CC BY
3
https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-21-31
(«О
BY 4.0
ПОЛУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ
БЕЛКОВ ß2-МИКРОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И ß2-МИКРОГЛОБУЛИНА МЫШИ ДЛЯ ЕГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ В ХИМЕРНЫХ МОЛЕКУЛАХ HLA I КЛАССА
В.Н. Каркищенко1, В.А. Езерский2*, Е.М. Колоскова2, М.С. Нестеров1
1 ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1
2 Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста» 249013, Российская Федерация, Калужская обл., Боровск, п. Институт
Трансгенные гуманизированные животные всё более востребованы для биомедицинских исследований, фармакологических испытаний. Создается всё больше линий трансгенных животных, в т.ч. и с нокаутом собственных генов. Остро необходима доказательная база интеграции трансгена, его экспрессии, определение состояния нокаута собственного гена на молекулярно-генетическом уровне, детекция трансляции целевого белка в разных органах и тканях, доказательство отсутствия синтеза белка (или его нефункциональность), ген которого был модифицирован. Для этого требуются высокоспецифичные реагенты — в частности, белки и антитела к ним, в подавляющем большинстве своём представленные иностранными производителями. Была поставлена задача идентификации Р2-микроглобулина мыши и человека в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и но-каутных мышей нескольких HLA-линий, созданных в последние годы в НЦБМТ ФМБА России. На первом этапе наших исследований были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных Р2-микроглобулина мыши mß2mg и р2-микроглобулина hß2mg человека. Нуклеотидные последовательности генов были адаптированы для синтеза в бактериальной системе, рекомбинантные белки, mß2mg и hß2mg очищены и наработаны в количествах, необходимых для получения аффинных сорбентов и иммунизации животных.
Ключевые слова: штамм-продуцент, рекомбинантный белок, ß2-микроглобулин мыши и ß2-ми-кроглобулин человека
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: государственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.
Для цитирования: Каркищенко В.Н., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Нестеров М.С. Получение дифференцированных рекомбинантных белков ß2-микроглобулина человека и ß2-микроглобулина мыши для его детектирования в химерных молекулах HLA I класса. Биомедицина. 2024;20(2):21-31. https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-21-31
Поступила 19.03.2024
Принята после доработки 29.04.2024
Опубликована 10.06.2024
PREPARATION OF DIFFERENTIATED RECOMBINANT HUMAN ^-MICROGLOBULIN AND MOUSE ^-MICROGLOBULIN PROTEINS FOR ITS DETECTION IN CLASS I HLA CHIMERIC MOLECULES
Nikolay N. Karkischenko1, Vadim A. Ezerskiy2*, Elena M. Koloskova2, Maxim S. Nesterov1
1 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1
2All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst 249013, Russian Federation, Kaluga Region, Borovsk, Institute Village
Transgenic humanized animals are increasingly in demand for biomedical research and pharmacological testing. More and more lines of transgenic animals are being created, including those with knockout of their own genes. There is an urgent need for an evidence base for the integration of a transgene, its expression, determination of the knockout state of its own gene at the molecular genetic level, detection of translation of the target protein in different organs and tissues, proof for the absence of protein synthesis (or its non-functionality), the gene of which has been modified. This requires highly specific reagents, proteins and antibodies to them in particular, the vast majority of which are presented by foreign manufacturers. The task was set to identify mouse and human p2-microglobulin in protein fractions of organs and tissues of transgenic and knockout mice of several HLA lines created in recent years at the Scientific Center of Biomedical Technologies, Russia. At the first stage of our research, recombinant E. coli producing strains were obtained.
Keywords: producer strain, recombinant protein, mouse p2-microglobulin and human p2-microglobulin Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Funding: the research topic "Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex" (code: "Transknockout-2024") of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of Russia.
For citation: Karkischenko V.N., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Nesterov M.S. Preparation of Differentiated Recombinant Human P2-Microglobulin and Mouse P2-Microglobulin Proteins for its Detection in Class I HLA Chimeric Molecules. Journal Biomed. 2024;20(2):21-31. https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-21-31
Submitted 19.03.2024 Revised 29.04.2024 Published 10.06.2024
Введение ется и в России: создается всё больше линий
Получение трансгенных (ТГ) гуманизи- трансгенных животных, в т.ч. и с нокаутом
рованных животных с интегрированными собственных генов [7, 8, 11]. В связи с этим
генами человека, экспрессирующими че- становится остро необходимой доказатель-
ловеческие белки, стало неотъемлемой ча- ная база не только интеграции трансгена,
стью биомедицинских исследований, фар- его экспрессии, определение состояния
макологических испытаний во всем мире нокаута собственного гена на молекулярно-
[4-6, 13]. Это направление научных иссле- генетическом уровне, но и детекция транс-
дований в последние годы активно развива- ляции целевого белка в разных органах
и тканях, доказательство отсутствия синтеза белка (или его нефункциональность), ген которого был модифицирован.
В последние годы в НЦБМТ ФМБА России были созданы несколько линий трансгенных мышей с геном HLA I класса в той или иной форме: «нативной», «гибридной» (согласно определениям, принятым в классической работе Боренштейна [10]), «химерной» [3, 8]. Первые линии наших трансгенных HLA-мышей были получены с использованием простых генетических конструкций: «нативная» генетическая конструкция (ГК) представляла собой непосредственно ген HLA I класса — с собственными фланкирующими последовательностями, со всеми экзонами и интронами; в «гибридной» ГК З'-половина гена (кодирующая аЗ-домен, трансмембранную и ци-топлазматическую части белка HLA) была заменена соответствующей частью гена Н2 мыши (данные не опубликованы). В стабилизации кодируемого интегрированным трансгеном белка у этих линий мышей участвует эндогенный р2-микроглобулин. К настоящему времени нами получены ТГ мыши, позиционирующие на клеточных мембранах сложные «химерные» белки: к а1-домену цепи «гибридного» белка гибким линкером «пришит» Р2-микроглобулин человека, обеспечивающий дополнительную «человечность» анти-генпрезентирующим иммунным механизмам. В виварии НЦБМТ ФМБА России успешно поддерживается линия HLA-A*02:01 [3, 7, 8], с использованием новой ГК HLA-C*07:02 [2] получена новая ТГ линия. У мышей новых линий необходимость присутствия собственного р2-микроглобулина мыши (mp2mg) в комплексе с тяжелой химерной цепью обесценилась: место надёжно занято р2-микроглобулином человека (hp2mg). Следующий логический шаг в создании HLA трансгенных мышей — обеспечить отсутствие эндогенного mp2mg — нами сделан: получены линии, обладающие вторым признаком — нокаутом гена m@2mg
(материалы готовятся к печати). Поскольку Р2-микроглобулину принадлежит очень важная роль в стабилизации антигенпре-зентирующего комплекса на поверхности клеток, детекция присутствия hp2mg (в составе химерной молекулы), отсутствия синтеза эндогенного mp2mg для нокаутных по этому белку мышей является важным этапом верификации созданных и создаваемых линий.
Практически все высокочувствительные и точные методы обнаружения белков не обходятся без использования антител к ним. Разработано огромное количество тест-систем для обнаружения практически любого белка. Главной проблемой является то, что их подавляющее большинство — иностранного производства за соответственно высокую цену. Например, стоимость ИФА-набора (планшет на 96 лунок) для определения P2mg мыши производства Cloud-Clone Corp. (США) составляет более 80000 руб., аналогичный набор для определения b2mg человека стоит около 60000 руб. (информация сайта https://белкиантитела. рф/product/SEA260Hu/ на апрель 2024 г.). В этих наборах используются рекомбинант-ные видоспецифичные P2mg и поликло-нальные антитела к ним. Стоимость: 1 мг hp2mg — 200000 руб., а поликлональных кроличьих антител к нему — 60000 руб.
Развитие отечественной науки невозможно без создания и развития собственного парка производства реактивов и субстанций для научных и прикладных задач. Разработка рекомбинантных белков (РБ), в т.ч. и с целью получения антител к ним, — одно из направлений комплексного решения научных задач с использованием таких высокочувствительных методов, как вес-терн-блот, иммуногистохимия, иммуноци-тохимия, иммунопреципитация.
Для идентификации mp2mg и hp2mg в белковых фракциях органов и тканей трансгенных и нокаутных мышей были поставлены следующие задачи:
1. Разработать рекомбинантные плазми-ды для экспрессии mß2mg и hß2mg в бактериальном штамме-продуценте.
2. Получить штаммы-продуценты, подобрать условия их культивирования и полученных штаммов. Проверить эффективность индукции синтеза рекомбинантных белков mß2mg и hß2mg.
3. Подобрать условия очистки и наработать mß2mg и hß2mg в количествах, необходимых для иммунизации животных.
Материалы и методы
Плазмида. Синтезированные нуклеотид-ные последовательности mß2mg и hß2mg, оптимизированные по коду для экспрессии в бактериальных системах (табл. 1), были клонированы в плазмиду-вектор pET-28а(+) (ООО «Евроген», Россия).
Штамм E. coli BL21 DE3, генотип: fhuA2 [lon] ompT gal (l DE3) [dcm] AhsdS l DE3 = l sBamHIo AEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7 genel) i21 Anin5 (New England Biolabs).
Трансформация. Полученными плаз-мидами pET-28a(+)/hß2mg и pET-28a(+)/ mß2mg трансформировали компетентные клетки E. coli BL21 (DE3) по методике производителя (New England Biolabs), клетки выращивали на среде LB с агаром (1,5%) и канамицином (60 мкг/мл) при 37°C.
ПЦР. Выросшие клоны проверяли на наличие плазмид методом ПЦР с использованием пар праймеров pET28-f/ Humb2-r и pET28-f/Musb2-r, где pET28-f (5'-CCCGCGAAATTAATACGAC-3') — прай-мер, специфичный к плазмидному вектору, Humb2-r (5'-GACTCAAGGTGAC ATGGTTG-3') и Musb2-r (5'-CAGCCATG CTCGCATGTTTC-3') — праймеры, специфичные к вставке (нуклеотидная последовательность РБ).
Культивирование штаммов-продуцентов. Проверенные ПЦР колонии переносили в 5 мл жидкой среды LB (триптон, 10 г/л; экстракт дрожжей, 5 г/л; NaCl, 10 г/л) c канамицином (60 мкг/мл), инкубировали
в течение ночи при 37°С. По 1 мл ночной культуры вносили в 100 мл LB с антибиотиком, колбы помещали в термошейкер, выращивали в течение нескольких часов. При достижении суспензией оптической плотности (ОП) 0,1-0,6 о.е. (^595) индуцировали экспрессию РБ добавлением 0,25 М спиртового раствора изопропил-Р-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до 1 мМ. Культивировали еще в течение нескольких часов. После окончания инкубации клетки осаждали центрифугированием, промывали р-ром ФБС, центрифугировали повторно и осадок замораживали до использования.
Очистка РБ. Суспензию центрифугировали. Осадок отбирали для проведения ПААГ электрофореза. Клетки ресуспен-дировали в лизирующем буфере (50 тМ NaH2PO4, 300 тМ №С1, 10 тМ имидазол, рН=8,0), охлаждали на льду, вносили ли-зоцим до 1 мг/мл, инкубировали на льду 30 мин, суспензию обрабатывали ультразвуком, после чего центрифугировали при 10000 g, 10°С, 35 мин. Для электрофореза полиакриламидным гелем (ПААГ) отбирали пробу надосадочной жидкости.
Осадок ресуспендировали в буфере С-20 (20 мМ Трис-НС1, 0,5 М №С1, 8 М мочевина, 20 мМ имидазол, 5 мМ 2-меркаптоэ-танол, рН=7,9), обрабатывали ультразвуком. Центрифугировали при 10000 g, 10°С, 35 мин. В колонку с №-сефарозой, уравновешенную буфером С-20, вносили осветленный лизат. Носитель со связанным белком промывали тем же буфером до выхода оптической плотности (ОП) на плато (280 нм). Связанный с носителем РБ снимали буфером С возрастающим содержанием имидазола 50, 200 и 500 мМ, собирали фракции с различной ОП до ее минимальных значений. На каждом этапе отбирали пробы для оценки качества РБ ПААГ электрофорезом.
Электрофорез (ЭФ) ПЦР-ампликонов осуществлялся в 0,8% агарозном геле в ТВЕ (Трис-боратный ЭДТА, 0,5х) буфере. Полосы ДНК визуализовали с помощью
интеркалирующего красителя (бромистого этидия) в трансиллюминаторе при ультрафиолетовом свете (УФ).
Для проведения белкового ЭФ образцы нормализовали по содержанию белка. В зависимости от ОП меньший или больший объём пробы смешивали в соотношении 1:1 с 2х буфером для образцов (БО) (4% додецилсульфата натрия (SDS), 10% 2-меркаптоэтанол, 20% глицерин, 0,125 М Трис-HCl, рН=6,8, бромфеноловый синий 0,1%). Прогревали при 95°С. В лунку концентрирующего геля наносили по 15 мкл подготовленного образца. ЭФ проводили в ПААГ-SDS (12,5% — разделяющий и 4% — концентрирующий гель). Гель окрашивали (0,125% кумасси R250; уксусная кислота 10%; метанол 50%), последовательно отмывали (50% метанол, 10% уксусная кислота и 5% метанол, 7% уксусная кислота) (табл. 3, рис. 2). В качестве маркеров длин ДНК использовалась GeneRuler 1 kb DNA Ladder ("Invitrogen", США), для оценки размера рекомбинантных белков использовали маркеры молекулярной массы Precision Plus Protein Unstained, 10-250 кДа ("Bio-Rad", США).
Результаты и их обсуждение
Были получены плазмиды pET-28/ mß2mg и pET-28/hß2mg для экспрессии РБ mß2mg и hß2mg в бактериальных культурах. Из кДНК эукариотических генов не всегда можно получить ГК, хорошо экс-прессирующую в E. coli, что обусловлено различной частотой встречаемости тРНК для различных кодирующих триплетов у эукарит и прокариот. Поэтому для экспрессии эукариотических генов в прокари-тах создают искусственный ген, в котором аминокислотная последовательность эу-каритического белка (например, ß2mg) будет кодироваться триплетами, предпочтительными для экспрессии в E. coli. Анализ синтетической последовательности кодо-нов РБ mß2mg и hß2mg в Е. coli был выве-
рен в программе Rare Codon Caltor (http:// people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html).
Описание нуклеотидных последовательностей и кодируемых ими РБ приведено в табл. 1. Схема плазмиды pET-28a(+)-hb2mg представлена на рис. 1.
Потенциальные физико-химические свойства РБ были вычислены с использованием программы PROTPARAM (https:// www.protparam.net/index.html) (табл. 2).
Алифатический индекс белка связан с количеством и качеством гидрофобных аминокислотных (АК) остатков: чем он больше, тем выше термостабильность глобулярных белков. Значение GRAVY связано с гидрофобностью: положительная величина свидетельствует о более высокой гидрофобности [1].
Как следует из табл. 2, рекомбинантные mß2mg и hß2mg имеют некоторую разницу в физико-химических свойствах, обусловленную межвидовыми различиями АК
Рис. 1. Плазмида pET-28a (+)/hb2mg для экспрессии рекомбинантного hfî2mg в клетках E. coli. Структура плазмиды pET-28a (+)/mb2mg для экспрессии рекомбинантного mfî2mg идентична.
Fig. 1. pET-28a (+)/hb2mg plasmid for the expression of recombinant hfi2mg in E. coli cells. The structure of the pET-28a (+)/mb2mg plasmid for the expression of recombinant mfi2mg is identical.
клонирования в плазмиду-вектор pET-28a(+); красным — триплет стоп-кодона; жёлтым выделены последовательности, соответствующие ß2-микроглобулину; голубым — теги гексагистидина; зелёным — тромбиновый
Note: the restriction sites NdeI andXhoI for cloning into the plasmid vector pET-28a(+) are highlighted in italics in the nucleotide sequence; the stop codon triplet is highlighted in red; the sequences corresponding to ß2 microglobulin are highlighted in yellow; hexahistidine tags are highlighted in blue; the thrombin site is highlighted in green.
Таблица 2. Физико-химические свойства РБ mß2mg и hß2mg
Table 2. Physico-chemical properties of mß2mg and hß2mg recombinant proteins
Таблица 1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности рекомбинантных ß2-микроглобулинов мыши и человека
Table 1. Nucleotide and amino acid sequences of recombinant mouse and human ^-microglobulins
Параметр pET-28/hß2mg pET-28/mß2mg
Клонированная в рЕТ-28а(+) синтетическая оптимизированная нуклеотидная последовательность CATATGTCACGCAGTGTTGCACTTGCT GTGCTTGCGTTGTTGAGCTTGAGTGGCT TAGAAGCGATTCAACGCACTCCGAAGAT TCAGGTGTACAGCCGTCATCCTGCTGAGAAT GGCAAGAGCAACTTTCTGAACTGCTACGTA AGTGGCTTTCATCCGTCTGACATTGAAGT GGATCTTCTGAAAAATGGTGAACGCATT GAGAAAGTGGAACATAGTGATCTGAGCTTCTC CAAAGACTGGAGCTTCTATCTcTTGTACTA CA CTGAGTTCACACCGACTGAGAAAGATGAG TATGCGTGTCGTGTcAACCATGTCACCTTGAGT CAACCGAAGATTGTGAAGTGGGATCGTGACAT GCATCACCACCATCATCACTAACTCGAG CATATGGCACGCTCTGTGACCTTGGT GTTTCTTGTGTTAGTCAGTCTGACTG GCTTGTATGCGATTCAGAAGACTCCT CAGATTCAGGTGTACAGTCGT CATCCTCCTGAGAATGGCAAAC CGAACATTCTGAACTGCTACGTAACT CAGTTTCATCCTCCTCACATTGAGAT TCAGATGCTGAAGAATGGCAAGAAGA TTCCGAAAGTGGAGATGAGTGACAT GTCCTTCAGCAAAGACTGGAGCTTC TACATTCTTGCTCATACAGAGTTCACTC CGACTGAGACCGATACCTATGCGTGTC GTGTGAAACATGCGAGCATGGCTGAAC CGAAGACCGTGTACTGGGATCGTGACAT GCATCACCACCATCATCACTAACTCGAG
Аминокислотная последовательность рекомби-нантного белка mgsshhhhhhssgUprGBhmsrsvalav LALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSN FLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHS DLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVN HVTLSQPKIVKWDRDMHHHHHH mgsshhhhhhssgLVprGBhmarsvtlv FLVLVSLTGLYAIQKTPQIQVYSRHP PENGKPNILNCYVTQFHPPHIEIQMLK NGKKIPKVEMSDMSFSKDWSFYILA HTEFTPTETDTYACRVKHASMAEPKTVY WDRDMHHHHHH
Соответствие последовательности белка р2тд базе NCBI NP_004039.1 NP_033865.2
Примечание: курсивом в нуклеотидной последовательности выделены сайты рестрикции NdeI и Х^1 для
Параметр Hß2M REC Mß2M REC
Аа 145 145
MW 16700.6895 16765.1035
PI 7.06 (7.14) 8.92(8.98)
aliphatic index 75.24 67.17
GRAVY -0.606 -0.550
Extinction Coefficient 19940 19940
1mg/ml (59.878 uM) solution A280 nm 1.20 1.20
последовательностей р2-микроглобулина. Сравнение АК последовательностей (рис. 2) показывает довольно существенную разницу в АК составе (32% отличия), при этом имеются участки с очень высокой степенью несовпадения (например, фрагмент на С-конце молекулы). Это даёт нам весомые основания полагать, что спектры по-ликлональных антител, вырабатываемых
на mß2mg и hß2mg, как антигены при иммунизации животных будут иметь отличия благодаря несовпадающим эпитопам: в результате технологических манипуляций появляется возможность получения видоспе-цифических антител к ß2mg.
Для наработки РБ в качестве штамма-продуцента использовали E. coli BL21 (DE3). Штаммы E. coli линии B (BL21
Рис. 2. Сравнение АК последовательностей mfi2mg (sbjct) и hfi2mg (query). Идентичность — 68%. Точки соответствуют совпадениям, красные буквы — отличия. Сравнения последовательностей выполнены в онлайн-приложении BLAST для нуклеиновых кислот и белков (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Fig. 2. Comparison of amino acid sequences of mouse fi2-microglobulin (sbjct) and human fi2-microglobulin (query). Identity — 68%. The dots correspond to the matches; the red letters are the differences. Sequence comparisons were performed in the BLAST online application for nucleic acids and proteins (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
и др.) не обладают жгутиками, хорошо растут и дают больший выход биомассы клеток. Клетки этой линии лучше усваивают глюкозу из среды, при культивировании образуют меньше уксусной кислоты даже при высокой концентрации глюкозы в среде. Больший выход РБ также обусловлен меньшей деградацией экспрессируемых белков во время выделения и очистки из-за меньшего содержания в бактериях про-теолитических ферментов (lon и ompT). E. coli BL21 (DE3) имеет интегрированный в хромосому лизоген DE3, À-профаг, содержащий ген РНК-полимеразы фага Т7, обладающей высокой скоростью транскрипции, под контролем промотора lacUV5. Экспрессирующие векторы серии рЕТ содержат Т7-промотор, ниже которого находится нуклеотидная последовательность белка. Транскрипция с промотора lac UV5 активируется IPTG (изопропил ß-D-1 тио-галактопиранозидом [14, 15].
При работе с несколькими штаммами-продуцентами гомологичных белков возникает необходимость верификации продуцентов. Использование в составе пар праймеров при проведении ПЦР-анализа видоспецифического «белкового» прай-мера и праймера, специфичного к плаз-мидному вектору (пары pET28-f/Humb2-r и pET28-f/Musb2-r), позволяет надежно идентифицировать штамм-продуцент: в нашем случае ампликоны размером 482 п.н.
для каждой пары праймеров визуализируются в агарозном геле.
Одна из проблем получения рекомбинантных белков в клетках Е. соИ при интенсивном синтезе — образование нерастворимых телец включения, состоящих из агрегатов РБ и примеси бактериальных белков [9]. С другой стороны, при выделении РБ из телец включения в жестких денатурирующих условиях, например с использованием буферов с высоким содержанием мочевины (до 8 М), белок остается пригодным для иммунизации и получения антител [14]. Напротив, для использования РБ в качестве акцептора на сорбенте для аффинной хроматографии потребуется очистка белка, например диализом. Наличие в РБ полигистидино-вой последовательности (6хН^) позволяет производить очистку белка с помощью №-сефарозы. Добавление небольшого количества имидазола, конкурента гистидина в связях с никелем, в связывающий и промывочный буферы снижает возможность неспецифического взаимодействия посторонних белков с М-сорбентом. Для снятия белка с сорбента используют буфер с возрастающей концентрацией имидазола — до 0,5М.
ПААГ ЭФ белковых образцов показал отсутствие синтеза РБ в неиндуцирован-ной ИПТГ культуре и интенсивную наработку белка после индукции: в белковом
27
Таблица 3. Образцы для ПААГ электрофореза Table 3. Samples for PAAG electrophoresis
Дорожка Образец Дорожка Образец
Рекомбинантный mp2mg Рекомбинантный hp2mg
1 Клон 1 — неиндуцированный 1 Неиндуцированный
2 Клон 1 — после индукции IPTG 2 Лизат осадка тотальный, после центрифугирования
3 Клон 2 — не индуцированный 3 Осадок, растворенный в буфере для нанесения на колонку
4 Клон 2 — после индукции IPTG 4
5 Пик 1 — основной, связавшийся и смытый белок 5 Разные пики и «хвосты» после снятия с колонки
6-8 Фракции 2-4 (хвосты) пика 1 6-8
9 Проскок 9 Проскок
10 Маркер молекулярных масс 10 Маркер молекулярных масс
Рис. 3. Результаты ПААГ-электрофореза. 15% ПААГ-SDS. Оценка индукции экспрессии и очистки рекомби-нантного mfi2mg (слева). Описание в табл. 3. Стадии наработки и очистки рекомбинантного hfi2mg (справа). Fig. 3. Results of PAAG electrophoresis. 15% PAAG-SDS. Evaluation of the induction of expression and purification of recombinant mfi2mg (left). Description is given in Table 3. Stages of development and purification of recombinant hfi2mg (right).
ассортименте клеточного лизата хорошо заметна новая полоса размером около 16 кДа, соответствующая рассчитанной молекулярной массе РБ (табл. 3, рис. 3).
Фракции очищенного РБ собирали, концентрацию белка определяли методом Брэдфорд, растворы РБ хранили при +4-8°С до дальнейшего использования.
Заключение
Актуальность создания отечественной базы реактивов и компонентов для аналитических исследований в фундаментальной и прикладной молекулярной биологии, генетике, фармакологии не вызывает сомнений. Особенно остро это касается вери-
фикации функциональности всё большего разнообразия трансгенных гуманизированных животных, в т.ч. и с нокаутом собственных генов. С использованием моле-кулярно-генетических методов анализа требуется доказать интеграцию трансгена в геном животного, наличие полезных генетических модификаций целевого гена, наличие/отсутствие экспрессии мРНК в органах и тканях животного. В большинстве случаев даже положительные результаты ПЦР-анализа, генетического секвениро-вания, определение уровня экспрессии не являются окончательным вердиктом пригодности созданной линии трансгенных животных своему предназначению.
Именно подтверждение синтеза человеческих белков в соответствующих органах и тканях трансгенного гуманизированного животного, отсутствие целевого белка нокаутированного гена или, в ряде случаев, доказательство потери его функциональности является обоснованием «профпригодности» новой линии. Как правило, для такого рода исследований требуются методы с приставкой «иммуно»: имму-ноферментный анализ, иммуноцитохи-мия, иммуногистология, иммуноблоттинг во всех его проявлениях.
Нами были созданы несколько линий трансгенных гуманизированных НЬА-мы-шей, функциональность которых требует подтверждения наличия р2-микроглобулина человека в составе химерного белка (продукта синтеза трансгена — тяжелая моноцепь, состоящая из цитоплазматической, трансмембранной части, а3-домена мышиного Н2, антигенпрезентирующих а2-и а1-доменов белка НЬА, и р2-микро-глобулина человека, гибкой цепью «пришитого» к а1). Это мыши линии НЬА-А*02:01 [3, 7, 8], подтверждённой уже в нескольких поколениях, мыши новой создаваемой линии НЬА-С*07:02 [2], ожидающей верификации, а также на их основе — линии с двумя генетическими признаками: НЬА-трансген и нокаут р2-микроглобулина. Как у полученных мышей с одним только признаком трансгенности ^А/В2т+'+, так и у мышей с двумя признаками ^А/В2т-/- наличие/отсутствие р2-микро-
глобулина человека и мыши придётся подтверждать не только молекулярно-генети-ческими, но и специфическими методами вариаций иммунного анализа. Анализ коммерческих предложений импортного происхождения убедил нас в необходимости и возможности получения собственных компонентов для создания иммунологических методов исследования — гомологичных рекомбинантных белков и поликлональ-ных антител к ним. Биоинформационный анализ аминокислотных последовательностей mß2mg и hß2mg с использованием он-лайн-приложений позволил предположить возможность получения видоспецифичных антител, обладающих минимальной перекрёстной реакцией при применении продуманных методов очистки поликлональных антител.
На первом, исходном этапе наших исследований в новом направлении — использовании собственных возможностей участия в создании насущно необходимой и независимой отечественной базы реагентов для тонких биологических, иммунохимиче-ских, фармакологических исследований — были получены штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных ß2-микроглобулина мыши и человека. Нуклеотидные последовательности генов были адаптированы для синтеза в бактериальной системе, ре-комбинантные белки — mß2mg и hß2mg — очищены и наработаны в количествах, необходимых для получения аффинных сорбентов и иммунизации животных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Богомолова Т.Г., Добровольская О.А., Миров-ская А.А., Аль-Шехадат Р.И., Федорова Е.А., Духовлинов И.В., Симбирцев А.С. Разработка кандидатной субстанции рекомбинантного белка CRM197. Эпидемиология и вакцинопрофилакти-ка. 2016;15(1):93-98. [Bogomolova E.G., Dobro-vol'skaya O.A., Mirovskaya A.A., Al-Shehadat R.I., Fedorova E.A., Dukhovlinov I.V., Simbirtsev A.S. Razrabotka kandidatnoj substancii rekombinantno-go belka CRM197 [Development of pharmacology
grade substance of recombinant protein CRM197]. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika [Epidemiology and vaccinal prevention]. 2016;15(1):93-98. DOI: 10.31631/2073-3046-2016-15-1-93-98.
2. Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-C*07:02:01:01, как прообраз инновационных
трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8-20. [Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principy sozdaniya genno-inzhenernoj konstrukcii dlya polucheniya gu-manizirovannyh transgennyh myshej, nesushchih gen HLA-C*07:02:01:01, kak proobraz innova-cionnyh transgenno-nokautnyh biomodelej [Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels]. Biomedicina Journal Biomed]. 2024;20(1):8-20. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-20-1-8-20.
3. Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10-23. [Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibritnih DNK-konstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2021;17(1):10-23. (In Russian)]. DOI: 10.33647/20745982-17-1-10-23.
4. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4-22. [Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gu-manizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologich-eskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxico-logical research (successes, failures and prospects)]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2014;1(3):4-22. (In Russian)].
5. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4-17. [Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubitsyna T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennykh myshej s in-tegrirovannymi genami N-atsetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular and genetic aspects of the technology for producing transgenic mice with integrated genes of human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2)]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:4-17. (In Russian)].
6. Кит О.И., Максимов А.Ю., Протасова Т.П., Гончарова А.С., Кутилин Д.С., Лукбанова Е.А. Гумани-зированные мыши: методы получения, модели и использование в экспериментальной онкологии (обзор). Биомедицина. 2019;15(4):67-81. [Kit O.I., Maksimov A.Yu., Protasova T.P., Gon-charova A.S., Kutilin D.S., Lukbanova E.A. Guma-nizirovannye myshi: metody polucheniya, modeli i ispol'zovanie v eksperimental'noj onkologii (ob-zor) [Humanized Mice: Creation, Models and Use in Experimental Oncology (Review)]. Biomedicina Journal Biomed]. 2019;15(4):67-81. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-15-4-67-81.
7. Петрова Н.В., Скрипкина М.М. Особенности организации содержания и выведения трансгенных линий мышей в НЦБМТ ФМБА России. Биомедицина. 2021;17(3E):70-75. [Petrova N.V., Skripkina M.M. Osobennosti organizacii soderzhaniya i vyvedeni-ya transgennyh linij myshej v NCzBMT FMBA Rossii [Maintenance and Breeding of Transgenic Mouse Strains at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the FMBA of Russia]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2021;17(3E):70-75. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2713-0428-17-3E-70-75.
8. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10-23. [Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgen-noj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological Aspects of Creation a New Humanized Transgenic Mice with Integrated Human HLA-A*02:01:01:01 Gene]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10-23. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-18-4-10-23.
9. Baneyx F., Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 2004;22:1399-1408.
10. Borenstein S.H., Graham J., Zhang X.L., Chamberlain J.W. CD8+ T cells are necessary for recognition of allelic, but not locus-mismatched or xeno-, HLA class I transplantation antigens. J. Immunol. 2000;165(5):2341-2353. DOI: 10.4049/jimmunol.165.5.2341.
11. Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-Target CRISPR/Cas9 Activity Can Cause Undesigned Large Deletion in Mouse Zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:3604. DOI: 10.3390/ijms21103604.
12. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 1996;60(3):512-538. DOI: 10.1128/mr.60.3. 512-538.1996.
13. Masemann D., Ludwig S., Boergeling Y. Advances in Transgenic Mouse Models to Study Infections by Human Pathogenic Viruses. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(23):9289. DOI: 10.3390/ijms21239289.
14. Rosano G.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and chal-
lenges. Front Microbiol. 2014;5:172. DOI: 10.3389/ fmicb.2014.00172. 15. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level
expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 1986;189(1):113-130. DOI: 10.1016/0022-2836(86)90385-2.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Каркищенко Владислав Николаевич, д.м.н., проф., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Vladislav N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Езерский Вадим Аркадьевич*, Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста»; e-mail: [email protected]
Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста»;
e-mail: [email protected]
Нестеров Максим Сергеевич, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: [email protected]
Vadim A. Ezerskiy*, All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst; e-mail: [email protected]
Elena M. Koloskova, Cand. Sci. (Biol.), All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — Branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after Acad. L.K. Ernst; e-mail: [email protected]
Maxim S. Nesterov, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
