Повышение иммуногенности инактивированного вируса гриппа а/калифорния/7/09 (H1N1) при использовании в качестве адъюванта фукоидана из бурой водоросли fucusevanescens

Кузнецова Татьяна Алексеевна; Степанова Людмила Алексеевна; Ермакова Светлана Павловна

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» • Сведения об авторах

Должикова Инна Вадимовна, м.н.с.. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11, i.dolzhikova@gmail.com;

Тухватулин Амир Ильдарович, с.н.с., к.б.н. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11, amir_tuhvatulin@yahoo.com;

Тухватулина Наталья Михайловна, н.с., к.б.н. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11, tuhvatulina_n@mail.ru;

Исачкова Ирина Петровна, начальник отделения филиала «Медгамал» ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-193-30-50, irinais-bcg@yandex.ru;

Зотова Ирина Федоровна, Научный сотрудник, к.б.н. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России. i.fedorovna@gmail.com; 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11;

Джаруллаева Алина Шахмировна, м.н.с. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11, alina-dzharullaeva@yandex.ru;

Евграфова Ирина Михайловна, м.н.с. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11, iriskagamal@gmail.com;

Попов Сергей Александрович, заведующий лабораторией, к.м.н., НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова; 127994, Россия, Москва, ул. Достоевского, дом 4, 8-495-681-02-33, popov_s55@mail.ru;

Логунов Денис Юрьевич, заведующий лабораторией, член-корр. РАН, д.б.н. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, 8-499-190-76-11, ldenisy@yahoo.com.

Удк 615.375:578.832.1;577.114:582.272

Т.А. Кузнецова1, Л.А. Степанова2, С.П. Ермакова3

повышение иммуногенности инактивированного вируса гриппа а/калифорния/7/09 (H1N1) при использовании в качестве адъюванта фукоидана из бурой водоросли fucus evanescens

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток

2 НИИ гриппа Минздрава России, Санкт-Петербург

3 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

Цель исследования: изучение влияния сульфатированного полисахарида из бурой водоросли Fucus evanescens на иммунный ответ к инактивированному вирусу гриппа A/California/7/09 H1N1pdm. Материалы и методы: мышей BALB/c иммунизировали дважды инактивированным вирусом пандемического гриппа A/California/7/09 H1N1pdm09 с фукоиданом. В сыворотке крови определяли уровень гемагглютинирующих антител к вирусу гриппа в РТГА через 2 недели после однократной и двукратной иммунизации. Результаты: при первичной и вторичной иммунизации фукоидан оказывал адъювантный эффект, стимулируя формирование антител к вирусу гриппа A. В ответ на введение вируса в дозе 5 мкг/мышь титры антител не различались по сравнению с введением 15 мкг/мышь, что важно для выбора вакцинирующей дозы. Эффект фукоидана на формирование антител к вирусу гриппа был выражен в большей степени по сравнению с традиционным лицензированным адъювантом гидроксидом алюминия. Выводы: добавление фукоидана к инактивированному вирусу гриппа - экспериментальному аналогу вакцинного штамма - значительно повышает его иммуногенность, что свидетельствует о перспективности использования фукоидана в качестве адъюванта в составе противогриппозных вакцин.

Ключевые слова: сульфатированные полисахариды, фукоиданы, адъюванты, вакцины, вирус гриппа.

T.A. Kuznetsova1, L.A. Stepanova2, S.P. Ermakova3

INCREASING THE IMMUNOGENICITY OF THE INACTIVATED INFLUENZA VIRUS A/CALIFoRNIA/7/09 (H1N1) USING AS ADJUVANT FUCoiDAN

from brown alga fucus evanescens

1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia

2 Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russia

3 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia

HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 57

• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»

Objective: the aim of the research was to study the effect of sulfated polysaccharide from brown alga Fucus evanescens on the immune response to the inactivated influenza virus A/California/7/09 H1N1pdm. Materials and methods: BALB/c mice were immunized twice with inactivated pandemic influenza virus A/California/7/09 H1N1pdm09 with fucoidan. The level of hemagglutinating antibodies to the virus in the RTGA in the blood serum was determined 2 weeks after a single and double immunization. Results: in primary and secondary immunization fucoidan exerted an adjuvant effect, stimulating the formation of antibodies to influenza virus A, and in response to the introduction of a low dose of the virus (5 ^g/mouse), antibody titers did not differ from the administration of high dose (15 ^g/mouse), which it is important for choose a vaccination dose. The effect of fucoidan on the formation of antibodies to influenza virus A was expressed to a greater extent compared with the traditional licensed adjuvant aluminum hydroxide. Conclusion: the addition of fucoidan to the inactivated influenza virus А, an experimental analogue of the vaccine strain, significantly increases its immunogenicity, which indicates the promise of using fucoidan as an adjuvant in influenza vaccines.

Keywords: sulfated polysaccharides, fucoidans, adjuvants, vaccines, influenza virus.

Вирус пандемического гриппа A(H1N1) pdm09 циркулирует среди населения и входит в состав современных трех- и четырехвалентных противогриппозных вакцин в качестве одного из компонентов [1, 2]. В составе инактивированных гриппозных вакцин в настоящее время используются адъюванты на основе алюминия, сквалена (MF59, AS03) или полиоксидоний [3]. Однако, несмотря на высокую эффективность вакцин, применяемые адъюванты имеют ряд принципиальных недостатков, а также вызывают развитие побочных эффектов. Так, при клинической апробации вакцин из штаммов вируса гриппа А, содержащего AS03 либо MF59 в качестве адъюванта, наблюдалась высокая реактогенность у детей и взрослых, проявляющаяся в виде местных и системных реакций на вакцинацию [4, 5].

В качестве адъювантов активно исследуются соединения полисахаридной (ПС) природы, обладающие высокой биосовместимостью, низкой токсичностью, безопасностью и хорошей переносимостью макроорганизмом.

Цель работы - изучение влияния сульфатирован-ного ПС из бурой водоросли Fucus evanescens на иммунный ответ к инактивированному вирусу гриппа A/Califomia/7/09 H1N1pdm.

Материалы и методы. Исследования выполнены на мышах-самцах BALB/c массой 18-20 г, полученных из питомника ГУ научный центр биомедицинских технологий РАМН «Столбовая». Работа проводилась с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по за—щите позвоночных животных для эксперименталь—ных работ (Strasbourg, 18.03.1986). Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.

В качестве адъювантов использовали сульфати-рованный ПС (фукоидан) из бурой водоросли Fucus evanescens и гель гидроокиси алюминия (гидроксид алюминия) (Brenntag Biosector, Дания). Фукоидан представляет собой нативный фукоидан в комплексе с полифенолами и имеет молекулярную массу в диапазоне 130-430 кДа [6].

Мышей BALB/c иммунизировали внутримышечно инактивированным вирусом пандемического гриппа

А/СаНйэгша/7/09 H1N1pdm - экспериментальным аналогом вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины в дозах 5 и 15 мкг/мышь с фукоиданом в дозе 200 мкг или гидроксидом алюминия в дозе 500 мг одно- и двукратно с двухнедельным интервалом. Контрольным животным вводили фосфатно-буфер-ный раствор рН 7,2. Животных рандомизировали на группы по 5 мышей в каждой: 1-ая группа - вирус гриппа 5 мкг/мышь с фукоиданом; 2-ая группа - вирус гриппа 15 мкг/мышь с фукоиданом; 3-я группа -вирус гриппа 5 мкг/мышь с гидроксидом алюминия; 4-ая группа - вирус гриппа 15 мкг/мышь с гидроксидом алюминия; 5-ая группа - вирус гриппа 5 мкг/ мышь; 6-ая группа - вирус гриппа 15 мкг/мышь; 7-ая группа - фосфатно-буферный раствор.

Оценивали уровень антител через 2 недели после одно- и двукратной иммунизации. Определение гемагглютинирующих антител к вирусу гриппа А/ СаПйэгша/07/2009 (Н1Ш) pdm09 в сыворотке иммунизированных животных проводилось в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1,0% куриными эритроцитами. Результаты реакции учитывали после оседания эритроцитов в контрольных лунках планшета (через 30-40 мин). Титром сыворотки считали ее наибольшее разведение, при котором наблюдается полное торможение агглютинации эритроцитов в результате взаимодействия вируса со специфическими антителами. Рассчитывали среднее геометрическое титров антител (СГТ).

Результаты исследований подвергали статистической обработке с использованием пакета программы <^а^йса-7». Значимость различий оценивали с использованием критерия достоверности Стьюдента ф, критическое значение уровня значимости принималось равным 5% (р<0,05).

Результаты и обсуждение. В результате однократной иммунизации мышей вирусом гриппа А/ СаНйэгша/7/09 H1N1pdm в обеих испытуемых дозах в сочетании с фукоиданом (1-ая и 2-ая группы) СГТ антител в сыворотке крови были значимо выше по сравнению с группой животных, иммунизированных вирусом гриппа А в соответствующих дозах без адъю-

58 ЗДОРОВЬЕ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ. НАУКА 3 (70) - 2017

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

ванта (5-ая и 6-ая группы) (р<0,01). При иммунизации вирусом гриппа в дозе 15 мкг/мышь с гидроксидом алюминия (4-ая группа) СГТ антител не отличалась от соответствующего контроля (6-ая группа) (р>0,05). Стимулирующее влияние фукоидана на антителообра-зование превосходило эффект гидроксида алюминия (различия в СГТ антител в группах 2 и 4 статистически значимы, р<0,05). После повторной иммунизации фу-коидан оказывал 10-27-кратный адьювантный эффект, стимулируя формирование антител к вирусу гриппа A. При этом фукоидан также активнее стимулировал антителообразование по сравнению с гидроксидом алюминия, хотя значимых различий в эффектах этих адьювантов не выявлено (р>0,05).

Анализ адъювантного эффекта фукоидана в зависимости от вводимой дозы вируса гриппа свидетельствует, что при однократной иммунизации животных инактивированным вирусом гриппа в дозе 15 мкг/мышь СГТ в РПГА составила 640 (320-1280), а при снижении дозы в 3 раза (5 мкг/мышь) - 278,6 (160-1280) при отсутствии статистически значимых различий между этими показателями (р>0,05). При двукратной иммунизации вирусом гриппа в дозе 15 мкг/мышь СГТ значительно возрастала по сравнению с однократной и составила 1940,1 (640-5120), а в дозе 5 мкг/мышь - 1470,3 (1280-2560) (р>0,05) (рис.). Отсутствие статистически значимых различий в СГТ в ответ на введение большей и меньшей испытуемых доз свидетельствует о возможности использования более низкой вакцинирующей дозы вируса.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют об адъювантных свойствах фукоида-нов в отношении различных антигенов и вакцинных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, в т.ч. гриппа [7, 8]. Результаты наших исследований также свидетельствуют об адьювантной активности фукоидана из бурой водоросли F. evanescens, который проявлялся в повышении иммуногенности инактивированного вируса гриппа А.

Эффект фукоидана был выражен в большей степени по сравнению с традиционным лицензированным адьювантом гидроксидом алюминия. При повторной иммунизации фукоидан оказывал значительный адъ-ювантный эффект, стимулируя формирование антител к вирусу гриппа A, а в ответ на введение более низкой дозы вируса СГТ не различались по сравнению с введением высокой дозы. Это важно для выбора вакцинирующей дозы в пользу снижения антигенной на-

грузки, что обеспечивает безопасность вакцинации. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования фукоидана в качестве адъюванта в составе противогриппозных вакцин.

Выводы: добавление фукоидана из бурой водоросли F. evanescens к инактивированному вирусу гриппа A/California/7/09 H1N1pdm09 повышает его иммуногенность в 10-27 раз, что свидетельствует о перспективности использования фукои-дана в качестве адъюванта в составе противогриппозных вакцин.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Беседнова Н.Н. Морские гидробионты - потенциальные источники лекарств // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 4-10.

2. Васильев Ю.М. Адъюванты гриппозных вакцин - современное состояние // Журн. Микробиол. 2010;1:100-110.

3. Гендон Ю.З.Свиной грипп Н1Ш/Калифорния -страсти и факты // Журн. Микробиол. 2010; 4: 105-114.

4. Roman F, Vaman T, Kafeja F, Hanon E, Van Damme P. AS03(A)-Adjuvanted influenza A (H1N1) 2009 vaccine for adults up to 85 years of age. Clin Infect Dis. 2010; 51: 668-677. doi: 10.1086/655830.

5. Clark T., Pareek M., Hoschler K , Dillon H., Nicholson K., Groth N., Stephenson L. Trial of 2009 influenza A (H1N1) monovalent MF59 -Adjuvaned vaccine. N Engl. J. Med. 2009; 361: 2424-2435. doi: 10.1056/ NEJMoa0907650.

6. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural simi-larities of fucoidans from brown algae Silvetia babingtonii and Fucus evanescens, determined by tandem MALDI-TOF mass spectrometry. Carbohydrate Research. 2012; 358: 78-81. doi.org/10.1016/j.carres.2012.06.015.

7. Synytsya A., Bleha R., Synytsya A. et al. Mekabu fucoidan: structural complexity and defensive effects against avian influenza A viruses. Carbohydr. Polym. 2014; 111: 633-644. doi: 10.1016/j.carbpol.

8. Kim S.Y., Joo H.G. Evaluation of adjuvant effects of fucoidan for improving vaccine efficacy. J. Vet. Sci. 2015; 16: 145-150. doi: 10.4142/jvs.2015.16.2.145.

Сведения об авторах

Кузнецова Татьяна Алексеевна, докт. мед. наук, вед. науч. сотр. лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, е-mail: takuznets@mail.ru.

Степанова Людмила Алексеевна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, e-mail: stepanoval60@mail.ru)

Ермакова Светлана Павловна, докт. хим. наук, зав. лаб. химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, e-mail: swetlana_e@mail.ru

HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 59

INCREASING THE IMMUNOGENICITY OF THE INACTIVATED INFLUENZA VIRUS A/CALIFORNIA/7/09 (H1N1) USING AS ADJUVANT FUCOIDAN FROM BROWN ALGA FUCUS EVANESCENS