CC BY
151
УДК 57: 579.2
Ключевые слова: бактерии, штамм, свойства, бактериоскопия, морфология, питательная среда
Key words: bacteria, strain, properties, bacterioscopy, morphology, nutrient medium
Садртдинова Г. Р.
ХАРАКТЕРИСТИКА РОСТА БАКТЕРИЙ ВИДА KLEBSIELLA OXYTOCA
НА СРЕДАХ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ
GROWTH CHARACTERISTIC OF BACTERIA KLEBSIELLA OXYTOCA AT NUTRIENT MEDIA USED AT DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC OBJECTIVES
ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный агарный университет имени П. А. Столыпина» Адрес: 432017, г. Ульяновск, б. Новый Венец, д. 1
Ulyanovsk State Agrarian University named after Stolypin P. A., Federal State Budget Institution of Higher Education Address: 432017, Ulyanovsk, blv. Noviy Venetz, 1
Садртдинова Гузелия Рафиковна, ассистент. Е-mail: sadrtdinova-guzlik@yandex.ru Тел. (8422) 55-95-47
Sadrtdinova Guzeliya R., Assistant. Е-mail: sadrtdinova-guzlik@yandex.ru. Те1 +7 (8422) 55-95-47
Аннотация. В статье представлены результаты исследований, связанные с изучением особенностей культивирования бактерий вида Klebsiella oxytoca на питательных средах, используемых в дифференциально-диагностических целях: Эндо, Левина, Плоскрирева. Отмечены ростовые особенности изучаемых штаммов на каждой из сред. Скудный рост с образованием мелких колоний бактерий наблюдался на среде Эндо. Отмечено, что наряду со штаммами, хорошо ферментирующими лактозу, имелись штаммы со слабой лак-тазной активностью. Поэтому в зависимости от степени ферментации лактозы на дифференциально-диагностических средах бактерии образовывали как ярко-малиновые, так и светло-розовые колонии (штаммы K. oxytoca 24 и K. oxytoca 26 образовывали лактозоотрицательные колонии светло-розового цвета). Наиболее благоприятной средой для культивирования является среда Плоскирева. На ней штаммы K. oxytoca образовывали крупные слизистые колонии (2-3 мм) правильной формы, с ровными краями. Сравнительный анализ эффективности использования сред в дифференциально-диагностических целях заключался в посеве гетерогенных штаммов и штаммов вида K. oxytoca на среду Плоскирева. Среда была использована как наиболее благоприятная по составу, на которой рост бактерий вида K. oxytoca отличался своим обильным и «пышным» ростом. Культивирование осуществляли при одинаковых температурных режимах (37 °С), наблюдение за посевами осуществляли в течение 48-ми часов. Анализ результатов, полученных в ходе 48-часового культивирования штаммов на среде Плоскирева, позволил отметить сходные культу-ральные свойства штаммов K. oxytoca 1, K. oxytoca 24, E. cloacae 397, E. coli 383 - образование выпуклых светло-розовых колоний правильной формы, с ровными краями и слизистой консистенцией. Штамм S.marcenscens 21 через 48 часов образовывал красный пигмент, что позволяло дифференцировать данный вид от изучаемого штамма вида K. oxytoca. Использование питательных сред Эндо, Левина и Плоскирева в исследованиях не обеспечивает полноценной идентификации бактерий этого вида.
Summary. The article presents results of studies related to the study of peculiarities cultivation bacteria Klebsiella oxytoca on nutrient media used for differential diagnostic purposes: Endo, Levina, Ploskireva. Growth peculiarities of the studied strains on each of the media were noted. Scant growth, with the formation of small bacterial colonies, was observed on the Endo medium. It was noted that along with strains, which are good fermenting lactose, there were strains with weak lactase activity. Therefore, depending on the degree of fermentation of lactose, the bacteria formed bright-crimson and light-pink colonies on differential diagnostic media (strains K. oxytoca 24 and K. oxytoca 26 formed lactose-negative colony of light pink color). The most favorable medium for cultivation is Ploskirev medium. It strains K. oxytoca formed large mucous colonies (2-3 mm) of regular shape, with even margins. A comparative analysis of the effectiveness of using of media for differential diagnostic purposes consisted of sowing heterogeneous strains and strains of the species K. oxytoca on Ploskirev medium. The medium was used as the most favorable in composition, on which the growth of K. oxytoca species was noted for its abundant and «magnificent» growth. The cultivation was carried out under the same temperature conditions (37 °C), the crops were monitored for 48 hours. Analysis of the results obtained during a 48-hour culture of strains on Ploskirev medium made it possible to note similar cultural properties of the strains K. oxytoca 1, K. oxytoca 24, E. cloacae 397, E. coli 383-the formation of convex light pink colonies with regularform, smooth edges and with mucous consistence. Strain of S. marcenscens 21 formed a red pigment after 48 hours, which made it possible to differentiate this species with the studied strain of species K. oxytoca. The using of Endo, Levina and Ploskirev nutrient media for studies does not provide a complete identification of bacteria of this species.
Введение
В мире достаточно распространенными являются заболевания, вызванные с условно-патогенными микроорганизмами, среди которых Klebsiella занимает ведущее место. В зависимости от состояния иммунной системы человека этот возбудитель может явиться причиной как легкого инфекционного заболевания, так и тяжелого септического проявления [2]. Бактерии вида Klebsiella oxytoca представляют собой гра-мотрицательные факультативно-анаэробные бактерии. Оптимальными условиями культивирования являются температура роста (35-37) °С и время инкубирования (20-24) часа. Штаммы бактерий данного вида, как правило, индолоположительны (в связи с чем и были выделены в отдельный вид), отрицательны по аргининдигидро-лазе и орнитиндекарбоксилазе, обладают подвижностью при 10 °С [3]. Непременной особенностью Klebsiella считают «пышный» и обильный рост с образованием на плотных питательных средах (среда Эндо, среда Плоскирева, среда Левина) больших, выпуклых, частично сливающихся колоний слизистой консистенции [5].
При первичной идентификации бактериального агента применяют бактериологический метод и бактериоскопию. Бактериологический метод связан с посевом материала на питательные среды, позволяющие дифференцировать штаммы гетерогенных бактерий (анализируя характер выросших колоний). В практике наиболее часто используются среды Эндо, Левина, Плоскирева, ВСА [1,8]. Стоит отметить, что рост на этих средах штаммов гетерогенных бактерий или бактерий, являющихся сопутствующей микрофлорой при выделении бактерий рода Klebsiella, имеет ряд отличий: бактерии рода Escherichia на среде Эндо образуют ярко-малиновые колонии с металлическим блеском (у Klebsiella лишь некоторые штаммы способны образовывать колонии с металлическим блеском, цвет колоний - малиновый); на среде Левина бактерии рода Escherichia образуют черно-синие колонии с металлическим блеском (у Klebsiella колонии сине-розо-
вого цвета); на среде Плоскирева бактерии рода Escherichia образуют по краям среды колонии серого цвета, в центре - розовые или брусничного цвета, с желтоватым оттенком (у Klebsiella колонии светло-красного цвета); бактерии рода Enterobacter на среде Эндо образуют нежно-розовые колонии (у Klebsiella колонии подобного цвета встречаются редко); на среде Левина рост бактерий рода Enterobacter, в отличие от рода Klebsiella, подавляется; на среде Пло-скирева бактерии рода Enterobacter образуют колонии бежевого цвета или с явно выраженным бежевым оттенком (у Klebsiella колонии светло-красного цвета); бактерии рода Serratia на среде Эндо, Левина и Пло-скирева образуют бесцветные, прозрачные (пигментообразующие штаммы - красные) колонии, причем хороший рост отмечается при 30 °С (у Klebsiella оптимальной температурой роста является (35-37) °С, колонии малинового цвета) [4]. Бактериоскопия заключается в окрашивании мазков по Граму.
Цель исследований заключалась в изучении особенностей роста бактерий вида K. oxytoca на питательных средах, используемых для бактериологической идентификации и дифференциации.
Материалы и методы
В работе использовались 7 штаммов бактерий, выделенных нами из внешней среды и типированных как бактерии K. oxytoca, и 1 штамм, полученный из коллекции кафедры МВЭиВСЭ (Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина) - ATCC 8724. В качестве гетерогенных штаммов использовали бактерии семейства Enterobacteriaceae: E. coli 383, E. cloaceae 397, S. marcescens 21. Для изучения особенностей роста штаммов бактерий использовали среды, которые наиболее часто используются в практике: среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Левина (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Плоскирева (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск). Посев на среды суточных культур осуществляли после «подращивания» на мясопептонном бульоне (ГНЦ прикладной микробиологии,
г. Оболенск) в течение 24-х часов. Суточную культуру каждого штамма высевали на отобранные питательные среды штрихом. Инкубировали посевы в течение 24-х часов при 37 °С [6, 7].
Результаты исследований
Анализ роста бактерий на средах проводили по следующим критериям: величина колоний, форма колоний, характер контура края, рельеф колоний, цвет, консистенция.
Характер роста бактериальных колоний дифференцировали:
- слабый (диаметр выросших колоний едва достигает 1-го мм, количество колоний < 20; диаметр колоний < 0,5 мм, количество колоний > 50);
- средний (диаметр выросших колоний (1-2) мм, количество - (20-50); диаметр -(2-3) мм, но количество колоний < 30);
- обильный (диаметр выросших колоний (2-3) или (3-4) мм, количество > 50).
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
Результаты, представленные в таблице 1, позволяют отметить хороший, обильный рост на среде Плоскирева у 62,5 % всех исследуемых штаммов (К. оху1оса 1, К. оху1оса 2, К. оху1оса 3, К. оху1оса 25, К. оху^са АТСС 8724). Слизистые пышные колонии достигали диаметра 2-3 мм, цвет колоний варьировал от светло-розового до розового.
Рост на среде Левина у 50,0 % штаммов (К. оху1оса 1, К. оху1оса 10, К. оху1оса 25, К. оху^са АТСС 8724) средний, с сине-розовыми колониями в диаметре 1-2 мм. У 37,5 % штаммов (К. оху1оса 3, К. оху1оса 24, К. оху1оса 26) рост слабый, количество сине-розовых колоний достигало 20.
На среде Эндо отмечен самый слабый рост бактерий, с образованием мелких и редких колоний с металлическим блеском. Отметим, что два штамма (К.оху1оса 24, К.оху1оса 26) образовывали лактозоотри-цательные колонии.
Бактерии К. оху1оса, Е. с1оасеае и таг-сеясепя согласно системе дифференциации, предложенной Э. Юингом и П. Эдвар-сом (объединение по сходству биохимиче-
ских и культуральных признаков), относят к одной трибе - Klebsielleae. Бактерия E. coli является модельным микроорганизмом в микробиологических исследованиях (поскольку является одним из самых хорошо изученных микроорганизмов). Кроме того, E. coli является микроорганизмом, культуральные свойства которого схожи со многими энтеробактериями (в частности, Klebsiella), что приводит к значительным затруднениям при выделении бактерий.
Сравнительный анализ эффективности использования сред в дифференциально-диагностических целях заключался в посеве гетерогенных штаммов и штаммов вида K. oxytoca на среду Плоскирева (наиболее благоприятная по составу питательная среда, на которой рост бактерий вида K. oxytoca отличается своим обилием и «пышным» ростом). Инкубация посевов производилась в условиях термостата при 37 °С, с наблюдением за изменениями в течении 2-х суток (табл. 2).
Согласно результатам, представленным в таблице 2, отмечены сходные культуральные свойства бактерий K. oxytoca 1, K. oxytoca 24, E. cloacae 397, E. coli 383 -это образование выпуклых светло-розовых колоний правильной формы, с ровными краями и слизистой консистенцией. Рост S. marcenscens 21 отличается от данных видов характеристикой выросших колоний и образованием через 48 часов красного пигмента.
Заключение
В результате проведенных исследований обильный рост с образованием большого количества слизистых «пышных» колоний правильной формы отмечен на среде Пло-скирева (62,5 % всех изучаемых штаммов K.oxytoca), формирование небольшого количества колоний (или большого количества, но мелких колоний) фиксируется на среде Эндо, на среде Левина рост бактерий можно охарактеризовать как средний -с образованием средней величины и небольшого количества колоний. Использование среды Плоскирева в исследованиях не обеспечивает прямой идентификации
Таблица 1.
Характеристика роста штаммов бактерий K.oxytoca на ДДС
Исследуемый штамм Питательная среда рН среды Условия инкубации Результат Характеристика роста
K. oxytoca 1 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии малинового цвета, лак-тозо(+), 2-4 мм Средний
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1-3 мм Средний
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Обильный
K. oxytoca 2 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии малинового цвета, лак-тозо(+), 2-4 мм Средний
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1-2 мм Обильный
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Обильный
K. oxytoca 3 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии малинового цвета, лак-тозо(+), 2-4 мм Обильный
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1 мм Слабый
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Обильный
K. oxytoca 10 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии малинового цвета, лак-тозо(+), 1-2 мм Средний
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 2 мм Средний
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Средний
K. oxytoca 24 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии светло-розового цвета, лактозо(-), 1-2 мм Слабый
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1 мм Слабый
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Средний
K. oxytoca 25 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии малинового цвета, лак-тозо(+), 1-2 мм Средний
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1-2 мм Средний
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Обильный
K. oxytoca 26 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии светло-розового цвета, лактозо(-), 1-2 мм Средний
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1 мм Слабый
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Средний
K. oxytoca АТСС 8724 Эндо 7,4+0,2 37 °С, 24 часа Куполообразные слизистые колонии малинового цвета, лак-тозо(+), 2-3 мм Средний
Левина 7,2+0,2 37 °С, 24 часа Слизистые колонии сине-розового цвета, 1-2 мм Средний
Плоскирева 7,0+0,2 37 °С, 24 часа Светло-розовые колонии, 2-3 мм Обильный
бактерий, в связи с чем необходимо выделение их в чистой культуре и последующая идентификация широким набором тестов, что длительно и трудоемко. Анализ полученных данных позволяет заключить о недостатках всех этих сред, т.к. на них помимо бактерий рода Klebsiella хорошо растут и другие бактерии семейства Enterobacteriaceae, что затрудняет отбор колоний для проведения дальнейшей идентификации.
Для определения принадлежности культур к клебсиеллам необходима постановка целого ряда подтверждающих тестов (тесты на подвижность, сероводород, мо-
чевину, фенилаланиндезаминазу, цитрат Симмонса, малонат, лизиндекарбоксилазу, инозит) и, следовательно, значительное время и материальные затраты. В целях ускорения исследования, значительного сокращения объема работы и материальных средств считаем эффективным разработку хромогенной питательной среды для одноэтапного выделения и прямой идентификации бактерий рода Klebsiella.
Список литературы
1. Бульканова, Е.А. Биологические свойства бактерий рода Klebsiella и их значение в патологии животных [Текст] / Е. А. Бульканова, С. Н. Золотухин, Е. Н. Митрохина // Вестник Ульяновской государ-
Исследуемый штамм Среда Плоскирева
Условия культивирования рН среды Характеристика колоний
Через 24 часа Через 48 часа
K. oxytoca 1 37+1°С 7,0+0,2 Выпуклые колонии светло-розового цвета, диаметром 2-3 мм. Правильной формы, с ровными краями, слизистой, тянущейся консистенции Выпуклые колонии светло-розового цвета, правильной формы, с ровными краями, слизистой, тянущейся консистенции. Отмечали увеличение некоторых колоний до 3,5 мм
K. oxytoca 24 37+1°С 7,0+0,2 Выпуклые колонии светло-розового цвета, диаметром 2-3 мм. Правильной формы, с ровными краями, слизистой консистенции Выпуклые колонии розового цвета, правильной формы, с ровными краями, слизистой консистенции. Отмечали увеличение некоторых колоний до 3 мм
E. coli 383 37+1°С 7,0+0,2 Выпуклые колонии розового цвета, диаметром 1,5-2,5 мм. Правильной формы, с ровными краями, слизистой консистенции Выпуклые колонии розового цвета, правильной формы, с ровными краями, слизистой консистенции. Отмечали увеличение некоторых колоний до 3,5 мм
E. cloacae 397 37+1°С 7,0+0,2 Выпуклые колонии светло-розового, с заметным при проходящем свете желтоватым оттенком, диаметром 2-3,5 мм. Правильной формы, с ровными краями, слизистой консистенции Выпуклые, колонии светло-розового цвета, с заметным при проходящем свете желтоватым оттенком. Увеличение размера колоний не наблюдали (2-3,5 мм). Правильной формы, с ровными краями, слизистой консистенции
S. marcenscens 21 37+1°С 7,0+0,2 Выпуклые, прозрачные бесцветные колонии, напоминающие колонии сальмонелл, диаметром 1-2 мм. Правильной формы, с ровными краями, мажущей консистенции Выпуклые колонии с заметным красным пигментом, диаметром 1-2 мм. Правильной формы, с ровными краями, мажущей консистенции
Таблица 2.
Сравнительный анализ эффективности использования среды Плоскирева в дифференциально-диагностических целях
ственной сельскохозяйственной академии. - 2004. - № 12. - С. 34-40.
2. Бухарова, Е.В. Патогенный потенциал Klebsiella spp. и Staphylococcus aureus при ассоциативном симбиозе у детей первого года жизни [Текст] / Е.В. Бухарова, В.В. Долгих, С.М. Попкова, Е.Б. Ракова, Н.М. Шабанова, УМ. Немченко, Е.И. Иванова, Л.В. Сердюк // Успехи современного естествознания. - 2014. - № 12-2. - С. 20-24.
3. Евтеева, Н.И. Новые природные резервуары и биологические свойства штаммов Klebsiella pneumoniae [Текст] / Н.И. Евтеева, А.И. Речкин // Симбиоз Россия 2008: Сборник научных трудов I Всероссийского, с международным участием конгресса студентов и аспирантов биологов. - Казань, 2008. - С. 114-119.
4. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробак-терии и их роль в патологии животных [Текст] / С.Н. Золотухин. - Ульяновск, 2004. - С. 64-75.
5. Поздеев О.К. Энтеробактерии: руководство для врачей [Текст]/ О.К. Поздеев, Р.В. Федоров. -М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 720 с.
6. Родионова, А.В. Сравнительная оценка дифференциально- диагностических свойств питательных сред, используемых для выделения бактерий рода Klebsiella [Текст] // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии: Материалы IX-й Международной студенческой научной конферен-ции. - Ульяновск : УГСХА, 2016. - Т. II. - C. 184-187.
7. Садртдинова Г.Р. Биохимическая активность бактерий вида Klebsiella oxytoca [Текст] / Г.Р. Садртдинова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы VII международной научно-практической конференции. - Ульяновск : УГСХА, 2016. - Т. III. - С. 261-265.
8. Сельников О.П. Микробиологическая и патоморфологическая характеристика клеб-сиеллезной инфекции [Текст] / О. П. Сельни-ков // Микробиология. - 1992. - Т. 54. - № 2. -С. 75-80.
Патологоанатомическая диагностика болезней собак и кошек
Авторы: Кудряшов А. А., Балабанова В. И.
Формат: 170 х 250 мм, твёрдый переплет, 328 с. с илл.
Описание: В книге представлены рекомендации по проведению и протоколированию вскрытия мелких домашних животных и в частности собак и кошек, а также материалы по патологоанатомической и дифференциальной диагностике большинства инфекционных и наиболее важных инвазионных и незаразных болезней.Из незаразных болезней разобраны те, которые наиболее часто приводят к смерти и в диагностике которых определяющее значение имеют результаты вскрытия.
Впервые представлены данные по патологоанатомиче-
А. А. Кудряшов, В. И. Балабанова
ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ СОБАК И КОШЕК
I
А
скому описанию отравлении собак ИЗОНИАЗИДОМ, ЦИАНИДАМИ И КРЫСИНЫМИ ЯДАМИ, а также представлена информация по патогенезу данных отравлений.
Текст иллюстрирован авторскими снимками органов с патологоанатомическими изменениями при ряде болезней.
В книгу включены снимки препаратов и рисунков музея кафедры патологической анатомии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.
Книга предназначена для ветеринарных специалистов и студентов ветеринарных факультетов вузов.
Допущено Министерством сельского хозяйства Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности «Ветеринария».
Заказ книги: т. 8 (812) 232-88-61, Е-mail: ivb-info@mail.ru ; invetbio@yandex.ru; через сайт http://invetbio.spb.ru/Kudryashov-2016.htm Код заказа П10
