CC BY
19
УДК 57: 579.2
Ключевые слова: бактерии, штамм, первичная идентификация, бактерии-ассоцианты, краситель, индикатор
Key words: bacteria, strain, primary identification, bacterium-associates, dye, indicator
Семанин А.Г., Садртдинова Г.Р.
ПОВЫШЕНИЕ СЕЛЕКТИВНЫХ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЛОТНОЙ АГАРОВОЙ СРЕДЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА FLA VOBACTERIUM
THE INCREASING OF SELECTIVE AND DIFFERENTIAL-DIAGNOSTIC PROPERTIES OF A DENCE AGAR MEDIUM FOR EXCRETION OF GENUS FLAVOBACTERIUM BACTERIA
ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный агарный университет им. П. А. Столыпина» Адрес: 432017, г. Ульяновск, б. Новый Венец, д. 1
Ulyanovsk State Agrarian University named after. P.A. Stolypin, Federal State Budget Institution of Higher Education
Address: 432017, Ulyanovsk, blvrd Novii Venez, 1
Семанин Антон Геннадьевич, аспирант каф. микробиологии, вирусологии, эпизоотологии
и ветеринарно-санитарной экспертизы
Semanin Anton G., Post-Graduate Student of the Microbiology, Virology, Epizootology and Veterinary Sanitary Expertise Садртдинова Гузелия Рафиковна, ассистент. Тел. (8422) 55-95-47. Е-mail: sadrtdinova-guzlik@yandex.ru Sadrtdinova Guzelia R., Assistant. Tel. +7 8422 55-95-47. E-mail: sadrtdinova-guzlik@yandex.ru
Аннотация. В статье представлены результаты исследований, связанных с подбором оптимального состава плотной агаровой среды для выделения и первичной идентификации бактерий рода Flavobacterium. В работе использовались референс-штаммы бактерий рода Flavobacterium: Flavobacteriumpectinovorum VKMB-1171, Flavobacterium aquatile VKPMB-8534, Flavobacterium johnsoniae VKMB-1426. Все результаты исследований сравнивались с результатами, полученными по штаммам Pseudomonas aeruginosa 13 и Aeromonas hydrophila 216. Данные микроорганизмы являются бактериями-ассоциантами изучаемого микроорганизма, являются возбудителями аналогичных заболеваний у рыб и часто выделяются в совокупности. Первый этап исследований был связан с подбором компонентов для питательной основы конструируемой среды. С этой целью были осуществлены посевы изучаемых штаммов на набор сред, широко используемых в лабораторной практике: «Enriched Anacker and Ordal medium», мясопептонный агар, ВКПМ № 70, Hsu-Shotts. Второй этап исследований заключался в изучении устойчивости штаммов F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile и возможных бактерий-ассоциантов к различным индикаторам: конго-красный, сафранин, бромкрезоловый пурпурный, Нильсона синий, Кристенсена фиолетовый, метиленовый оранжевый, метиленовый красный, метиленовый синий, метиленовый зеленый. Выбор красителей основывался на широко проведенном литературном обзоре. В результате исследований была отобрана питательная основа среды - «Enriched Anacker and Ordal medium» и подобрана индикаторная рН-система, состоящая из красителя бромкрезолового пурпурного и сахара-глюкозы. Оценку специфичности и эффективности роста изучаемого микроорганизма проводили в сравнении с бактери-ями-ассоцинатами. Полученные данные свидетельствуют о том, что сконструированная нами дифференциально-диагностическая питательная среда обладает специфичностью в отношении представителей рода Flavobacterium - видов F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile, что значительно облегчает их первичную идентификацию. Summary. The article presents the results of the study related with selection of dense agar medium optimal composition for the genus Flavobacterium isolation and primary identification. The genus Flavobacterium reference strains: Flavobacterium pectinovorum VKMB-1171, Flavobacterium aquatile VKPMB-8534, Flavobacterium johnsoniae VKMB-1426 were used in this work. All the results of the studies were compared with the results obtained with the strains Pseudomonas aeruginosa 13 and Aeromonas hydrophila 216. These microorganisms are bacteria-associates to studied bacteria, they are the causative agents of similar fish diseases and they are often isolated in aggregate. The research first stage was related with selection of components for the medium nutrient base. Studied strains cultures were sown on widely used in laboratory media sets: Enriched Anacker and Ordal medium, meat-peptone agar, VKPM № 70, Hsu-Shotts. The second study stage examined the resistance of the strains: F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile and possible bacteria-associates to various indicators: congo-red, safranin, bromocresol purple, Nilsson blue, Christensen violet, methylene orange, methylene red, methylene blue, methylene green. Dye selection was based on widely conducted literature review. As a result of the studies, the Enriched Anacker and Ordal medium and an indicator pH system containing bromocresol purple and sugar-glucose were selected. Microorganisms specificity and growth efficiency were studied in comparison with the bacteria-associates. The obtained data indicate that the differential-diagnostic nutrient medium constructed by us has specificity for representatives of the genus Flavobacterium species: F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile, what do their primary identification more easily.
Введение
В условиях активного развития аквакуль-туры широкое распространение приобрели бактериальные заболевания рыб, вызываемые оксидазоположительными бактериями рода Aeromonas, Pseudomonas и, все чаще, -Flavobacterium [6]. Бактериальные болезни, вызванные бактериями рода Flavobacterium, встречаются во всем мире, преимущественно - у лососевых при искусственном выращивании [3]. Способность бактерий приобретать устойчивость к антибиотикам приводит к быстрому развитию резистентности к лечебным препаратам [7].
Сложность бактериологической идентификации бактерий рода Flavobacterium состоит в том, что в лабораторной практике нет селективной среды, которая наилучшим образом позволила бы провести первичную идентификацию и дифференциацию данного микроорганизма от бактерий-ассоциантов [2]. Сегодня в практике используются среды: «Enriched Anacker and Ordal medium», Hsu-Shotts, МПА, «Van Niel's Yeast Agar», ВКПМ № 70. Основным недостатком перечисленных сред является наличие сходного культурального роста у бактерий рода Flavobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila.
Цель работы заключалась в конструировании дифференциально-диагностической среды для выделения и первичной идентификации бактерий рода Flavobacterium.
Ставились следующие задачи:
- подобрать питательную основу для конструируемой среды;
- провести исследования по изучению устойчивости изучаемых бактерий к различным красителям;
- используя собственные исследования по изучению биохимических свойств, провести работу по введению в подобранный состав питательной среды дополнительных составляющих компонентов, которые позволили бы дифференцировать флавобактерии от бактерий-ассоциантов;
- подобрать оптимальный режим культивирования бактерий рода Flavobacterium на данной среде.
Материалы и методы
В качестве объекта исследований использовали референс-штаммы из музейной коллекции кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновского ГАУ: Flavobacterium pec-tinovorum VKMB-1171, Favobacterium aqua-tile VKPMB-8534, Flavobacterium johnsoniae
4
VKMB-1426. В качестве бактерий-ассоци-антов использовали бактериальные культуры Pseudomonas aeruginosa 13 и Aeromonas hydrophila 216.
Результаты исследований
Первый этап исследований заключался в подборе питательной основы конструируемой среды [1, 4, 5]. С этой целью, были осуществлены посевы изучаемых штаммов на набор сред, широко используемых в лабораторной практике: «Enriched Anacker and Ordal medium», МПА, ВКПМ № 70, Hsu-Shotts (компонентный состав данных сред представлен в таблице 1).
Посевы изучаемых штаммов культивировали при 25 оС в течение (24-72) часов, с фиксацией результатов каждые 24 часа. Данный температурный режим по результатам предыдущих исследований является оптимальным для роста бактерий рода Flavobacterium.
Характеристика роста штаммов на среде «Enriched Anacker and Ordal medium»:
1) F. aquatile VKPMB-8534: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, светло-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
2) F. pectinovorum VKMB-1171: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, тёмно-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
3) F. johnsoniae VKMB-1426: колонии средних размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, тёмно-желтого цвета, с волнистыми краями, консистенция пастообразная;
4) Aeromonas hydrophila 216: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, белого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
5) Pseudomonas aeruginosa 13: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, серого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная.
Характеристика роста штаммов на среде МПА:
1) F. aquatile VKPMB-8534: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
Таблица 1
Составы питательных сред для культивирования флавобактерий, рекомендованные
различными литературными источниками
Компонент среды Среда
Enriched Anacker and Ordal medium МПА ВКПМ №70 Hsu-Shotts Van Niel's Yeast Agar
Триптон, г 5,0 - - 2,0 -
Пептон, г - 1,0 15,0 - -
Желатин, г - - - 3,0 -
Дрожжевой экстракт, г 0,5 - 5,0 0,5 10,0
№-асе1а1е, г 0,2 - - - -
Агар-агар, г 10,0 10,0 15,0 10,0 15,0
№С1, г - 5,0 5,0 - -
СаС12(2Н20) - - - 0,3 -
К2НР04 - - - - 1,0
Ыя804 - - - - 0,5
Дистиллированная вода, мл 1000 1000 1000 1000 1000
гладкая, выпуклая, блестящая, светло-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
2) F. pectinovorum VKMB-1171: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, тёмно-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
3) F. johnsoniae VKMB-1426: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, ярко-желтого цвета, с волнистыми краями, консистенция пастообразная;
4) Aeromonas hydrophila 216: колонии средних размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, белого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
5) Pseudomonas aeruginosa 13: колонии средних размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, серо-зеленого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная.
Характеристика роста штаммов на среде ВКПМ №70:
1) F. aquatile VKPMB-8534: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, светло-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
2) F. pectinovorum VKMB-1171: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, тёмно-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
3) F. johnsoniae VKMB-1426: колонии средних размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, ярко-желтого цвета, с волнистыми краями, консистенция пастообразная;
4) Aeromonas hydrophila 216: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, белого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
5) Pseudomonas aeruginosa 13: колонии средних размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, серо-зеленого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная.
Характеристика роста штаммов на среде Hsu-Shotts:
1) F. aquatile VKPMB-8534: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, светло-желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
2) F. pectinovorum VKMB-1171: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, тёмно-
5
желтого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
3) F. johnsoniae VKMB-1426: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, ярко-желтого цвета, с волнистыми краями, кон -систенция пастообразная;
4) Aeromonas hydrophila 216: колонии мелких размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, белого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная;
5) Pseudomonas aeruginosa 13: колонии средних размеров, форма округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, серо-зеленого цвета, с ровными краями, консистенция пастообразная.
По результатам проведенных исследований, за основу среды был выбран состав среды «Enriched Anacker and Ordal medium».
Второй этап заключался в изучение устойчивости бактерий вида F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile и их возможных ассоциантов к красителям: конго-красный, сафранин, бромкрезоловый пурпурный, Нильсона синий, Кристенсена фиолетовый, метиленовый оранжевый, метилено-вый красный, метиленовый синий, метиле-новый зеленый. Результаты исследований представлены на рисунках 1-8.
Исследования проводили путем добавления данных красителей к установленной питательной основе. Каждый из отобранных красителей добавляли в основу среды. Каждую из опытных чашек засевали штаммами бактерий вида: F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile, Ps.aeruginosa и A. hydrophila. Инкубировали посевы в термостате при 25 оС, результат учитывали каждые 24 часа (до 72-х часов).
Оценка полученных результатов позволила выявить отличия роста исследуемых видов микроорганизмов на разрабатываемой среде с добавлением в неё различных красителей. Для дальнейшей работы был выбран индикатор бромкрезоловый пурпурный. При внесении данного индикатора в состав среды наблюдалось подавление роста бактерий Ps. aeruginosa 13, а у из-
6
учаемых видов флавобактерий наблюдался обильный рост колоний спустя 24 часа при температуре 25 оС. Остальные индикаторы были неэффективны в отношении возможных бактерий-ассоциантов и подавляли рост флавобактерий. Следующим этапом было внесение по отдельности (из расчета 1 г на 1000 мл) в получившиеся составы питательных сред сахаров: дульцит, араби-ноза, галактоза, глюкоза, сахароза и рам-ноза. Выбор данных сахаров был связан с результатами собственных исследований, связанных с изучением биохимических свойств флавобактерий. В ходе исследований в качестве дополнительной составляющей разрабатываемой среды и составляющей индикаторной рН-системы (вместе с красителем) нами была отобрана глюкоза (рис. 9).
При использовании данного сахара и бромкрезолового пурпурного установили, что возможные ассоцианты на среде, такие как Ps. aeruginosa 13, не имеют роста, а у A. hydrophila 216 глюкоза и бром-крезоловый пурпурный изменяют цвет среды с фиолетового на ярко-желтый, ко -лонии мельче по сравнению с изучаемыми видами флавобактерий, у которых наблюдался обильный рост колоний на сконструированной среде, цвет среды флаво-бактерий не менялся (рис. 9).
Заключение
Принцип действия дифференциально-диагностической среды определяется взаимодействием изучаемых видов флавобактерий с введённым в выбранный нами состав среды индикатора бромкрезоловый пурпурный и моносахарида глюкозы. На среде отмечается обильный рост бактерий видов F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile. Подобранный в ходе исследований состав среды позволяет ингибировать рост возможных ассоци-антов и провести эффективную первичную идентификацию. Полученные данные позволяют заключить, что сконструированная нами дифференциально-диагностическая среда обладает специфичностью в отношении F. johnsoniae, F. pectinovorum, F. aquatile и значительно облегчает их идентификацию.
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 2 (38), 2018
Рис. 1. Рост на отобранной основе среды с конго-красным (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426; 3 - F. aquatile VKPMB-8534; 4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
Рис. 2. Рост на отобранной основе среды с метиленовым красным (24 часа, 25оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426; 3 - F. aquatile VKPMB-8534; 4 -A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
Рис. 3. Рост на отобранной основе среды с сафранином (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426;
3 - F. aquatile VKPMB-8534;
4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeru-ginosa 13.
Рис. 4. Рост на отобранной основе среды с Кристенсен фиолетовым (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426; 3 - F. aquatile VKPMB-8534; 4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
Рис. 5. Рост на отобранной основе среды с бромкрезоловым пурпур-нымоС): (24 часа, 25 оС): 1 - F pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426; 3 - F. aquatile VKPMB-8534; 4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
Рис. 6. Рост на отобранной основе среды с Нильсен синим (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426;
3 - F. aquatile VKPMB-8534;
4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps.aerugino-sa 13.
Рис. 7. Рост на отобранной основе среды с метиленовым оранжевым (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426; 3 - F. aquatile VKPMB-8534; 4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
Рис. 8. Рост на отобранной основе среды с метиленовым зеленым (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. johnsoniae VKMB-1426; 3 - F. aquatile VKPMB-8534; 4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
Рис. 9. Рост изучаемых бактерий на сконструированной среде (24 часа, 25 оС): 1 - F. pectinovorum VKMB-1171; 2 - F. aquatile VKPMB-8534;
3 - F. johnsoniae VKMB-1426;
4 - A. hydrophila 216; 5 - Ps. aeruginosa 13.
7
Список литературы
1. Васильев Д.А. Технология конструирования селективной, транспортной, накопительной сред для Bordetella bronchiseptica : матер. Межд. науч.-пр. конф., посв. 50-летию ВНИИВВиМ. Владимир, 2008. С. 123-126.
2. Викторов Д.А. Результаты изучения биохимических свойств Flavobacterium psychrophilum / Д.А. Викторов, А.П. Воротников, Н.А. Парамонова, Д.А. Васильев // Международный научно-исследовательский журнал. Екатеринбург. 2014. С. 53-54.
3. Парамонова Н.А. Роль бактерий Flavobacterium psychrophilum в патогенезе рыб / Н.А. Парамонова, Д.А. Викторов, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве. Саратов, 2013. С. 93-95.
4. Садртдинова Г.Р., Ляшенко Е.А., Васильев Д.А. Изучение культуральных свойств бактерий вида Klebsiella oxytoca : матер. Межд. науч.-пр. конф. «Био-
технология: реальность и перспективы». Саратов: СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2014. С. 193-196.
5. Садртдинова Г.Р. Эффективность использования гектоенового энтеро-агара для идентификации бактерий Klebsiella oxytoca : матер. IV-й Межд. науч. конф. «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику». Владимир: ВНИИЗЖ, 2016. С. 134-137.
6. Семанин А.Г. Выделение и типирования Flavobacterium psychrophilum из объектов аквакульту-ры / А.Г. Семанин, Д.Г. Сверкалова, А.И. Калдыркаев [и др.] // матер. VII-й Межд. науч.-пр. конф. «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». Ульяновск: ГСХА им. П. А. Столыпина, 2016. С. 280-283.
7. Семанин А.Г., Пекарская Н.П. Изучение возбудителя флавобактериоза. Инновационная деятельность в модернизации АПК : матер. Межд. науч.-пр. конф. Курск: КГСХФА им. профессора И.И. Иванова, 2017. С. 229-231.
ПРЕДСТАВЛЯЕМ КНИГУ:
«Ультразвуковое и рентгенологическое исследование брюшной полости мелких домашних животных»
Издательство: ЧОУДПО «Институт Ветеринарной
Биологии», Санкт-Петербург, 2016 Тираж: 500 экз.
Формат: 210 х 297 мм, твёрдый переплет, 760 с. с илл.
Данная монография обобщает многолетний опыт работы сотрудников Института Ветеринарной Биологии в области УЗИ и рентгенодиагностики, а также многолетний опыт проведения курсов повышения квалификации для ветеринарных специалистов по УЗИ и рентгенологии. Кроме текстовой информации, изложенной в доступной форме, книга содержит большое количество иллюстрационного материала: оригинальные схемы, облегчающие понимание сложных процессов, сканы ультразвуковых исследований, рентгеновские снимки, фотографии макро- и гистопрепа-ратов.
Одной из отличительных особенностей данного издания является то, что материал, представленный в книге, дан в сравнительном аспекте. Органы и системы, норма и патология описаны с точки зрения УЗИ, рентгеновского исследования и показаны в виде макропрепаратов.
Книга рассчитана на ветеринарных специалистов, работающих в области ультразвуковой и рентгенологической диагностики, на врачей общей практики, а также студентов, планирующих специализацию в области УЗИ и рентгенодиагностики.
Стоимость:
Розничная цена 1 экз. - 9600 руб.
Для оптовых покупателей - система скидок.
Где купить в Санкт-Петербурге:
Институт Ветеринарной Биологии по адресу: ул. Ораниенбаумская, д. 3-Б (ст. м. "Чкаловская") Т. 812 232-55-92 invetbio@mail.ru.
По вопросам оптового приобретения книг и журналов издательства ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» обращаться по е-mail: invetbio@mail.ru; т. (812) 232-55-92.
