CC BY
0
https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-53-65
(«О
BY 4.0
ПОВЫШЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ß2-МИКРОГЛОБУЛИНУ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ КАК АЛЬТЕРНАТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДАХ АНАЛИЗА
Н.Н. Каркищенко1, В.А. Езерский2, О.Б. Жукова2, Е.М. Колоскова2*, Н.В. Петрова1
1 ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1
2 Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста» 249013, Российская Федерация, Калужская обл., Боровск, п. Институт
Высокоспецифичные реагенты — белки и антитела к ним — необходимые компоненты систем верификации эффективности функционирования трансгенных/нокаутных животных биомоделей. В частности, идентификация р2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных по гену р2-микроглобулина мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России, является важнейшим этапом их паспортизации. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных Р2-микроглобулина мыши и человека (mß2mg и hß2mg), белки выделены и очищены. На следующем этапе работы получены аффинные сорбенты с иммобилизованными mß2mg и hß2mg. Для повышения видовой специфичности сыворотки «кролик-анти-hß2mg» были истощены против реком-бинантного белка mß2mg, и, напротив, «кролик-анти-mß2mg» истощали против рекомбинантного белка hß2mg. Высокоспецифичные антитела были очищены из истощенных сывороток на аффинных сорбентах. Методами дот- и вестерн-блоттинга на примере истощенных и аффинно-очищенных антител «кролик-анти-hß2mg» было показано значительное повышение их специфичности относительно hß2mg.
Ключевые слова: рекомбинантный белок, ß2-микроглобулин мыши и человека, антиген, антитела, истощение антител, иммунизация
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: государственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.
Для цитирования: Каркищенко Н.Н., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Петрова Н.В. Повышение специфичности поликлональных антител к ß2-микроглобулину человека и мыши как альтернатива использованию моноклональных антител в иммунологических методах анализа. Биомедицина. 2024;20(2):53-65. https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-53-65
Поступила 20.03.2024
Принята после доработки 25.04.2024
Опубликована 10.06.2024
INCREASING THE SPECIFICITY OF POLYCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN AND MOUSE ^-MICROGLOBULIN AS AN ALTERNATIVE TO THE USE OF MONOCLONAL ANTIBODIES IN IMMUNOLOGICAL ANALYSIS
Nikolay N. Karkischenko1, Vadim A. Ezerskiy2, Olga B. Zhukova2, Elena M. Koloskova2*, Nataliya V. Petrova1
1 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1
2All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst 249013, Russian Federation, Kaluga Region, Borovsk, Institut Village
Highly specific reagents, i.e., proteins and antibodies to them, are the necessary components of systems for verifying the effectiveness of transgenic/knockout animal biomodels. In particular, the identification of mouse and human p2-microglobulin in the protein fractions of organs and tissues of transgenic and P2m knockout mice of several HLA lines, which have been created in recent years at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the FMBA of Russia, is the most important stage of their certification. At the first stage of our research, E. coli producing strains of recombinant mouse and human p2-micro-globulin (mp2mg and hp2mg) were obtained, the proteins were isolated and purified. At the next stage of the work, affine sorbents with immobilized mp2mg and hp2mg were obtained. To increase the species specificity of the serum, "rabbit-anti-hp2mg" were depleted against the recombinant protein mp2mg, and, conversely, "rabbit-anti-mp2mg" were depleted against the recombinant protein hp2mg. Highly specific antibodies were purified from depleted sera using affinity sorbents. Using dot- and western-blotting methods on the example of depleted and affinity-purified rabbit-anti-hp2mg antibodies, a significant increase in their specificity relative to hp2mg was shown.
Keywords: recombinant protein, mouse and human p2-microglobulin, antigen, antibodies, antibody depletion, immunization
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Funding: the research topic "Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex" (code: "Transknockout-2024") of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of Russia.
For citation: Karkischenko N.N., Ezerskiy V.A., Zhukova O.B., Koloskova E.M., Petrova N.V. Increasing, the Specificity of Polyclonal Antibodies to Human and Mouse P2-Microglobulin as an Alternative to the Use of Monoclonal Antibodies in Immunological Analysis. JournalBiomed. 2024;20(2):53-65. https://doi. org/10.33647/2074-5982-20-2-53-65
Submitted 20.03.2024 Revised 25.04.2024 Published 10.06.2024
Введение
Трансгенные гуманизированные живот- целевого белка в разных органах и тканях,
ные, в т.ч. и с нокаутом собственных генов, доказательство отсутствия синтеза белка находят все большее применение для био- (или его нефункциональность) нокаутиро-медицинских исследований, фармакологи- ванного гена невозможна без высокоспе-ческих испытаний. Доказательная база ин- цифичных реагентов — белков-антигенов
теграции трансгена, детекция трансляции и антител к ним.
В последние годы в НЦБМТ ФМБА России были созданы несколько HLA-линий трансгенных и нокаутных по гену ß2-микроглобулина (ß2mg) мышей [1-5], в связи с чем поставлена задача идентификации ß2mg мыши и человека (mß2mg и hß2mg соответственно) не только на уровне ДНК-мРНК, но и в белковых фракциях органов и тканей животных полученных линий. Аминокислотный анализ mß2mg и hß2mg показал 32% несовпадений у белков-предшественников (119 аминокислот (АК), из них 20 АК — сигнальный пептид). Это дает основания полагать, что спектры поликлональных антител, вырабатываемых на mß2mg и hß2mg, как антигены при иммунизации животных будут иметь отличия благодаря несовпадающим эпитопам: в результате технологических манипуляций появляется возможность получения видоспе-цифических антител к ß2mg.
На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных mß2mg и hß2mg. Нуклео-тидные последовательности генов были адаптированы для синтеза в бактериальной системе, рекомбинантные белки, mß2mg и hß2mg, очищены и наработаны в количествах, необходимых для получения аффинных сорбентов и иммунизации животных.
ß2mg представляет собой белок с молекулярной массой 11,8 кДа, состоящий из 99 аминокислотных остатков (119 АК — вместе с сигнальным белком). Он синтезируется во всех ядросодержащих клетках организма и играет важную роль в образовании комплекса MHC I класса (МНС-I), клеточном иммунитете. Тяжелая цепь MHC-I представлена доменами а1, а2 (образующими антигенсвязывающую часть комплекса) и а3. Домен а3 имеет иммуногло-булиновую укладку, такую же как соседний ß2mg, который синтезируется отдельно и стабилизирует комплекс. Химерная молекула, продукт трансгена, использованного
при получении наших трансгенных гуманизированных линий мышей, имеет натив-ный, мышиный домен а3, человеческие домены а1, а2 а также hp2mg, связанный с а1 глицин-сериновым линкером [2, 3].
Иммуноглобулинподобные рецепторы киллерных клеток (КЖ), экспрессирую-щиеся на мембране цитотоксических клеток, регулируют функцию уничтожения зараженных или трансформированных клеток путем взаимодействия с комплексами МНС-1, экспрессирующихся на всех типах клеток с ядрами. Конформационные изменения, происходящие в дистальной, пептидсвязывающей области молекулы МНС-1 при замене mp2mg на hp2mg, влияют на способность КШ. взаимодействовать с МНС-1 [7]. Сохранение топологической структуры, присущей пептидпрезентирую-щей части НЬА-молекулы, обеспечивается в химерных молекулах наших трансгенных мышей hp2mg в их составе.
Если на поверхности клеток будут присутствовать оба варианта молекул, определить это можно с помощью вестерн-блот-гибридизации. С использованием антител (АТ), специфичных к молекулам НЬА (например, моноклональных антител аЬ23755 или аЬ70328, «АЬсат», США), можно обнаружить присутствие химерных молекул (молекул, содержащих тяжелую цепь HLA класса 1) на поверхности клеток. С помощью поликлональных АТ к молекулам P2mg при наличии кросс-реактивности способны обнаруживаться как химерная молекула (56 кДа), так и нативный mp2mg (12 кДа). Если использовать АТ, специфичные к а3-домену комплекса Н2, возможно определить присутствие/отсутствие как на-тивных молекул Н2, так и химерных молекул b2m-HLA-H2, и отличить их друг от друга за счёт разницы в молекулярной массе (44 и 56 кДа) (рис. 1).
Если применение поликлональных АТ к mp2mg или hp2mg в методе вестерн-блот-тинга дает нам однозначный ответ о нали-
Рис. 1. Варианты вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител при детекции белка P2mg в органах и тканях мышей дикого типа и HLA-ТГ линий: 1) мыши дикого типа (B2m+) — полоса 12 кДа (несли-тый mb2mg); 2) HLA/B2m+ — две полосы — 12 кДа (mb2mg), 56 кДа — слитый hb2mg в составе химерного белка; 3) HLA/B2m' — 56 кДа — слитый hb2mg в составе химерного белка.
Fig. 1. Western blotting variants using polyclonal antibodies for detection ofP2mg protein in organs and tissues of wildtype mice and HLA-TG lines: 1) wild-type mice (B2m+) — a 12 kDa band (not fused mb2mg); 2)HLA/ B2m+ — two bands — 12 kDa (mb2mg), 56 kDa — fused hb2mg as part of a chimeric protein; 3) HLA/ B2m' — 56 kDa — fused hb2mg as part of a chimeric protein.
чии/отсутствии химерного белка и mP2mg, для более тонких иммунных методов — иммуногистихимии, иммуноцитохимии, не требующих выделения белковой фракции и разделения молекул по размерам, необходимо использование более специфичных антител, позволяющих считывать присутствие mP2mg и/или hp2mg в месте их «прописки».
Целью нашей работы было получение на основе поликлональных кроличьих АТ, кросс-реактивных к mP2mg и hp2mg, видо-специфичных антител, по эффективности приближенным к моноклональным. Нами ранее были получены штаммы-продуценты рекомбинантных mP2mg и hp2mg, рекомби-нантные белки (РБ) наработаны и очищены. Для достижения новой поставленной цели требовалось выполнить следующие задачи:
1. Иммунизировать кроликов РБ mP2mg и hp2mg, получить антисыворотки с по-ликлональными АТ «кролик-анти-hb2mg» и «кролик-анти-mb2mg».
56
2. Получить сорбенты с иммобилизованными РБ mP2mg и hp2mg.
3. Получить кроличьи антитела, специфичные к hp2mg (истощенные против эпи-топов mP2mg).
4. Получить кроличьи антитела, специфичные к mP2mg (истощенные против эпи-топов hp2mg).
Материалы и методы
Эксперимент проведен на 4 кроликах калифорнийской породы в возрасте 8-10 мес., массой 4-5 кг. В исследованиях придерживались требований, утвержденных протоколами исследования и стандартными операционными процедурами ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Маркировка клетки содержала данные о дате начала эксперимента, пол и номер животного. Кроликов маркировали с помощью ушных выщипов.
Содержание животных. Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с требованиями ГОСТ Р от 02.12.2009 53434-2009 «Принципы
надлежащей лабораторной практики (GLP)». Кролики были размещены в индивидуальных клетках. Брикетированные комбикорма для лабораторных животных давались ad libitum в кормушки. Данные о составе и качестве корма от производителя хранятся в документации лаборатории. Животным давалась очищенная вода ad libitum.
Подготовка антигенов для иммунизации. Антигены для иммунизации: рекомби-нантные белки mß2mg и hß2mg, продукты штаммов-продуцентов E. coli BL21 (DE3): E. coli BL21/pET-28/mß2mg и E. coli BL21/ pET-28/hß2mg (отражены в предыдущей публикации). Для иммунизации кроликов брали объединенные фракции рекомбинант-ного белка, снятые с колонки Ni-сефароза. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд. Для получения эмульсии 1 мг антигена доводили до объема 1,5 мл стерильным физ. р-ром и смешивали с 4,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в 50 мл пробирках типа фалкон. С помощью ультразвукового гомогенизатора МЭФ 93.Т получали стабильную эмульсию обработкой ультразвуком 5 раз по 20 сек. с охлаждением на снегу между циклами.
Методика проведения инъекций животным. Кроликов иммунизировали вну-трикожно, инъекции осуществляли в 5060 точек вдоль хребта с обеих сторон, вводя препарат в объеме 50-100 мкл на точку. Каждым антигеном (АГ) иммунизировали по два кролика.
Забор крови у экспериментальных животных. Забор крови осуществляли у кроликов из краевой ушной вены на 62, 82 и 103-й день после инъекции, при убое животных.
Получение и хранение антисывороток. Полученную кровь инкубировали 1 ч при 37°С, далее выдерживали на холоде при 4°С в течение ночи и отделяли образовавшуюся сыворотку центрифугированием при 3000 g. К сывороткам добавляли насыщенный раствор сульфата аммония
(1:1 в объемном соотношении), получали сульфатный осадок (СО). Аликвоты сывороток по 200 мкл хранили при -20°С, СО — при 2-8°С.
Очистку рекомбинантных белков от компонентов буфера С (20 мМ Трис-НС1, 0,5 М №С1, 8 М мочевина, 50-500 мМ имидазол, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, рН=7,9) проводили диализом против фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (20 мМ NaH2PO4, 150 мМ №С1, рН=7,4) или 0,1 М N£1-бикарбонатного буфера, рН=9,5, с использованием целлюлозных мембранных мешков с порами 12000 Да. Диализ проводили при 4-8°С, при постоянном перемешивании буфера в емкости, на протяжении 14-24 ч. Буфер меняли дважды. Раствор РБ концентрировали, помещая диализный мешок на сухой Sephadex G-200.
Получение сорбента с иммобилизованным РБ. К 4 мл промытой водой се-фарозы-^-4В добавляли 8 мл 0,7 М пе-риодата натрия. Суспензию в течение 1 ч мягко перемешивали при комнатной температуре, добавляли 4 мл 2М этиленгликоля. Через 1 ч сорбент последовательно промывали водой, 0,1 М бикарбонатным буфером, рН=9,5, вносили 4 мл концентрированного после диализа РБ (hp2mg или mp2mg, 1520 мг/мл). Реакцию продолжали при 4°С при мягком перемешивании в течение 48 ч. Сорбент с конъюгированным рекомби-нантным белком промывали 0,1 М бикар-бонатным буфером, рН=9,5, затем ФСБ. Оставшиеся реакционноспособные группы инактивировали р-ром боргидрида натрия в ФСБ (2 мг/мл). Реакцию продолжали при 4°С при мягком перемешивании в течение 1 ч. Сорбент промывали ФСБ, затем 5 мл 100 мМ лимонной кислоты и ФСБ с 0,1% азидом натрия. Готовый сорбент хранили при 4-8°С до использования.
Получение антивидовых конъюга-тов, меченых пероксидазой хрена (ПХ). Антитела «коза-анти-кролик» были выделены из полученных ранее антисывороток
аффинной очисткой на сорбенте сефаро-за-IgG кролика. Антитела конъюгирова-ли с ПХ по методу Nakane [8] с нашими модификациями. Приготовленный конъю-гат хранили в 33% глицерине в трис-соле-вом буфере (ТСБ) в конечной концентрации 1 мг/мл при температуре -18°С. В предварительных экспериментах оценивали рабочий титр конъюгата, готовили рабочий концентрат конъюгата в «Иммуностаб плюс» производства ЗАО «Иммунотех» (Россия). Хранили при 4°С.
ИФА-анализ сывороток. В работе использовались: комплект оборудования для хроматографии производства фирмы LKB, вертикальный фотометр «Униплан» производства ЗАО «Пикон», 96-луночные полистироловые планшеты «Dynatech», ProteinA Sepharose Fast Flow «Pharmacia Biotech», 3,3\5,5'-тетраметилбензидин ди-гидрохлорид (ТМБ) «Amresko».
Антиген (РБ hp2mg) сорбировали в концентрации 5 мкг/мл в посадочном буфере (100 мМ натрий бикарбонат -ный буфер, рН=9,5), отмывали с этим же буфером и деионизированной водой. Блокировку проводили блокирующим раствором ООО «Иммункулус» (Россия), по окончанию инкубации планшеты отмывали отмывочным буфером и деиони-зированной водой.
Для ИФА-анализа использовали сыворотки в разведениях, кратных двум, начиная с разведения в 4000 раз и заканчивая разведением в 512000 раз. Планшет с сыворотками после окончания инкубации отмывали, вносили конъюгат ПХ с антителами козы против иммуноглобулинов кролика (рабочее разведение 5000 раз), инкубировали при 37°С 1,5 ч, после чего планшет отмывали и вносили субстратный буфер (ТМБ с перекисью водорода) для проявления реакции. Через 15 мин при появлении голубой окраски реакцию останавливали внесением стоп-раствора. Измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм
на фотометре вертикального сканирования сразу после остановки реакции.
Истощение антисывороток. Ресуспен-дированный сульфатный осадок сыворотки «кролик-анти^2т^> центрифугировали при 10000 об./мин 10 мин при 10°С. Осадок растворяли в 20 мл трис-солевого буфера с азидом натрия (ТСБ-азид: 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН=7,4, 0,1% азид натрия) и диализовали против ТСБ-азид в течение ночи при 4-8°С. Содержимое диализного мешка центрифугировали, для избавления от не растворившихся частиц супернатант пропускали через сорбент сефароза-СЬ4В/ mb2mg, предварительно уравновешенный буфером ТСБ-азид. Сорбент промывали ТСБ-азидом до выхода на базовую линию, проскок собирали. Связавшиеся антитела снимали 0,1 М Na-цитратным буфером с рН=2,8, затем ТСБ-азидом. Процедуру повторяли еще 3 раза, последовательно избавляя антисыворотку «кролик-анти^2т^> от перекрестно реагирующих АТ с mß2mg и АТ к остаточным белкам Е. coli. На последнем цикле истощения сорбент смешивали во флаконе с собранным проскоком и сорбцию продолжали при мягком перемешивании в течение ночи при 4°С. Сорбент вносили в колонку и проводили последний цикл истощения антисыворотки, как описано выше.
Для финальной очистки и концентрирования белка проводили аффинную хроматографию истощенной сыворотки «кролик-анти-hß2mg» на колонке сефароза-CL-4B-hß2mg. Сорбированные АТ снимали 0,1 М Na-цитратным буфером с рН=2,8. Фракцию, содержащую АТ, диализовали против ФСБ-азида, дважды меняя буфер. Содержимое диализного мешка центрифугировали, определяли концентрацию белка по ОП при Х280. Раствор АТ «кролик-анти-hß2mg» концентрировали с использованием колонок с размером пор 30 кДа до 2,8 мг/мл.
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), дот-гибридизация, вестерн-блот. Лейкоциты крови человека и мыши
лизировали в 2% SDS, инкубировали 5 мин при 95°С и центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об./мин. К образцам РБ и лейкоцитов, нормализованных по содержанию белка, добавляли х2 буфер для образцов (4% SDS, 10% 2-меркапто-этанол, 20% глицерин, 0,125 М Трис-HCl, рН=6,8, бромфеноловый синий 0,1%). Прогревали при 95°С.
Для дот-блоттинга подготовленные образцы r-hß2mg и r-mß2mg в количестве 1,5 мкл в виде пятен наносили на нитроцеллюлоз-ную (НЦ) мембрану (Hybond-C, «Amersham Biosciences», США) с 5-кратными разведениями 1хБО. Проводили блокировку мембраны, отмывку, посадку первых истощенных АТ в разведении 1:1000, отмывку, посадку вторых АТ-ПХ, отмывку и проявку с использованием в качестве хромогенов хлорнафто-ла (ХН) и диаминобензидина (ДАБ).
ПААГ-SDS электрофорез проводили в 12,5% — разделяющем и 4% — концентрирующем геле. В лунку концентрирующего геля вносили 15 мкл подготовленного образца. Образцы разделяли в трис-глици-новом буфере для электрофореза белков (25 мМ Tris-OH, 250 мМ глицин, 0,1% SDS). Для оценки размера белков использовали маркеры молекулярной массы Precision Plus Protein Unstained, 10-250 кДа («BioRad», США). Гель после электропереноса белков окрашивали (0,125% кумасси R250; уксусная кислота 10%; метанол 50%), последовательно отмывали (50% метанол, 10% уксусная кислота и 5% метанол, 7% уксусная кислота).
После проведения электрофореза проводили полусухой перенос белков на НЦ мембрану при постоянном напряжении 25 В, продолжительностью 30 мин. Буфер для переноса — 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% v/v метанол, рН=8,3). Половину мембраны обрабатывали блокирующим р-ром, содержащим поливинилпирролидон (ООО «МБФ», Россия), вторую половину — 1% BSA в ФСБ. Инкубировали 1 ч при комнат-
ной температуре. Мембрану отмывали 2 раза по 5-10 мин в ФСБ; 0,05% Tween 20; 0,1% азид натрия (^раствор, отмывочный раствор).
В качестве первичных АТ использовали сульфатные осадки сывороток иммунизированных кроликов в разведении 1:1000. Отмывали мембрану 3 раза по 10 мин W-раствором. Инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с вторичными АТ «коза-анти-кролик-ПХ» в разведении 1:2000-1:5000. Мембрану отмывали. Проявляли с использованием 4-хлор-1-на-фтола (ХН) или ДАБ в ТСБ с перекисью водорода.
Результаты и их обсуждение
Получение антисывороток. Для иммунизации кроликов была выбрана схема однократной внутрикожной иммунизации. При проведении подкожных и/или внутри-кожных инъекций в несколько мест инъекции небольших объемов иммуногена/адъю-ванта позволяют распределить иммуноген/ адъювант на большей площади поверхности. АГ медленно всасывается в кровоток, но быстро поступает к иммунным клеткам лимфатической системы. Такая схема иммунизации приводит к более высоким титрам антител, снижает частоту возникновения тяжелой местной воспалительной реакции и абсцессов [9].
В среднем от каждого иммунизированного кролика нами было получено около 120 мл сыворотки или 240 мл сульфатного осадка.
Из результатов ИФА-анализа антисывороток, представленных на рис. 2, следует, что примененная нами схема иммунизации оказалась эффективной: высокий титр антител у кроликов 1 и 2 (антиген hp2mg) сохранялся на протяжении 40 сут после иммунизации до убоя. Однако иммунный ответ у животных был индивидуален. Так, например, у кролика 1 он был практически постоянным, тогда как у кролика 2 постепенно снижался (оба кролика были иммунизированы РБ hp2mg).
Рис. 2. Динамика титров антисывороток иммунизированных r-h@2mg (1, 2) и r-m@2mg (3, 4) кроликов в реакции с иммобилизованным антигеном r-hfi2mg. Обозначения: 1-62 — номер кролика-сутки после иммунизации. Fig. 2. Dynamics of antiserum titers of immunized r-fi2m (1, 2) and rmfi2 mg (3, 4) rabbits in reaction with immobilized r-h@2mg antigen. Designations: 1-62 — rabbit number-day post-immunization.
Неожиданно высокой оказалась видоспе-цифичность неистощенных антисывороток к антигенам: ОП продуктов ИФА-реакции сывороток «кролик-анти-mß2mg» (кролики 3 и 4 на рис. 2) при разведениях 4000-8000 была в 3-4 раза ниже, чем у «кролик-анти-hß2mg».
Истощение антисывороток. АГ для иммунизации кроликов представляет собой РБ hß2mg (mß2mg) с примесями белков штамма-продуцента E. coli (рис. 3). Известно, что продукты контаминации E. coli в реком-бинантных белках влияют на иммунный ответ [6]. При иммунизации кроликов образуются антитела как к рекомбинантным, так и бактериальным белкам. Поскольку сходство РБ hß2mg и mß2mg составляет более 68% (за счет полигистидиновых тэгов, тромби-нового сайта и нескольких дополнительных АК на N-конце), спектры поликлональных АТ для наших АГ будут практически одинаковы. Для повышения видоспецифичности антисыворотки должны пройти существенное истощение: избавиться от большей части идентичных антител (рис. 4).
60
После истощения на сорбенте с mP2mg оставшиеся АТ «кролик-анти-hp2mg» сорбировали на аффинной колонке сефа-роза-hp2mg, что позволяло сконцентрировать раствор антител.
Эффективность процедуры истощения зависит от целого ряда факторов: емкость «аффинной» колонки и первоначальный объем взятой для истощения антисыворотки в нашем случае стали причиной трехкратного цикла «посадка - элюция - промывка».
В результате истощения 160 мл сульфатного осадка антисыворотки «кролик-анти-hp2mg» через стадии «истощение» было получено около 110 мл разбавленного р-ра антител, после аффинной хроматографии на сефарозе-hp2mg сняли 6 мл элюата. В результате диализа и концентрирования было получено 1,4 мл р-ра АТ «кролик-анти-hp2mg» с концентрацией 2,8 мг/мл.
Для зрелого hp2mg (99 АК) с использованием девяти анти-P2mg моноклональных антител были обнаружены две основные антигенные детерминанты: по остаткам 57-63 SKDWSFY и 87-97 LSQPKIVKWDR.
Рис. 3. Схема антигенных детерминант антигенов и их примесей, спектров поликлональных антител антисывороток «кролик-анти-hpimg» и «кролик-анти-mpimg». Е.с.1,2 — условное обозначение белков штамма-продуцента, r-hp2mg и r-mp2mg—РБ, основные белки-антигены. На белках обозначены условные эпитопы, как общие (прямоугольные), так и специфические (кружки). Эпитопы и АТ к ним имеют общую окраску. Fig. 3. Scheme of antigenic determinants of antigens and their impurities, spectra ofpolyclonal antibodies of antisera "rabbit-anti-hp2mg" and "rabbit-anti-mp2mg". E.c.1,2 is the symbol of proteins of the producer strain, r-hp2mg and r-mp2mg — RP, the main proteins are antigens. Conditional epitopes are indicated on the proteins, both general (rectangular) and specific (circles). Epitopes and their AB have a common color.
Рис. 4. Схема истощения против антигенных детерминант mp2mg и белков E. coli: антисыворотка «кролик-анти-hp2mg» подвергается очистке аффинной хроматографией на сорбенте сефароза-mp2mg, на которой, кроме РБ mp2mg, иммобилизованы и контаминирующие бактериальные белки. Антитела к видоспецифичным эпитопам hp2mg не связываются, остаются в проскоке.
Fig. 4. Depletion scheme against antigenic determinants of mp2mg andE. coli proteins: rabbit-anti-hp2mg antiserum is purified by affinity chromatography on sepharose-mp2mg sorbent, on which, in addition to RP mp2mg, contaminating bacterial proteins are immobilized. Antibodies to species-specific epitopes of hp2mg, do not bind, remain in the gap.
Эти последовательности в hp2mg являются основными реактивными антигенными сайтами для моноклональных, а также поликло-нальных антител [10]. Однако при сравнении АК последовательностей зрелого белка hp2mg и mP2mg оказалось, что первый им-муногенный эпитоп не является видоспеци-фичным, у второго эпитопа 5 несовпадений из 11-ти АК, в целом идентичность зрелых белков оказалась 70% по сравнению с 68% предшественника P2mg (рис. 5). Это обстоятельство усложнило задачу: истощение антисывороток оказалось достаточно трудоемким процессом с относительно невысоким выходом высокоспецифичного продукта.
Проверка истощенных против сефароза-mP2mg кроличьих антител к hp2mg. В качестве первых АТ использовали сульфатные осадки «кролик-анти-hp2mg», «кролик-анти-mP2mg» и истощенные сыворотки «кролик-анти-hp2mg», разведенные 1:1000, в качестве вторых антител — «коза-анти-кролик-ПХ» в разведении 1:5000 (рис. 6).
Окраска оставшихся в ПААГ после электропереноса белков массой выше 30 кДа свидетельствует об эффективном переносе из 15% геля белков с массой менее 25 кДа, но не высокомолекулярных белков. Специфичность истощенных АТ «кролик-анти-hp2mg» (рис. 6А) выше, чем у сульфатной антисыворотки (рис. 6В), при этом
предпочтительно полученные истощенные АТ использовать в разведении более чем 1:1000. Антитела сульфатной сыворотки «кролик-анти-mP2mg», с РБ mP2mg реагировали заметно лучше (рис. 6С), что соответствует результатам ИФА (рис. 2).
При проверке белковой фракции лейкоцитов, выделенной из крови человека и мыши истощенные АТ «кролик-анти-hp2mg» применяли в разведении 1:5000, 1:10000, в качестве хромогена использовали ХН, ДАБ и смесь ХН+ДАБ (рис. 7).
В выбранных условиях и разведениях наши истощенные АТ показали высокую видовую специфичность: при равном нанесении белковой фракции лейкоцитов мыши и человека для ПААГ ЭФ (дорожки остаточных белков) перекрестной реакции с P2mg мыши при выбранных разведениях не обнаружено.
Дот-блоттинг, проверка чувствительности. Подготовленные для электрофореза образцы r-hp2mg и r-mP2mg в количестве 1,5 мкл в виде пятен наносили на НЦ мембрану с 5-кратными разведениями 1хБО. Истощенные АТ «кролик-анти-hp2mg» использовали в разведении 1:1000, вторые конъюгированные АТ — в разведении 1:5000. Проявляли разными хромогенами (рис. 8).
Использование ДАВ в качестве хромогена позволило повысить чувствительность детек-
Alignment statistics for match #1
NW Score
397
Query 1
Sb^ct 1
Query 61
Sbict 61
Identities
Positives
Gaps 0/99(0%)
69/99(70%) 03/99(33%) IQRT PKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVS GFH P S DIEVDLLKNGE RIEKVE H S DL S FSKDW 6 0 . . K. . Q........P....P.I.....TQ...PH.. IQM. . . .KK.P___M. .M...... 60
. I .AH.
. T . T.
. К. ASMAE . . T. Y.
99 99
Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей зрелого белка (99 АК) /32-микроглобулина мыши (sbjct) и человека (query). Идентичность — 70%, точки соответствуют совпадениям, красные буквы — отличия. Выделены и подчеркнуты антигенные детерминанты h@2mg, описанные в работе Уильямса и коллег [10]. Сравнения последовательностей выполнены в онлайн приложении BLAST. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Fig. 5. Comparison of amino acid sequences of mature protein (99 amino acids) of mouse fi2-microglobulin (sbjct) and human (query). Identity — 70%, the dots correspond to the matches, the red letters are the differences. The antigenic determinants of hft2mg described in the work of Williams, et al. [10] are highlighted and emphasized. Sequence comparisons are performed in the BLAST online application. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
1 -2
М
В
250 150 100 75 50
25 20
10
1 2 М
1 2 М 1 2 М 1 2 М
А В С 1
Ъа
Г
- £ t
250 № 75 50
25 20
10
Рис. 6. ПААГ и НЦ: слева — электрофорез и вестерн-блоттинг РБ hfi2mg (1) и mfi2mg (2), первые антитела — истощенная сыворотка «кролик-анmи-hв2mg». ПААГ окрашен кумасси после электротрансфера. Справа: А) первые антитела — истощенная сыворотка «кролик-анmи-hв2mg» в разведении 1:1000, В) первые АТ — СО «кролик-анmи-hв2mg», С) первые АТ — СО «кролик-анmи-mв2mg». НЦ — окраска хлорнафтолом. Fig. 6. PAAG and NC: on the left — electrophoresis and Western blotting RB hfi2mg (1) and mfi2mg (2), the first antibodies - depleted serum "rabbit-anti-he2mg". PAAG is painted with coomassie after the electrotransfer. On the right: A) the first antibodies - depleted serum "rabbit-anti-he2mg" in a dilution of1:1000, C) the first AB-SP - "rabbit-anti-hfi2mg", C) the first AB-SP - "rabbit-anti-m^2mg". NC — chlorophthol staining.
1 2 M
1 2 М 1 2\
В С
— —
75 50 37
25 20 15 10
■ I
1 2 M 1 2 M 1
-75
1 W « - 50
-37
t i 25
- -20
2 z
Рис. 7. НЦ и ПААГ: слева — вестерн-блоттинг белков лейкоцитов, разделенных ПААГ ЭФ. 1 — из лейкоцитов человека, 2 — из лейкоцитов мыши. А, С — разведение первых АТ 1:5000, В — 1:10000. А — окраска ДАБ; В,С — ДАБ+ХН. Справа — ПААГ, окрашенный после электропереноса.
Fig. 7. NC and PAAG: on the left — Western blotting of leukocyte proteins separated by PAAG electrophoresis. 1 —from human leukocytes, 2 —from mouse leukocytes. A, C — dilution of the first AB 1:5000, B — 1:10000. A — coloring DAB; B, C — DAB+СN. On the right - a PAAG painted after electric transfer.
ции в 25 раз. Незначительная неспецифическая реакция истощенных АТ (анти-hp2mg) против r-mp2mg при выбранных разведениях образцов и первых антител сохранялась.
Заключение
На основании представленных результатов можно сделать заключение, что выполненная нами работа позволила получить кроличьи антитела, высокоспецифичные к P2mg человека; подобрать условия, при которых определяется только hp2mg. Истощенные антитела «кролик-анти-hp2mg» работа-
ют при хорошем разведении (1:3000-6000). Антивидовые конъюгаты «коза-анти-кро-лик-ПХ», полученные нами, видоспе-цифично взаимодействуют с кроличьими антителами и работают в разведении 1:5000. Кроме того, нами были получены аффинные сорбенты с иммобилизованными рекомбинантными белками P2mg мыши и человека, т.е. практически создан необходимый инструментарий для иммунных методов детекции р2-микроглобулина мыши и человека в разнообразных прикладных исследованиях. Поликлональные
63
Рис. 8. Дот-блоттинг. Вверху — окраска хлор-нафтолом (ХН). Внизу — окраска диаминобензидином (ДАБ). Б — отрицательный контроль 1хБО. Fig. 8. Dot-blotting. At the top — a chloro-naphthol (ХН) stain. Below — a diaminobenzidine stain (DAB). Б — negative control of 1x sample buffer.
кросс-реактивные к P2mg мыши и человека кроличьи антитела могут быть использованы в задачах, связанных с вестерн-блот-
тингом P2mg различных молекулярных масс: нативным зрелым белком (12 кДа), рекомбинантным белком (16 кДа), P2mg человека в составе химерной НЬА-молекулы (56 кДа) трансгенных мышей.
На примере метода получения истощенных антител «кролик-анти-hp2mg» осуществляется истощение антител «кролик-анти-mP2mg», тем самым расширяется палитра высокоспецифичных реактивов в первую очередь для наших собственных исследований. Не исключено, что при создании новых линий трансгенных животных при необходимости верификации синтеза новых белков или подтверждении отсутствия синтеза белков нокаутированными генами нам придется создавать собственные наборы доказательной реактивной базы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4—22. [Karkischenko N.N., Ryabykh VP., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gu-manizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologich-eskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxico-logical research (successes, failures and prospects)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(3):4—22. (In Russian)].
2. Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10-23. [Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibritnih DNK-konstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2021;17(1):10-23. (in Russian)].
3. Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-C*07:02:01:01, как прообраз инновационных
трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8-20. [Karkischenko N.N., Lazarev VN., Manuvera VA., Bobrovsky P.A., Petrova N.V, Koloskova E.M., Glotova E.S. Principy sozdaniya genno-inzhenernoj konstrukcii dlya polucheniya gu-manizirovannyh transgennyh myshej, nesushchih gen HLA-S*07:02:01:01, kak proobraz innova-cionnyh transgenno-nokautnyh biomodelej [Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2024;20(1):8-20. (In Russian)]. doi: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.
4. Петрова Н.В., Скрипкина М.М. Особенности организации содержания и выведения трансгенных линий мышей в НЦБМТ ФМБА России. Биомедицина. 2021;17(3E):70-75. [Petrova N.V., Skripkina M.M. Osobennosti organizacii soder-zhaniya i vyvedeniya transgennyh linij myshej v NCBMT FMBA Rossii [Maintenance and Breeding of Transgenic Mouse Strains at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the FMBA of Russia]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2021;17(3E):70—75. DOI: 10.33647/2713-0428-17-3E-70-75.
5. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10-23. [Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie
aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgen-noj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological aspects of creation a new humanized transgenic mice with integrated human HLA-A*02:01:01:01 gene]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10-23. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.
6. Faber E., Tshilwane S.I., Van Kleef M., Pretorius A. The impact of Escherichia coli contamination products present in recombinant African horse sickness virus serotype 4 proteins on the innate and humoral immune responses, Molecular Immunology. 2022:152:1-13. DOI: 10.1016/j.molimm.2022.09.013.
7. Loralyn A.B., Rusung T. Xenogeneic p2-Microglobulin Substitution Affects Functional Binding of MHC Class I Molecules by CD8+ T Cells. J. Immunol. 2007;179(6):3588-3595. DOI: 10.4049/jimmunol.179.6.3588.
8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974;22(12):1084-1091. DOI: 10.1177/22.12.1084.
9. Vaitukaitis J.L. Production of antisera with small doses of immunogen: Multiple intradermal injections. Methodsin Enzymology. 198;73:46-52.
10. Williams R.C. Jr., Malone C.C. Antigenic epitopes on beta 2-microglobulin reacting with monoclonal antibodies. J. Lab. Clin. Med. 1993;121(6):805-820.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Каркищенко Николай Николаевич, д.м.н., проф., акад. РАРАН, чл.-корр. РАН, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Nikolay N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Academician of the Russian Academy of Rocket and Artillery Sciences, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Езерский Вадим Аркадьевич, Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста»; e-mail: [email protected]
Vadim A. Ezerskiy, All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst; e-mail: [email protected]
Жукова Ольга Борисовна, Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста»; e-mail: [email protected]
Колоскова Елена Михайловна*, к.б.н., Всероссийский научно-исследовательский инсти-тутфизиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста»;
e-mail: [email protected]
Петрова Наталья Владимировна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Olga B. Zhukova, All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst; e-mail: [email protected]
Elena M. Koloskova*, Cand. Sci. (Biol.), All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst; e-mail: [email protected]
Nataliya V. Petrova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
