ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ОСНОВНОМУ КАПСИДНОМУ БЕЛКУ ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ ВТОРОГО ТИПА И ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Емельянов Илья Алексеевич; Волков Илья Юрьевич; Егоренкова Мария Игоревна; Матвеева Ирина Николаевна; Еремец Владимир Иванович

Ветеринарный врач. 2024. № 5. С. 35 - 46

The Veterinarian. 2024; (5): 35 - 46

Научная статья

УДК 57.083.3/57.088.3

DOI: 10.33632/1998-698Х 2024535

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ОСНОВНОМУ КАПСИДНОМУ БЕЛКУ ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ ВТОРОГО ТИПА И ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Илья Алексеевич Емельянов1, 2, petro-19@mail.ru

Илья Юрьевич Волков3, кандидат биологических наук, i.volkov@fbras.ru

Мария Игоревна Егоренкова2, malyavinami@ya.ru

Ирина Николаевна Матвеева1, доктор биологических наук, biolog1967@mail.ru

Владимир Иванович Еремец1, доктор биологических наук, vieremec@yandex.ru

и

1Всероссийский научно-исследовательский

технологический

институт

биологической

промышленности, Московская область, Российская Федерация

2Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для

животных и кормов, Москва, Российская Федерация

3Федеральный исследовательский центр биотехнологии, Институт биохимии имени А. Н. Баха, Москва, Российская Федерация

Автор, ответственный за переписку: Илья Алексеевич Емельянов.

Аннотация. Представлены результаты сравнительного изучения эффективности трех схем иммунизации кроликов рекомбинантным капсидным белком цирковируса свиней второго типа. Установлено, что уровень гуморального ответа у иммунизированных животных зависит от способа введения антигена. Протоколы иммунизации включающие интрадермальное введение могут обеспечить в 2 раза более высокий уровень продукции антител при одинаковом использованном количестве антигена. Титр антисывороток определен в непрямом ИФА и достигал 1:102400, 1:38400 и 1:19200. Очистка поликлональных антител выполнена в два этапа. Проведено предварительное осаждение антител сульфатом аммония с последующей Протеин А аффинной хроматографией. Установлено, что иммуноглобулины, полученные с использованием отечественного аффинного сорбента RuSelect-P, имеют очень высокую степень чистоты. Спектрофотометрический анализ элюатов показал, что отношение A260/280 составило 0,538-0,552. Суммарно из 17 мл сыворотки получено 317,5 мг очищенных антител с концентрацией 6,4 мг/мл и титром 1:76800. Связывающая способность сорбента RuSelect-P для кроличьего IgG составила 10 мг/мл. Электрофоретический анализ очищенных кроличьих антител в денатурирующих условиях выявил две полосы в диапазоне 50 кДа и 25 кДа, которые соответствовали тяжелой и легкой цепям IgG, однако, легкая цепь выглядела как диффузная полоса в диапазоне 20-35 кДа. Полученные антитела имеют высокую реактивность с антигенами коммерческих тест-систем для обнаружения антител к цирковирусу свиней второго типа и могут использоваться для разработки диагностических методов на основе различных вариантов иммуноферментного анализа.

Ключевые слова: гипериммунизация, аффинная хроматография, аффинный сорбент RuSelect-P, протеин А, титр антител, иммуноферментный анализ, электрофорез, очистка антител

Для цитирования: Емельянов И. А., Волков И. Ю., Егоренкова М. И., Матвеева И. Н., Еремец В. И. Получение поликлональных антител к основному капсидному белку цирковируса свиней второго типа и их потенциальное применение // Ветеринарный врач. 2024. №5. С. 35 - 46. DOI: 10.33632/1998-698Х 20245 35

GENERATION OF POLYCLONAL ANTIBODIES TO THE MAJOR CAPSID PROTEIN OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 AND POTENTIAL APPLICATION OF THEM

Ilya A. Emelyanov1, 2, petro-19@mail.ru

Ilya Y. Volkov3, candidate of biological sciences, i.volkov@fbras.ru

Maria I. Egorenkova2, malyavinami@ya.ru

36

Irina N. Matveeva1, doctor of biological sciences, biolog1967@mail.ru

Vladimir I. Eremets1, doctor of biological sciences, vieremec@yandex.ru

1 All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Biological Industry, Moscow region, Russian Federation

2 All-Russian State Research Institute for Control Standartization and Certification of Veterinary Preparations, Moscow, Russian Federation

3

Federal Research Center of Biotechnology, A. N. Bach Institute of Biochemistry, Moscow, Russian

Federation

Corresponding author: Ilya Alekseevich Emelyanov.

Abstract. The results of a comparative research of efficiency of three rabbit immunization schemes with a recombinant capsid protein of porcine circovirus type 2 are presented. It was determined that level of humoral response in immunized animals depended on the route of antigen administration. Immunization protocols which include intradermal route of injection can provide a two-fold higher level of seroconversion with using the same amount of antigen. Antisera titers were determined by indirect ELISA and it achieved to 1:102400, 1:38400 and 1:19200. Polyclonal antibody purification was done in two steps. At first antibodies were precipitated by ammonium sulfate followed by Protein A affinity chromatography. It had been found that immunoglobulins obtained using domestic affinity resin RuSelect-P had a very high purity level. Spectrophotometric analysis of the eluates found that the A260/280 ratio amounted to 0.538-0.552. In total 317.5 mg purified antibodies were yielded from 17 ml of rabbit sera with concentration 6.4 mg/ml and titer of 1:76800. Binding capacity of resin RuSelect-P amounted to 10 mg/ml for rabbit-IgG. Denaturing SDS-PAGE analysis of purified rabbit-IgG observed two bands at 50 kDa and 25 kDa, which depicted the heavy and light chain of IgG, however, the light chain appeared as a diffused band in the range 20-35 kDa. The resulting antibodies have a high reactivity towards antigens of commercial ELISA kits for detection antibodies against porcine circovirus type 2 and they can be used for development of diagnostic kits based on different variants of ELISA.

Keywords: hyperimmunization, affinity chromatography, affinity resin RuSelect-P, protein A, antibody titer, enzyme-linked immunosorbent assay, SDS-PAGE analysis, antibody purification

Введение. Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС-2, PCV2) принадлежит к семейству Circoviridae роду Circovirus. Это мелкий икосаэдрический безоболочечный вирус диаметром около 17 нм, содержащий одноцепочечную ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК, состоящую приблизительно из 1759 нуклеотидов [1, 2]. Геном ЦВС-2 имеет две основные рамки считывания: ORF1 и ORF2. ORF1 кодирует неструктурный Rep-протеин, регулирующий репликацию вируса, а ORF2 основной капсидный белок или Cap-протеин молекулярной массой около 30 кДа, являющийся единственным структурным белком вириона и важнейшим протективным антигеном, антитела к которому обладают вируснейтрализую-щей активностью [3-5]. Эпитопы Cap-протеина специфически реагируют с сыворотками крови свиней, инфицированных ЦВС-2, поэтому этот белок нашел широкое применение для разработки вакцин [6, 7] и тест-систем для детекции специфических анти-ЦВС-2 антител на основе различных вариантов им-муноферментного анализа: непрямой [8], конкурентный [9-11]. В последнее время также разработаны быстрые иммунохроматографические методы обнаружения ЦВС-2 и антител к нему [12, 13]. В качестве специфических реагентов в данных методах применяются моноклональные и поликлональные антитела к Cap-протеину ЦВС-2.

Антитела или иммуноглобулины представляют собой особый класс гликопротеинов, которые вырабатываются плазматическими клетками иммунной системы позвоночных животных в процессе адаптивного иммунного ответа при контакте с различными типами антигенов. У млекопитающих известно пять классов иммуноглобулинов, самый распространённый - IgG. В структуре IgG выделяют два антигенсвязывающих Fab-фрагмента, один кристаллизующий Fc-фрагмент и шарнирную область. Комплементарно-определяющие области вариабельных доменов Fab-фрагментов иммуноглобулинов распознают и связывают эпитопы антигенов. Ассоциация между антигеном и антителом включает в себя множество нековалентных взаимодействий, обладает исключительной специфичностью и высокой степенью сродства, что делает антитела ценнейшим инструментом в прикладных и фундаментальных биологических исследованиях. Конформационные изменения антигена оказывают меньшее влияние на активность поликлональных антител, так как они способны распознавать множество эпитопов, кроме того, получение поликлональных антител занимает гораздо меньше времени и не требует получения гибридом [14-16].

37

Традиционным способом получения антител является иммунизация животных. В качестве иммуногенов используются цельновирионные вирусные, цельноклеточные бактериальные антигены или их рекомбинантные белки, синтетические пептиды, токсины, иммуноглобулины и их фрагменты. В отечественной и зарубежной литературе описано множество протоколов иммунизации различающиеся способом, интервалом, красностью введения антигена и его дозой, однако, исследования, посвященные сравнительной оценки эффективности разных схем, отсутствуют [17-20].

Антитела могут быть выделены из сыворотки крови, асцитной жидкости, среды для культивирования клеток. Эти источники содержат большое количество посторонних белков, которые оказывают отрицательное влияние на чувствительность и специфичность антител, поэтому необходима их эффективная очистка, которая может быть достигнута различными методами, такими как осаждение сульфатом аммония или каприловой кислотой, гель-фильтрация, гель-электрофорез, ионообменная или аффинная хроматография. В настоящее время аффинная хроматография является наиболее эффективной и широко применяемой. Протеин А из Staphylococcus aureus применяется как лиганд в аффинных сорбентах на основе полимеров агарозы, сефарозы, полиакрилата [21-22].

Целями нашей работы стали разработка наиболее эффективной схемы иммунизации кроликов основным капсидным белком цирковируса свиней второго типа, получение и очистка поликлональных антител на отечественном аффинном сорбенте RuSelect-P, а также изучение реактивности полученных иммуноглобулинов с антигенами коммерческих ИФА тест-систем для обнаружения антител к ЦВС-2.

Материалы и методы. Антиген. В данном исследовании использовали рекомбинантный капсидный белок ORF2 цирковируса свиней второго типа, экспрессированный в бакуловирусной системе.

Получение поликлональных антител. Гипериммунные сыворотки получали путем иммунизации кроликов породы Советская шиншилла массой 2,5-3,0 кг смесью рекомбинантного белка с полным и неполным адъювантом Фрейнда («Sigma-Aldrich», США) в соотношении 1:1. Использованы три схемы иммунизации (таблица 1), на каждую взято по 3 головы клинически здоровых кроликов. В качестве контроля использованы интактные кролики такой же массы. Для изучения динамики сероконверсии у иммунизированных животных осуществляли еженедельное взятие крови.

После завершения циклов иммунизации животных обескровливали путем пункции сердца. Полученную кровь выдерживали 1,5-2 часа при 37^, обводили и оставляли при 4-8^ на 18-20 часов. Отделившуюся сыворотку двукратно центрифугировали на центрифуге 3-16 L («Sigma», Германия) c ротором 12171. На первом этапе осаждали форменные элементы крови при 1500 оборотах в минуту (249 g) в течение 20 минут, супернатанты подвергали повторному центрифугированию при 9000 оборотах в минуту (8965 g) в течение 20 минут. Сыворотки аликвотировали по 10 мл, хранили при минус 20Т до дальнейшего использования.

Очистка поликлональных антител на аффинном сорбенте с протеином A. IgG выделяли методом аффинной хроматографии. 17 мл сыворотки развели в два раза охлажденным до 4Т 50 мМ TRIS буфером pH 8,1, медленно добавили кристаллический сульфат аммония до 50% молярного насыщения (2,025 М) из расчета 0,314 г на 1 мл смеси сыворотка-буфер, осторожно перемешали покачиванием до полного растворения кристаллов, не допуская образования пены, и выдерживали ночь при 4^. Центрифугировали на центрифуге CR22N («Hitachi», Япония) с ротором R20A2 при 14000 оборотах в минуту (23500 g) в течение 40 минут. Полученный осадок растворяли в 45 мл 40 мМ TRIS буфера pH 7,1, повторно центрифугировали при том же режиме в течение 15 минут, супернатант использовали для нанесения на колонку.

В колонку вносили 10 мл сорбента RuSelect-P («НаноМикроТех», Россия), который представляет собой полиакрилатную матрицу с сорбированным протеином А. Сорбент регенерировали охлажденным до 4^ 0,1 M TRIS-глициновым буфером pH 2,75 и уравновешивали тремя объемами стартового 40 мМ TRIS буфера pH 7,1, уровень pH контролировали универсальной индикаторной бумагой. Перед проведением хроматографии колонку, образец нанесения, стартовый и элюирующий буферы охлаждали до 4Т.

Образец наносили порциями по 5 мл, за один цикл хроматографии очищали суммарно 15 мл. После нанесения колонку промывали тремя объемами стартового буфера для удаления не связавшихся белков. Элюцию антител с сорбента проводили 0,1 M TRIS-глициновым буфером pH 2,75, фракции собирали в пробирки, содержащие 0,5 мл 1,5 М TRIS буфера pH 8,8. Дополнительно контролировалась конечная pH элюатов, при необходимости пробы доводили 0,8 M TRIS буфером pH 7,2 до pH 7,5-8,0.

Содержание белка (качественно) во фракциях элюата оценивали с помощью реагента Бредфорда («BIO-RAD», США). Количественное содержание белка определяли на спектрофотометре Nano-Photometr NP80 («Implen», Германия) при длине волны 280 нм. Дополнительно отбирали образцы сыворотки до и после нанесения на колонку, а также элюаты для исследования превалирующих белковых

38

фракций методом электрофореза. Фракции с наибольшей концентрацией белка объединяли и фильтровали через фильтр 0,45 мкм на основе регенерированной целлюлозы.

Таблица 1 - Схемы иммунизации кроликов

Номер инъекции

Способ введения и доза (мл)

Интервал между инъекциями

Адъювант, количество антигена на животное (мг)

Схема 1

1

2

3

4

Внутрикожно в подушечки каждой тазовой конечности по 0,1 мл В подколенные лимфатические узлы по 0,5 мл

Полный адъювант

Фрейнда, 2 мг

Внутривенно

7 дней после первой инъекции

30 дней после второй инъекции

На следующий день после третьей инъекции

Полный адъювант Фрейнда, 2 мг

Без адъюванта, 0,5 мг

Без адъюванта, 1 мг

1

Схема 2

Внутрикожно в пять точек с каждой стороны вдоль позвоночника по 0,1 мл

Полный адъювант

Фрейнда, 1 мг

2, 3, 4, 5

Подкожно в область холки по 0,5 мл в две точки

14 дней между всеми инъекциями

Неполный адъювант

Фрейнда, 0,5 мг

Схема 3

2, 3

Внутримышечно в каждую тазовую конечность по 0,5 мл

7 дней между всеми инъекциями

Полный адъювант Фрейнда, 1 мг Неполный адъювант Фрейнда, 0,5 мг Полный адъювант Фрейнда, 1 мг

1

4

Гель-электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях. Анализ белковых фракций проводили в 12% полиакриламидном геле по Лэммли с использованием вертикальной камеры Mini-PROTEAN Tetra System («BIO-RAD», США). К исследуемому образцу (20 мкл) добавляли равное количество четырехкратного диссоциирующего буфера 4х Laemmli Sample Buffer («BIO-RAD», США) с меркаптоэтанолом, пробы прогревали при 95 Т в течение 5 минут. В лунки геля образцы вносили по 2 мкл, маркер молекулярного веса Pierce™ Unstained Protein MW Marker («Thermo Fisher Scientific», США) по 4 мкл. Электрофорез проводили в 25 мМ TRIS-глициновом буфере pH 8,3 при силе тока 10-20 мА/гель, по окончании гель извлекали из камеры, фиксировали смесью 10% уксусной кислоты и 50% этанола в течение 15 минут. Окрашивали Кумасси R-250, отмывали раствором, содержащим 10% уксусной кислоты и 10% этанола. Гель сканировали на приборе ChemiDoc («BIO-RAD», США).

Иммуноферментный анализ. 96-луночные иммунологические планшеты («MaxiSorp Nunc», Дания) сенсибилизировали рекомбинантным капсидным белком ORF2 PCV2 (0,78 мкг/мл) в объеме 100 мкл/лунка на 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,6 в течение 18-20 часов при 2-8Т. Блокировку осуществляли 0,01 M фосфатно-буферным раствором pH 7,2-7,4 с 1% бычьего сывороточного альбумина по 200 мкл/лунка, инкубировали 1 час при 37Т. Испытуемые сыворотки разводили с 1:50 по 1:102400 на 0,01 M фосфатно-буферном растворе pH 7,2-7,4 с 1% бычьего сывороточного альбумина в объеме 100 мкл/лунка, инкубировали 1 час при 37Т. Затем вносили по 100 мкл конъюгата протеин А-пероксидаза («Sigma Aldrich», США) в разведении 1:64000, инкубировали 1 час при 37Т. Межэтапная промывка: трехкратно 0,01 M фосфатно-буферным раствором pH 7,2-7,4 с 0,05% Твин-20

39

по 300 мкл на лунку на вошере Wellwash Versa («Thermo Fisher Scientific», Финляндия). Для визуализации результатов в каждую лунку вносили по 100 мкл однокомпонентного субстратного раствора тет-раметилбензидина («Sigma Aldrich», США), инкубировали в течение 10 минут в темноте при 20-22Т, реакцию останавливали добавлением 100 мкл 2М H2SO4. Учет проводили на спектрофотометре Infinite F50 («Tecan», Австрия) при длине волны 450 нм. За титр сывороток принимали величину обратного разведения, в котором значение оптической плотности превышало отрицательный контроль не менее чем в 2 раза.

Результаты исследований и их обсуждение. Гуморальный иммунный ответ. Количественное определение IgG - первостепенная задача в исследовании динамики иммунного ответа. Одним из самых быстрых и распространённых методов обнаружения антител является иммуноферментный анализ. В зависимости от вида животного-продуцента используют соответствующий антивидовой пероксидазный конъюгат [18]. Известны природные белки, которые способны специфически связываться с молекулами иммуноглобулинов разных видов животных, например, протеин А из клеточной стенки Staphylococcus aureus. Этот белок эффективно взаимодействует с Fc-фрагментами различных субклассов IgG человека, кролика, морской свинки, обезьяны, свиньи, собаки, поэтому конъюгат протеин А-пе-роксидаза может быть альтернативой традиционным антивидовым антителам [23-24]. В данном исследовании в качестве вторичного антитела в непрямом ИФА использован коммерческий конъюгат протеин А-пероксидаза. Результаты исследования уровня сероконверсии к основному капсидному белку ORF2 PCV2 представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Динамика уровня сероконверсии у кроликов к белку ORF2 PCV2

120000

100000

80000

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

60000

40000

38400

■ схема 3 ■ схема 2

■ схема 1

76800

102400

38400

20000

2000

0 050

50

19200

128

920016000П16000 Г

10^ ^801) V600

19200,

I 80( 50j2400^

14

21

28

35

42

1601

49

59

66

0

7

Дни после начала иммунизации

Продолжительность циклов иммунизации составила от 49 до 66 дней. Все схемы привели к образованию специфических антител в высоких титрах, которые варьировались от 1:16000 до 1:102400, что является удовлетворительным результатом.

Схема иммунизации № 1 оказалась самой эффективной. Титр антител у иммунизированных животных через 49 дней после начала иммунизации составил 1:102400, что соответственно в 6,4 и 2,7 раза выше по сравнению с итоговыми титрами антител в схемах № 3 и № 2. Кроме того, схема № 1 привела к более быстрому образованию антител: титр 1:19200 в схеме № 1 был достигнут к 21 дню, что в 2 раза быстрее чем в схеме № 3, а титр 1:38400 к 28 дню, что в 1,75 раза быстрее чем в схеме № 2.

Высокая скорость и интенсивность развития иммунного ответа у животных опытной группы № 1 обусловлена, прежде всего, способом введения антигена и его дозой. Первая инъекция антигена в схеме № 1 была интрадермальной в подушечки тазовых конечностей в дозе 2 мг. Данный путь введения обладает преимуществом медленного всасывания антигена в системный кровоток при быстром поступлении его в лимфатическую систему, кроме того, присутствующие в дерме кожи антигенпрезентующие клетки Лангерганса обеспечили быстрое представление антигена иммунокомпетентным клеткам регионарных лимфатических узлов [25].

Через 7 дней после первого введения антигена подколенные лимфатические узлы увеличились до размера боба и пальпировались течение 35 дней. Вторая инъекция такой же дозы антигена в схеме

40

№ 1 выполнена непосредственно в увеличенные лимфатические узлы, а третья и четвертая с понижением дозы антигена в 4 и 2 раза - внутривенно. Всего в схеме иммунизации № 1 использовано 5,5 мг антигена на кролика. Оптимальный срок взятия крови - через 12 дней после последнего введения антигена.

Сравнительное изучение эффективности схем иммунизации № 2 и № 3 демонстрирует, что способ введения антигена имеет решающее значение в достижении высокого уровня гуморального ответа. На обе схемы было затрачено одинаковое количество антигена - 3 мг, однако, схема № 2 в 2 раза более эффективна, чем схема № 3. Первое многоточечное внутрикожное введение антигена вдоль позвоночного столба обеспечило быстрое его поступление в лимфоидные органы, что привело к высокому уровню сероконверсии. Так, максимальный титр антител 1:38400 в схеме № 2 был достигнут к 49 дню, а титр 1:19200 в схеме № 3 на 42 день. Оптимальный срок взятия крови для схемы № 2 - через 7 дней после последнего введения антигена, а для схемы № 3 - через 14.

Очистка антител. IgG к белку ORF2 PCV2 выделяли из сыворотки с титром 1:102400 (схема № 1). Осаждение антител сульфатом аммония не привело к получению иммуноглобулинов высокой степени чистоты. Электрофоретический анализ полученной глобулиновой фракции показал наличие большого количества посторонних белков в диапазоне молекулярных масс 60-166 кДа (рисунок 2, полоса № 1), которые представлены в основном сывороточным кроличьим альбумином (66 кДа). Однако, предварительное осаждение антител позволяет эффективно избавиться от большинства низкомолекулярных белков и липидов, поэтому в настоящее время данный метод преимущественно используется в качестве прехроматографической очистки образцов, кроме того, удаление посторонних белков позволяет увеличить срок эксплуатации аффинных сорбентов [26].

Аффинная очистка антител (IgG) протеином А основана на его уникальной способности специфически связывать Fc-область IgG млекопитающих. Поскольку иммуноглобулины большинства видов и подклассов связываются с белком А в условиях, близким к физиологическим, в качестве буфера нанесения использован 40 мМ TRIS буфер с нейтральным pH 7,1. Средняя скорость потока через колонку под действием силы тяжести составила 0,75 мл/мин. Один цикл хроматографии занимал в сред-

нем 2 часа: уравновешивание и промывка колонки после нанесения образца

по 40 минут, нанесение

образца и элюция антител - по 20 минут. Всего проведено три цикла хроматографии.

Сильные взаимодействия между антителами и протеином А вызывают необходимость использовать для десорбции IgG с сорбента буферы с очень низкими значениями pH [27], мы использовали 0,1 M TRIS-глициновый буфер с pH 2,75. Жесткие условия элюирования могут привести к денатурации и полиреактивности антител [28, 29], для предотвращения этого элюаты собирали в 1,5 М TRIS буфер с pH 8,8. За один цикл хроматографии собирали 3 фракции в объеме 5-7 мл.

Наибольшая концентрация белка (качественно) обнаружена в 1 и 2 фракциях, а наименьшая в 3 «хвостовой». Фракции с высокой концентрацией белка объединяли, мажорную и минорную фракции подвергали спектрофотометрическому исследованию (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты спектрофотометрического анализа фракций элюата

Номер фракции

Объем, (мл)

Отношение

A260/280

Поглощение при

280 нм

Количество белка в мл/во фракции (мг)

Хроматография № 1

1

2

12,0 ’6,0“

0,538

8,546

5,268

6,30/75,6

4,05/24,3

Хроматография № 2

1

2

15,0 ЗУ

0,534

0,540

7,500

4,008

5,60/84,0

3,00/16,5

Хроматография № 3

1

2

14,5

7,0

0,552

0,550

9,829

2,112

7,30/105,9

1,60/11,2

Содержание белка в образце рассчитывали путем деления поглощения при длине волны 280 нм (A280) на коэффициент его молярной экстинкции (е280), который для IgG составляет 1,35. Концентрация белка в мажорной фракции составила от 7,3 до 5,6 мг/мл, а в минорной от 1,60 до 4,05 мг/мл. Общее содержание белка в мажорной фракции колебалось от 75,6 до 105,9 мг/мл, в минорной от 24,3 до 11,2

41

мг/мл. Суммарно за три цикла хроматографии получено 317,5 мг чистого IgG, таким образом, ёмкость аффинного сорбента RuSelect-P для кроличьего IgG составила около 10 мг/мл.

Оценка чистоты полученных иммуноглобулинов является важной контрольной точкой в процессе их очистки. Спектрофотометрический анализ - полезный инструмент для исследования чистоты белка по отношению поглощения при длине волны 260 нм к 280 нм (A260/280), которое должно стремиться к значению 0,57 [30]. Значение коэффициента A260/280 во всех фракциях элюата находится в диапазоне 0,538-0,552, что свидетельствует о высокой степени очистки антител.

Для контроля чистоты полученных IgG и эффективности их связывания с аффинным сорбентом элюаты и образцы сыворотки после прохождения колонки анализировали с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецетилсульфатом натрия в денатурирующих условиях (рис. 2).

Рисунок 2 - Электрофоретический анализ сыворотки кролика на разных стадиях аффинной хроматографии (окрашивание Кумасси R-250)

Примечания

M - маркер молекулярных масс; 1 - образец сыворотки до нанесения на колонку; 2 и 9 - образцы сыворотки после нанесения на колонку; 3-8 - элюаты; H и L - тяжелая и легкая цепь IgG.

Молекула IgG состоит из двух идентичных тяжелых (H) массой 50 кДа и двух идентичных легких цепей (L) массой 25 кДа связанных между собой дисульфидными связями [14]. Так как электрофорез выполнен в денатурирующих условиях, в-меркаптоэтанол содержащийся в диссоциирующем буфере вызвал разрыв дисульфидных связей между цепями. На электрофореграмме элюатов наблюдалось две полосы в диапазоне молекулярных масс 50 кДа и 25 кДа, которые соответствовали тяжелой и легкой и цепям IgG (рис. 2, полосы 3-8). Легкая цепь выглядела как диффузная полоса в диапазоне 2035 кДа, что также соответствует результатам исследований ряда авторов [18, 31], такое нетипичное поведение связано со многими факторами, такими как денатурация, дегликозилирование или пребывание в буфере с высокой концентрацией солей [32], а может являться видовой особенностью кроличьего IgG. В целом, аффинная хроматография на сорбенте RuSelect-P привела к получению общего IgG очень высокой степени чистоты. Нецелевые белки в диапазоне 60-166 кДа эффективно удалены, а молекулы IgG полностью сорбировались на аффинной матрице, что подтверждено исследованием образцов «проскока» (рис. 2, полосы 2 и 9), во фракциях элюата выявлен только чистый IgG (рисунок 2, полосы 38). Получено 41,5 мл кроличьих поликлональных антител к основному капсидному белку ORF2 PCV2 с концентрацией 6,4 мг/мл с титром в ИФА 1:76800 (таблица 3).

Гипериммунная сыворотка перед хроматографической очисткой предварительно двукратно разведена стартовым буфером, поэтому снижение активности очищенных IgG в 1,3 раза вызвано уменьшением концентрации белка, а не денатурацией антител в условиях кислой среды элюирующего буфера. Кроме того, полученные антитела показали высокую реактивность с антигенами коммерческих ИФА тест-систем для обнаружения антител к ЦВС-2 (таблица 4).

42

Таблица 3 - Определение титра кроличьей сыворотки и очищенного IgG к антигену ORF2 PCV2

Разведение

1/12800

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1/25600

1/51200

1/102400

1/204800

1/409600

Отрицательный контроль

Оптическая плотность

Сыворотка Сыворотка IgG

IgG

2,0019

2,0788

1,4600

1,2398

1,5751

1,7290

0,9634

0,5432

1,0188

1,1621

0,6400

0,4944

0,6897

0,7131

0,3417

0,2426

0,3802

0,2432

0,2020

0,4122

0,2494

0,2105

0,2250

0,1279

0,1428

0,1553

0,0988

0,1672

Примечания

Отрицательный контроль разведен 1:100. Образцы тестировались в двух повторах.

Таблица 4 - Связывание очищенного IgG к ORF2 PCV2 с антигенами коммерческих ИФА тест-систем

ИФА тест-система

Bio Chek PCV2

Ingezim CIRCO IgG

Оптическая плотность

Отрицательная сыворотка кролика

0,0642

0,0782

Очищенный IgG

2,5291

1,3670

Примечание

Отрицательная сыворотка и IgG разведены 1:1000.

Результаты иммуноферментного анализа демонстрируют, что кроличьи поликлональные антитела распознают основной капсидный белок ORF2 цирковируса свиней второго типа с высокой степенью специфичности. Высокоаффинные антитела применяются в различных иммунологических реакциях: иммуноферментный анализ, вестерн-блоттинг, иммуногистохимия. Полученные антитела могут использоваться для конъюгации с ферментами, флуорохромами и другими маркерами, а также пригодны для применения в качестве основного реагента в различных вариантах иммуноферментного анализа, вестерн-блоттинге и иммуноокрашивании клеток.

1.

2.

3.

4.

5.

Заключение.

На основании результатов сравнительного изучения эффективности трех схем гипериммунизации кроликов рекомбинантным капсидным белком цирковируса свиней второго типа установлено, что протоколы иммунизации, начинающиеся интрадермальной инъекцией антигена, обеспечивают высокую скорость и интенсивность образования антител.

Получены кроличьи гипериммунные сыворотки к основному капсидному белку цирковируса свиней второго типа с титрами в ИФА 1:102400, 1:38400, 1:19200.

Отечественный хроматографический сорбент RuSelect-P позволяет получить IgG высокой степени чистоты. Ёмкость сорбента для кроличьего IgG составляет 10 мг/мл.

Получено 317,5 мг кроличьих аффинно очищенных поликлональных антител к основному капсидному белку цирковируса свиней с титром в ИФА 1:76800.

Полученные антитела являются потенциальными кандидатами для разработки диагностических тест-систем на основе различных вариантов иммуноферментного анализа.

43

Список источников

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Mya B., Eric D., Karyna R., Joaquim S., Arvind V., ICTV Report Consortium. ICTV Virus Taxonomy Profile: Circoviridae // Journal of General Virology. - 2017. - Vol. 98, No. 8 - P. 1997-1998. - doi: 10.1099/jgv.0.000871.

Tischer I., H. Gelderblom, W. Vettermann, M. A. Koch. A very small porcine virus with circular singlestranded DNA // Nature. - 1982. - No 295(5844). - P. 64-66. - doi:10.1038/295064a0.

Faurez F., Dory D., Grasland B., Jestin A. Replication of porcine circoviruses // Virology Journal. - 2009.

- No 6(60). - P. 60-68. - doi: 10.1186/1743-422X-6-60.

Porntippa N., Igor M., Steven R.B., Perry A.H., Steven D.S., Prem S.P. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein // Journal of General Virology. - 2000. - Vol. 81, No. 9 - P. 2281-2287. - doi: 10.1099/0022-1317-81-9-2281.

Maria F., Alex O., Marina S., Joaquim S., Enric M. Detection of neutralizing antibodies in postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs // Veterinary Microbiology. - 2007. - Vol. 125, No. 3-4. - P. 244-255. - doi: 10.1016/j.vetmic.2007.06.004.

Fan H., Ju C., Tong T., Huang H., Lv J., Chen H. Immunogenicity of empty capsids of porcine circovius type 2 produced in insect cells // Veterinary Research Communications. - 2007. - Vol. 31, No. 4 - P. 487496. - doi: 10.1007/s11259-007-3469-7.

Guo J., Hou L., Zhou J., Wang D., Cui Y., Feng X., Liu J. Porcine Circovirus Type 2 Vaccines: Commercial Application and Research Advances // Viruses. - 2022. - Vol. 14, No. 9 - doi: 10.3390/v14092005.

Nainys J., Lasickiene R., Petraityte-Burneikiene R., Dabrisius J., Lelesius R., Sereika V., Zvirbliene A., Sasnauskas K., Gedvilaite A. Generation in yeast of recombinant virus-like particles of porcine circovirus type 2 capsid protein and their use for a serologic assay and development of monoclonal antibodies // BMC Biotechnology. - 2014. - Vol. 14(100) .- doi: 10.1186/s12896-014-0100-1.

Mu Y., Jia C., Zheng X., Zhu H., Zhang X., Xu H., Liu B., Zhao Q., Zhou E.M. A nanobody-horseradish peroxidase fusion protein-based competitive ELISA for rapid detection of antibodies against porcine

circovirus type 2 // Journal of Nanobiotechnology.

00778-8.

2021.- Vol. 19 (34). - doi: 10.1186/s12951-021-

10. Han S., Xiao Y., Zheng D., Gu Y., Xuan Y., Jin Y., Pang W., Huang Y., Li X., Deng J., Tian K. Establishment and application of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay differentiating PCV2 antibodies from mixture of PCV1/PCV2 antibodies in pig sera // BMC Veterinary Research. - 2016. - Vol. 12 (175). - doi: 10.1186/s12917-016-0802-9.

11. Huang L., Lu Y., Wei Y., Guo L., Liu C. Development of a blocking ELISA for detection of serum neutralizing antibodies against porcine circovirus type 2 // Journal of Virological Methods. - 2011. - Vol. 171, No. 1 - P. 26-33. - doi: 10.1016/j.jviromet.2010.09.023.

12. Ding H., Shen Y., Gao Y., Wu S., Xie C., Sun H., Zhang H., Sun H., Shan Y., Ding J., Zheng B., Lu S., Zhuo X. Development of gold Immunochromatographic assay strip based on specific polyclonal antibodies against capsid protein for rapid detection of porcine circovirus 2 in Zhejiang province, China // BMC Veterinary Research. - 2022. - Vol. 18(373). - doi: 10.1186/s12917-022-03471-6.

13. Jiang M., Wang A., Sun Y., Li Y., Chen Y., Zhou J., Liu H., Ding P., Qi Y., Li N., Zhang G. Development of a Gold Nanoparticle-Based Immunochromatographic Strip for Rapid Detection of Porcine Circovirus Type 2 // Microbiology Spectrum. - 2023. - Vol. 11, No. 4 - doi: 10.1128/spectrum.01953-22.

14. Lipman N.S., Jackson L.R., Trudel L.J., Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources // ILAR Journal. - 2005. - Vol. 46, No. 3 - P. 258-268.- doi: 10.1093/ilar.46.3.258.

15. Iwasaki A., Medzhitov R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system // Science. -2010. - Vol. 327, No. 5963 - P. 291-295. - doi: 10.1126/science.1183021.

16. Sela-Culang I., Kunik V., Ofran Y. The structural basis of antibody-antigen recognition // Frontiers in Immunology. - 2013. - Vol. 4 (302) - doi: 10.3389/fimmu.2013.00302

17. Greenfield E.A. Immunizing Animals // Cold Spring Harbor Protocols. - 2022. - Vol. 7 - P. 267-294. -doi: 10.1101/pdb.top100180.

18. Mohsin A.Z., Sukor R., Selamat J., Meor Hussin A.S., Ismail I.H., Jambari N.N., Mustaffa-Kamal F. Generation of High Affinity Anti-Peptide Polyclonal Antibodies Recognizing Goat as1-Casein // Molecules. - 2020. - Vol. 25, No. 11 - doi: 10.3390/molecules25112622.

19. Ефимова М. А. Оценка пригодности выделенных антирабических глобулинов для методов лабораторной диагностики: ИФА и МФА /М. А. Ефимова [и др.] // Ветеринарный врач. - 2018. - № 4. -С. 3-7.

44

20. Лобанова В. А. Получение компонентов тест-системы на основе конкурентного иммунофермент-ного анализа для выявления антител к вирусу бешенства/ В. А. Лобанова, В. И. Клюкина // Ветеринарный врач. - 2022. - № 2. - С. 29-39.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

21. Fishman J.B., Berg E.A. Antibody Purification and Storage // Cold Spring Harbor Protocols. - 2019. -Vol. 5. -- P. 331-344. - doi: 10.1101/pdb.top099101.

22. Arakawa T., Tomioka Y., Nakagawa M., Sakuma C., Kurosawa Y., Ejima D., Tsumoto K., Akuta T. NonAffinity Purification of Antibodies // Antibodies. - 2023 - Vol. 12, No. 1 - doi: 10.3390/antib12010015.

23. Seyfi Abad Shapouri M.R., Mahmoodi P., Gharibi D., Ghorbanpoor M., Yaghoubi S. Rezaei E., Rashno M., Mehravar N. Molecular Cloning, Expression and Peroxidase Conjugation of Staphylococcus aureus Protein A // Iranian Journal of Biotechnology. - 2016 - Vol. 14, No 4. - P. 230-235. - doi: 10.15171/ijb.1267.

24. Wang P., Wang Y., Zhang Y., Yang T., Song Y., Zhao J., Yan B., Yang A. Eukaryotic expression and immunoactivity of protein A/G-horseradish peroxidase (PA/G-HRP) fusion protein as universal secondary antibody for detection of IgG originating from mice and rabbits // Chinese journal of cellular and molecular immunology. - 2021 - Vol. 37, No. 7 - P. 590-595.

25. Greenfield E. A.. Routes of Antigen Injection in Rabbits // Cold Spring Harbor Protocols. - 2018 - Vol. 9 - P. 702-706. - doi: 10.1101/pdb.prot100222.

26. Fishman J.B., Berg E.A. Ammonium Sulfate Fractionation of Antibodies // Cold Spring Harbor Protocols. - 2018 - Vol. 6 - P. 472-474. - doi: 10.1101/pdb.prot099119.

27. McCaw T.R., Koepf E.K., Conley L. Evaluation of a novel methacrylate-based Protein A resin for the purification of immunoglobulins and Fc-fusion proteins // Biotechnology Progress. - 2014 - Vol. 30, No. 5 - P. 1125-1136. - doi: 10.1002/btpr.1951.

28.

29.

30.

31.

Lopez E., Scott N.E., Wines B.D., Hogarth P.M., Wheatley A.K., Kent S.J., Chung A.W. Low pH Exposure During Immunoglobulin G Purification Methods Results in Aggregates That Avidly Bind Fcy Receptors: Implications for Measuring Fc Dependent Antibody Functions // Frontiers in Immunology. - 2019 -Vol. 10 (2415) - doi: 10.3389/fimmu.2019.02415.

Imamura H., Honda S. pH-shift stress on antibodies // Methods in Enzymology. - 2019 - Vol. 622 - P. 329-345. - doi: 10.1016/bs.mie.2019.02.021.

Glasel J.A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios // Biotechniques. - 1995 - Vol. 18, No. 1 - P. 62-63.

Esparvarinha M., Nickho H., Aghebati-Maleki L., Abdolalizadeh J., Nasiri H., Valedkarimi Z., Majidi J. Development and characterization of polyclonal antibody against human kappa light chain in rabbit // Veterinary Research Forum. - 2019 - Vol. 10, No. 3 - P. 207-211. - doi: 10.30466/vrf.2018.81414.2077.

32. Nasiri H., Valedkarimi Z., Aghebati-Maleki L., Abdolalizadeh J., Kazemi T., Esparvarinha M., Majidi J. Production and purification of polyclonal antibody against F(ab')2 fragment of human immunoglobulin G // Veterinary Research Forum. - 2017 - Vol. 8, No. 4 - P. 307-312.

References

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Mya B., Eric D., Karyna R., Joaquim S., Arvind V., ICTV Report Consortium. ICTV Virus Taxonomy Profile: Circoviridae // Journal of General Virology. - 2017. - Vol. 98, No. 8 - P. 1997-1998. - doi: 10.1099/jgv.0.000871.

Tischer I., H. Gelderblom, W. Vettermann, M. A. Koch. A very small porcine virus with circular singlestranded DNA // Nature. - 1982. - No 295(5844). - P. 64-66. - doi:10.1038/295064a0.

Faurez F., Dory D., Grasland B., Jestin A. Replication of porcine circoviruses // Virology Journal. - 2009. - No 6(60). - P. 60-68. - doi: 10.1186/1743-422X-6-60.

Porntippa N., Igor M., Steven R.B., Perry A.H., Steven D.S., Prem S.P. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein // Journal of General Virology. - 2000. - Vol. 81, No. 9 - P. 2281-2287. - doi: 10.1099/0022-1317-81-9-2281.

Maria F., Alex O., Marina S., Joaquim S., Enric M. Detection of neutralizing antibodies in postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs // Veterinary Microbiology. - 2007. - Vol. 125, No. 3-4. - P. 244-255. - doi: 10.1016/j.vetmic.2007.06.004.

Fan H., Ju C., Tong T., Huang H., Lv J., Chen H. Immunogenicity of empty capsids of porcine circovius type 2 produced in insect cells // Veterinary Research Communications. - 2007. - Vol. 31, No. 4 - P. 487496. - doi: 10.1007/s11259-007-3469-7.

Guo J., Hou L., Zhou J., Wang D., Cui Y., Feng X., Liu J. Porcine Circovirus Type 2 Vaccines: Commercial Application and Research Advances // Viruses. - 2022. - Vol. 14, No. 9 - doi: 10.3390/v14092005.

45

8. Nainys J., Lasickiene R., Petraityte-Burneikiene R., Dabrisius J., Lelesius R., Sereika V., Zvirbliene A., Sasnauskas K., Gedvilaite A. Generation in yeast of recombinant virus-like particles of porcine circovirus type 2 capsid protein and their use for a serologic assay and development of monoclonal antibodies // BMC Biotechnology. - 2014. - Vol. 14(100). - doi: 10.1186/s12896-014-0100-1.

9. Mu Y., Jia C., Zheng X., Zhu H., Zhang X., Xu H., Liu B., Zhao Q., Zhou E.M. A nanobody-horseradish peroxidase fusion protein-based competitive ELISA for rapid detection of antibodies against porcine