU во все хромосо-
Л
Рис. 1. Определение времени репликации Х-хромосом в ПСК человека. Хромосомы Х обозначены буквами и указаны стрелками. Л, Б - Репрезентативные фотографии асинхронной репликации гомологичных Х-хромосом. Репликация неактивной Х-хромосомы в поздней S-фазе клеточного цикла. Показаны метафазы клеток линии hESM04. Л - BrdU (красный, левая фотография) включен во все хромосомы, кроме одной. На правой фотографии показаны результаты гибридизации этой же метафазы с пробой на Х-хромосому (показано зеленым). Хромосомы окрашены синим (DAPI). Б - Включение BrdU (красный, левая фотография) только в одну из хромосом.
На этой же метафазе наблюдается включение BrdU в прицентромерный гетерохроматин. На правой фотографии показано совмещение окрашивания BrdU с окрашиванием DAPI (синий), которое использовалось для идентификации Х-хромосом. В - Репрезентативная фотография синхронной репликации гомологичных Х-хромосом у линий плюрипотентных клеток с двумя активными Х-хромосомами. Показана метафаза ЭСК HUES 9. Включение BrdU (красный, левая фотография) происходит во все хромосомы, нет включения в прицентромерные участки хромосом. На правой фотографии показано совмещение окрашивания BrdU с окрашиванием DAPI (синий), которое использовали для идентификации Х-хромосом
Б
В
Л
В
Б
Г
Кт Ч* _
Хромосома Х Хромосома 8
Рис. 2. Пример двух типов компактизации Х-хромосом у ПСК человека. А, В - ядро с одной обширной и одной компактной территорией Х-хромосомы (на примере линии ЭСК 1^М04); Б,
Г - две обширные релак-сированные территории Х-хромосомы (на примере линии ИПСК МА-02). Территории Х-хромосом окрашены зеленым цветом; хромосомы 8 - красным, тотальная ДНК ядра - синим цветом ^АР1); зелеными стрелками показаны Х-хромосомы, красными - хромосомы 8.
мы, кроме одной из Х-хромосом (рис. 1А). Во втором варианте BrdU включается в прицентромерный гетерохроматин, а также в р- и q-плечи одной из хромосом метафазной пластинки - одной из Х-хромосом, согласно результатам FISH или инвертированного DAPI-бэндинга (рис. 1Б). Одновременная репликация с прицентромерным конститутивным гетерохроматином подтверждает, что наблюдаемый тип включения BrdU соответствует репликации в поздней S-фазе.
Г омологичные Х-хромосомы в линиях ПСК с двумя активными Х-хромосомами (HUES 9, MA-02) реплицируются почти синхронно, поэтому гомологичные хромосомы практически неотличимы друг от друга по характеру включения BrdU. На рис. 1В показан пример синхронной репликации Х-хромосом.
Далее было решено оценить корреляцию между временем репликации Х-хромосом и степенью ком-пактизации их хромосомных территорий.
Степень компактизации Х-хромосом в интерфазном ядре не всегда коррелирует со статусом Х-хромосом в плюрипотентных стволовых клетках человека и временем их репликации
Для определения степени конденсации хроматина мы сравнивали между собой территории двух Х-хромосом одного ядра на плоских препаратах интерфазных ядер. Данный метод приготовления препаратов уже использовали ранее для исследования территорий хромосом [19]. В качестве контроля рас-
пределения хромосом на препарате мы использовали одновременное сравнение с аутосомой (хромосомой 8). Аутосомы в клетках млекопитающих находятся в одинаковом эпигенетическом состоянии, и размеры их территорий не различаются. Сравнение территорий хромосом осуществляли с помощью алгоритма (см. «Экспериментальную часть») и сравнения значений дисперсий для каждой индивидуальной хромосомы. Степень компактизации Х-хромосомных территорий внутри одного ядра сравнивали с использованием ядер, на которых отчетливо выявляли две несмыкающиеся зоны гибридизации с ДНК-пробой к Х-хромосоме. Ядра плюрипотентных клеток распределялись на два типа без промежуточных форм: (1) ядра с одной обширной территорией Х-хромосомы с низкой плотностью окраски и одной компактной территорией с высокой плотностью окраски (рис. 2A,В); (2) ядра с двумя обширными территориями Х-хромосом с одинаковой плотностью окраски (рис. 2Б,Г). Результаты анализа распределения ядер плюрипотент-ных клеток по степени компактизации Х-хромосом представлены на рис. 3. Показано соотношение (%) компактных и релаксированных территорий во всех линиях клеток. Хромосомные территории в плюрипо-тентных клетках с двумя активными Х-хромосомами в подавляющем большинстве просчитанных ядер (более 90%) были релаксированными.
В линиях клеток, где процесс репрограммирования не завершился полностью, т.е. в клонах, не являющихся истинно плюрипотентными (iPS-6
% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
ОО оо • о
0 00 ш 3
1
о
ЗЕ
00
о
о
I
<
:£
00
О-
00
О-
00
о.
и
ш
>
I
00
о.
-ч-
о
00
00
о.
Рис. 3. Процентное соотношение ядер с разной степенью компактизации хромосомных территорий в ПСК человека и линии эндотелиальных клеток HUVEC. ОО - ядра, несущие две де-компактизированные (релак-сированные) хромосомные территории(обозначены на диаграмме зеленым цветом); • О - ядра, несущие одну компактную и одну релаксированную хромосомную территорию (синий цвет); оо - «соматический» тип компактизации с ядрами, несущими две небольшие компактные хромосомные территории (красный цвет).
и iPS-7), наблюдался также третий тип состояния конденсированности хроматина. В этом случае две территории Х-хромосом слабо различаются по размеру и обе имеют большую степень конденсации хроматина, так же как и аутосомы в этих клетках и в преобладающей части клеток НЦУ'ЕС, которые и были изначально объектом репрограммирования (рис. 3). Следует отметить, что в некоторых работах по изучению организации территорий Х-хромосом в соматических клетках также не выявлено различий в объеме территорий активной и неактивной Х-хромосомы [2, 20, 21]. Различие между соматическими и плюрипотентными клетками может объясняться значительно большей пластичностью ядерного хроматина в плюрипотентных клетках по сравнению с более компактным хроматином соматических клеток [1, 22]. Интересно отметить, что в процессе культивирования клона ИПСК iPS-6 с 5-го по 12-й пассаж клетки утратили хромосомную территорию «соматического» типа, и на более позднем пассаже большинство клеток имели одну компактную и одну релаксированную территорию Х-хромосом.
Результаты сопоставления степени компактиза-ции Х-хромосом и времени их репликации представлены в табл. 2.
Большинство ядер в клетках линии hЕSM04 имели одну компактную и одну релаксированную территорию Х-хромосомы (рис. 2), что сопровождалось выраженной асинхронной репликацией Х-хромосом. Тем не менее корреляции между поздней асинхронной репликацией и компактностью хромосомной тер-
ритории Хi не наблюдалось в других линиях плюри-потентных клеток.
Как видно из табл. 2, несмотря на то, что линия ЭСК hЕSM01 имела обе Х-хромосомные территории в релаксированном состоянии, репликация Х-хромосом в этой линии происходила асинхронно, с репликацией одной из Х-хромосом в поздней S-фазе. У клона ИПСК iPS-12 половина ядер имела две одинаковые Х-хромосомные территории в ре-лаксированном состоянии, тем не менее, несмотря на частичные цитологические признаки реактивации (наличие Н3К4те2, табл. 1), одна из Х-хромосом реплицировалась в поздней S-фазе во всех проанализированных клетках ^ > 20) и имела статус Х1
Линии ЭСК HUЕS 9 и ИПСК МА-02, у которых гомологичные Х-хромосомы реплицировались практически синхронно и ни одна из Х-хромосом не характеризовалась поздней репликацией, имели две релаксированные территории Х-хромосом (во всех ядрах в случае HUЕS 9 и в подавляющем большинстве ядер МА-02) (табл. 2).
Таким образом, суммируя данные, полученные на всех использованных в работе клеточных линиях, можно предположить, что статус Хi может сохраняться в плюрипотентных клетках без формирования классического «тельца Барра», т.е. компактно упакованной хромосомной территории. Тем не менее активный статус обеих Х-хромосом и переход к синхронной репликации при репрограммировании требуют нахождения обеих Х-хромосом в ре-лаксированном состоянии в интерфазном ядре. При репрограммировании до плюрипотентного со-
Таблица 2. Сравнение компактизации хромосомных территорий Х-хромосом в интерфазном ядре и времени их репликации
Линия клеток • О, %* oo, %* ОО, %* Репликация
HUES 9 0 100 ^нхронная не поздняя
hESM04 93 7 Асинхронная, поздняя у Xi
hESM01 10 90 То же
HUVEC S2 37 11 «
iPS-7 48 28 24 «
iPS-6 п. 5 77 2 21 «
iPS-6 п. 12 73 27 «
iPS-12 S0 S0 «
iPS MA-02 3 97 ^нхронная не поздняя
*^О - ядра, несущие одну компактную и одну релаксированную хромосомные территории; оо - ядра, несущие две небольшие компактные хромосомные территории («соматический» тип компактизации); ОО - ядра, несущие две декомпактизированные (релаксированные) хромосомные территории.
стояния в тех случаях, когда происходит частичная или полная реактивация Х^ релаксация хромосомной территории происходит, скорее всего, раньше, чем исчезновение основных марок гетерохроматина Н3К27те3 и Н3К9те3, как видно на примере клона ИПСК iPS-12.
Ранее было показано, что длительное культивирование «несовершенных» ИПСК часто ведет к завершению репрограммирования, приобретению плюрипотентного состояния и потере характеристик соматических клеток. Изменение компактизации территорий Х-хромосомы, которая произошла в процессе культивирования клона ИПСК iPS-6, показывает, что этот параметр может быть дополнительным маркером репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В наших исследованиях показано, что ПСК человека с инактивированной Х-хромосомой могут иметь как релаксированную, так и компактную хромо-
сомную территорию неактивной Х-хромосомы. Линии ЭСК, в которых обе Х-хромосомы активны, или линии ИПСК, в которых Х-хромосома реактивировалась в процессе репрограммирования, имеют декомпактизованные хромосомные территории Х в интерфазном ядре.
Таким образом, можно заключить, что в ПСК человека существует механизм поддержания инактивированного состояния Х-хромосомы, который не зависит напрямую от степени компактизации ее хромосомной территории в интерфазном ядре. Поздняя репликация инактивированной Х-хромосомы также не зависит от степени ее компактизации.
С другой стороны, для перехода к активному состоянию Х-хромосомы при ее реактивации и синхронной репликации необходима декомпактизация территории Х-хромосомы.
Работа поддержана Программой Правительства Москвы и РФФИ (гранты № 11-04-01212-а и 10-04-01736-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bartova E., Galiova G., Krejci J., Harnicarova A., Strasak L., Kozubek S. // Dev. Dyn. 2008. V. 237. P. 3690-702.
2. Visser A.E., Eils R., Jauch A., Little G., Bakker P.J., Cremer Т., Aten J.A. // Exp. Cell Res. 1998. V. 243. P. 398-407.
3. Ryba Т., Hiratani I., Lu J., Itoh M., Kulik M., Zhang J., Schulz T.C., Robins A.J., Dalton S., Gilbert D.M. // Genome Res. 2010. V. 20. P. 761-770.
4. Plath K., Mlynarczyk-Evans S., Nusinow D.A., Panning B. // Annu. Rev. Genet. 2002. V. 36. P. 233-278.
5. Hoffman L.M., Hall L., Batten J.L., Young H., Pardasani D., Baetge E.E., Lawrence J., Carpenter M.K. // Stem Cells. 2005. V. 23. P. 1468-1478.
6. Silva S.S., Rowntree R.K., Mekhoubad S., Lee J.T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 4820-4825.
7. Shen Y., Matsuno Y., Fouse S.D., Rao N., Root S., Xu R., Pel-
legrini M., Riggs A.D., Fan G. // Proc. Natl. Acad. Sci. uSA. 2008. V. 105. P. 4709-4714.
8. Lagarkova M.A., Shutova M.V., Bogomazova A.N., Vassina E.M., Glazov E.A., Zhang P., Rizvanov A.A., Chestkov I.V., Kiselev S.L. // Cell Cycle. 2010. V. 9. P. 937-946.
9. Tchieu J., Kuoy E., Chin M.H., Trinh H., Patterson M., Sherman S.P., Aimiuwu O., Lindgren A., Hakimian S., Zack J.A., et al. // Cell Stem Cell. 2010. V. 7. P. 329-342.
10. Marchetto M.C., Carromeu C., Acab A., Yu D., Yeo G.W.,
Mu Y., Chen G., Gage F.H., Muotri A.R. // Cell. 2010. V. 143.
P. 527-539.
11. Lagarkova M.A., Eremeev A.V., Svetlakov A.V., Rubtsov N.B., Kiselev S.L. // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2010. V. 46. P. 284-293.
12. Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J., Atienza J., Witmyer J., Zucker J.P., Wang S., Morton C.C., McMahon A.P., Powers D., et al. // N. Engl. J. Med. 2004. V. 350. P. 1353-1356.
13. Baudin B., Bruneel A., Bosselut N., Vaubourdolle M. // Nat. Protoc. 2007. V. 2. P. 481-485.
14. Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006. V. 126. P. 663-676.
15. Shutova M.V., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Kiselev
S.L. // Acta Naturae. 2009. V. 1. № 2. P. 91-92.
16. Shutova M.V., Chestkov I.V., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Kiselev S.L. // Springer Protocols Handbook ser. 2012. P 133-149.
17. Bacher C.P., Guggiari M., Brors B., Augui S., Clerc P., Avner P., Eils R., Heard E. // Nat. Cell Biol. 2006. V. 8. P. 293-299.
18. Bruck T., Benvenisty N. // Stem Cell Res. 2011. V. 6. P 187193.
19. Federico C., Cantarella C.D., Di Mare P., Tosi S., Saccone S. // Chromosoma. 2008. V. 117. P 399—410.
20. Eils R., Dietzel S., Bertin E., Schröck E., Speicher M.R., Ried T., Robert-Nicoud M., Cremer C., Cremer T. // Cell Biol. 1996. V. 135. P. 1427-1440.
21. Teller K., Illner D., Thamm S., Casas-Delucchi C.S., Versteeg R., Indemans M., Cremer T., Cremer M. // Nucleus. 2011. V. 2.
P. 465-477.
22. Meshorer E., Yellajoshula D., George E., Scambler PJ., Brown D.T., Misteli T. // Dev. Cell. 2006. V. 10. P. 105-116.
