CC BY
49
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ... 45
УДК 616-006.04-092.9:615.831 Г.А.Меерович1, С.Ш. Каршиева2, И.Г. Меерович2, М.С. Белов3, А.В. Фабер3, В.Б. Лощенов1, Е.А. Лукьянец4 ПОВЫШЕНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОИ ЭФФЕКТИВНОСТИ "ФОТОСЕНСА™" ПРИ СОВМЕСТНОМ ВВЕДЕНИИ С ПВП 1 Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва 2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва 3МГУ им. М.В. Ломоносова, Физический факультет, Москва 4Государственный Научный Центр «НИОпИК», Москва Контактная информация Меерович Геннадий Александрович, канд. физ.-мат. наук, старший научный сотрудник лаборатории лазерной биоспектроскопии адрес: 119991, Москва, уд. Вавилова, 38; тел. +7(903)798-93-00 e-mail: meerovich@mail.ru Статья поступила 19.06.2013; принята к печати 09.07.2013. Резюме Рассмотрена возможность повышения эффективности ФДТ с фотосенсибилизатором "Фотосенс™" при совместном внутривенном введении с Гемодезом (водно-солевой р-р ПВП). Проведены исследования влияния ПВП на агрегацию "Фотосенса™", селективность его накопления в опухоли и фотодинамическую эффективность. Показано, что ПВП способствует повышению эффективности ФДТ с этим фотосенсибилизатором на модельных опухолях, предположительно за счет уменьшения агрегации молекул "Фотосенса™". Ключевые слова: поливинилпирролидон, фотодинамическая терапия, опухоль, "Фотосенс™", агрегация, селективность.
1 2 2 3 3 1 4 G.A. Meerovich , S.Sh. Karshieva , I.G. Meerovich , M.S. Belov , A.V. Faber , V.B. Loschenov , E.A. Lukyanets ENHANCEMENT OF PHOTODYNAMIC EFFICIENCY OF "PHOTOSENS™" BY COMBINATION WITH POLYVINYLPYRROLIDONE 1A.M. Prokhorov General Physics Institute of RAS, Moscow 2FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow 3M.V. LomonosovMoscow State University, Moscow 4State Research Center «NIOPIK», Moscow Abstract This work studies the possibility to enhance efficiency of photodynamic treatment of photosensitizer Photosens by its combined administration with Hemodes (saline/buffered solution of polyvinylpyrrolidone). Performed studies of influence of polyvinylpyrrolidone on Photosens aggregation processes, selectivity of its accumulation in tumor and photodynamic action showed that increase of treatment efficiency in this combination, supposedly due to deaggregation of the photosensitizer molecules. Key words: polyvinylpyrrolidone, photodynamic therapy, tumor, Photosens, aggregation, selectivity. Введение (препарат "Фотолон™") на модельных опухолях. Аналогичный результат был получен для гипери-ФС "Фотосенс™', представляющий собой р- цина [6]. р смеси натриевых солей ди-, три- и тетрасульфоф- В нашей работе рассмотрена возможность талоцианина гидрооксиалюминия со средней сте- повышения эффективности ФДТ с использованием пенью сульфирования, близкой к 3, в воде или физ. фотосенсибилизатора "Фотосенс™" при совмест-р-ре1 [1], широко используется для фотодинамиче- ном внутривенном введении с ПВП. ского лечения опухолей [3]. Задача дальнейшего совершенствования ФДТ c "Фотосенсом™" связана Материалы и методы с поиском путей повышения его фотодинамической эффективности. Исследуемые водные композиции на основе Одним из факторов, снижающих фотодина- фотосенсибилизатора "Фотосенс™" (ФГУП «ГНЦ мическую эффективность ФС, по крайней мере, в «НИОПИК»», Москва) представляли собой р-ры первые часы после введения, когда основная часть "Фотосенса™" в физ. р-ре и в водно-солевом р-ре ФС находится еще в кровеносном русле, является Гемодез, содержащем 6% низкомолекулярного агрегация их молекул [4]. ПВП Мм 12 600±2 700; хлориды натрия, калия, Для уменьшения влияния агрегации на фо- кальция, магния; гидрокарбонат натрия («Биосин-тодинамическую эффективность ФС на основе хло- тез», Пенза). рина е6 [2] было предложено добавить в водный р- В опытах использовали мышей линии Balb/c р этой субстанции ПВП, что позволило повысить (самок) массой тела 23 г из вивария ФГБУ «РОНЦ эффективность ФДТ с этим фотосенсибилизатором им. Н.Н. Блохина» РАМН. Животных содержали в виварии в условиях с естественным освещением на брикетированном корме и постоянном доступе к 1 Здесь и далее - 0,9 %-ный р-р NaCl в дистиллированной воде. воде. Перед лечением мышей рандомизированно
№ 3/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
распределяли по группам (n=5), оставляя одну группу без лечения в качестве контрольной (n=6).
Использовали перевиваемую ELD после 3 пассажа. Для опытов асцитическую жидкость из брюшной полости привитых животных, содержащую клетки ELD, разводили в среде 199 до концентрации 1,5*106 клеток в 0,1 мл. Полученную взвесь инокулировали внутримышечно в голень правой задней лапы мышей. Лечение начинали на +6 сутки, когда опухоли объем у животных в среднем достигал около 700 мм3. ФС вводили в/в в дозе 1,5 мг/кг массы тела.
Исследования проводили спектрально-флуоресцентным методом с использованием волоконного спектроанализатора ЛЭСА-06-Биоспек («Био-спек», Россия), флуоресценция возбуждалась He-Ne лазером с v 632,8 нм.
Для спектрально-флуоресцентных исследований рандомизированно формировали группы мышей для каждого ФС (по 3 особи в группе) Спектры флуоресценции в разные моменты времени после введения ФС изучались в нескольких (510) точках опухоли и, соответственно, нормальной ткани на контралатеральной зоне левой лапки. Полученные данные усреднялись по этим точкам с использованием программы «UnoMomento» («Био-спек», Россия). Уровень содержания ФС в опухоли и нормальной ткани оценивался в относительных единицах по значениям интегральной интенсивности флуоресценции, нормированной на интенсивность рассеянной лазерной линии. Эти данные для опухоли и нормальной ткани усреднялись для всех мышей группы. По усредненным данным оценивалось в динамике содержание ФС в опухоли и нормальной ткани, а по соотношению этих величин -селективность накопления "Фотосенса™" в опухоли по отношению к нормальной ткани.
Для облучения при ФДТ использовали лазер ЛФД-01/675-Биоспек («Биоспек», Россия) с v излучения 670 нм. Эффективность ФДТ мышей с ELD оценивали по стандартным критериям - ТРО и УПЖ. Полученные данные статически обрабатывали по методу Фишера-Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова, рассчитывая ДИ средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследование поглощения
и флуоресценции
изучаемых растворов "Фотосенса™"
Исследования формы спектра поглощения "Фотосенса™', растворенного в физ. р-ре, свидетельствуют о том, что при высокой концентрации значительная часть молекул "Фотосенса™' находится в агрегированном состоянии, предположительно - в виде фотодинамически неактивных диме-ров (рис. 1), В частности, в спектрах поглощения при высоких концентрациях появляется дополнительный пик в области 600-620 нм, интенсивность которого нарастает при повышении концентрации ФС.
Исследования зависимости интенсивности флуоресценции и поглощения от концентрации "Фотосенса™" были проведены в растворах с Ин-тралипидом™, моделирующим рассеяние биологической ткани [5; 7].
Исследования позволили установить для фиксированных условий эксперимента количественное соотношение между интегральной интенсивностью флуоресценции "Фотосенса™', нормированной на
интенсивность рассеянной лазерной линии, а также его поглощением, с одной стороны, и концентрацией "Фотосенса™" - с другой. Эта взаимосвязь была использована в исследованиях in vivo для количественной оценки содержания "Фотосенса™" в опухоли. В частности, это позволило установить, что при введении в дозе 1,5 мг/кг, которая использовалась в настоящем исследовании, содержание "Фотосенса™" в опухоли в различные моменты первых суток после введения находилось в пределах (1,6-6)*10-3 мг/мл. При этом необходимо также иметь в виду, что непосредственно после введения, когда весь "Фотосенс™" находится в сосудах, его концентрация в крови близка к 20*10-3 мг/мл.
Результаты эксперимента показали (рис. 2): зависимость интенсивности флуоресценции и поглощения от концентрации "Фотосенса™" при больших ее значениях носит сублинейный характер. Это позволяет сделать вывод о значимом влиянии агрегации на квантовый выход флуоресценции (концентрационном тушении) и экстинкцию "Фотосенса™".
В растворе на основе Гемодеза влияние агрегации на свойства "Фотосенса™" заметно ниже, чем при разбавлении "Фотосенса™" физ. р-ром, то есть, присутствие ПВП способствует дезагрегации молекул "Фотосенса™".
Существенное влияние агрегации на свойства "Фотосенса™" и наблюдаемая разница между свойствами изучаемых растворов при его высокой концентрации позволяет предположить, что агрегация значимо влияет и на его фотодинамическую эффективность, а дезагрегация, обусловленная присутствием ПВП, позволит повысить эффективность ФДТ "Фотосенса™". Для подтверждения этого предположения были проведены исследования in vivo.
Исследования in vivo
Изучение in vivo динамики интенсивности флуоресценции "Фотосенса™" показало (рис. 3): в группе мышей, которым "Фотосенс™" вводили в р-ре Гемодеза, на начальном этапе (в течение первых 10-15 ч после введения) интенсивность флуоресценции и в опухоли и в нормальной ткани была существенно (~ в 1,5 раза) выше по сравнению с таковой в группе животных, которым вводили "Фотосенс™" в физ. р-ре.
Через 24 ч после введения интенсивность флуоресценции в опухоли начинала медленно спадать примерно с одинаковым клиренсом для обеих групп. В нормальной ткани клиренс был выше в группе, которой "Фотосенс™' вводили в р-ре Гемодеза, что позволило к +8 суткам существенно (~ в 2 раза по сравнению с "Фотосенсом™", введенным в физ. р-ре) снизить остаточную концентрацию "Фотосенса™" в коже (рис. 4).
Селективность накопления "Фотосенса™" в опухоли по сравнению с таковым в нормальной ткани была выше на 40-50 % при введении в р-ре Гемодеза, чем при введении в физ. р-ре (рис. 5).
По нашему мнению, ПВП в р-ре "Фотосенса™" с Гемодезом оказывает двухфакторное влиянии на интенсивность флуоресценции. С одной стороны, как следует из наших предыдущих экспериментов с р-рами "Фотосенса™", ПВП способствует его дезаггрегации, что повышает флуоресцентную эффективность ФС.
С другой - Гемодез усиливает почечный кровоток и способствует более быстрому выведению "Фотосенса™" из тканей с нормальным кровообращением, то есть из здоровых тканей.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПОВЫШЕНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ... 47
550 575 600 625 650 675 700 725
Длина волны (нм)
Рис. 1. Нормированные на максимум спектры поглощения "Фотосенса™" в физ. р-ре с различными концентрациями (мг/мл): 1 - 10-2; 2- 5х10-3;
3 - 10-3;
4 - 5х10-4.
Концентрация (мг/мл)
Концентрация (мг/мл)
Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции (А) и поглощения (Б) от концентрации "Фотосенса™":
Область, ограниченная штриховыми линиями, соответствует экспериментально определенному in vivo диапазону средней по опухоли концентрации "Фотосенса™" в различные моменты первых суток. Штрихпунк-тирная линия соответствует максимальной концентрации "Фотосенса™' в крови мышей сразу после введения.
1 - "Фотосенса™" в р-ре Гемодез;
2 - "Фотосенса™" в физ. р-ре.
О 50 100 150
Время, часы
1.4
е
о.о -I—т—т—т—т—I—т—т—т—т—I—т—т—т—т—I— О 50 100 150
Время, часы
О 50 100 150
Время, часы
Рис. 3. Динамика накопления "Фотосенса™" (А; Б) в опухоли (1; 2) и нормальной ткани (3; 4) и селективность (В) накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью при введении в р-ре Гемодеза (1; 3) и физ. р-ре (2; 4).
—■—Контроль —♦—Фотосенс-гемодез —•—Фотосенс-раствор
Рис. 4. Динамика роста аденокарциномы Эрлиха (ELD):
1 - без лечения;
2 - после ФДТ с использованием "Фотосенса™" в физиологическом растворе;
3 - после ФДТ с использованием "Фотосенса™" в растворе Гемодез.
>s
<и
а 2
о ta н о <и Т S
п
о
И
Сутки после инокуляции опухоли Эрлиха (ELD)
7
6
5
4
3
2
1
0
Рис. 5. Продолжительность жизни мышей с ELD в контрольной группе (1), после ФДТ с использованием "Фотосенса™" в физ. р-ре (2) и "Фотосенса™" в р-ре Гемодеза (3).
Рис. 6. Эффективность фотодинамической терапии ELD с использованием "Фотосенса™" в р-ре Гемодез (1) и "Фотосенса™" в физ. р-ре (2).
Это обеспечивает и более высокий уровень флуоресценции "Фотосенса™" на начальном этапе, и более быстрое выведение "Фотосенса™" из нормальной ткани в течение всего времени, что повышает селективность накопления.
При исследованиях терапевтической эффективности ФДТ облучение проводили через 3-4 ч после введения с плотностью мощности 220 мВт/см2 в течение 15 минут.
БЬБ в наших исследованиях характеризовалась медленным ростом - длительность латентной фазы роста составила 15 дней, а экспоненциальной - 28. Скорость роста опухоли, которая оценивалась по времени удвоения опухолей (Тф, в экспоненциальной фазе составила 8 дней. СПЖ в контрольной группе составила 45 дней (рис. 4).
В группе мышей после ФДТ с использованием "Фотосенса™" в р-ре Гемодеза время удвоения объема опухолей в экспоненциальной фазе роста увеличивалось почти в 2 раза и составило 15 дней. Значимое ТРО опухоли наблюдалось на +15 сутки = 52 % (р<0,05). Далее в течение следующих 28 дней ингибирующий эффект постоянно рос и на последних сроках достигал высоких и достоверных значений - ТРО = 76 % (р<0,05) (рис. 4-6). СПЖ в группе составила 61 день (рис. 5), продолжительность жизни увеличивалась на 36 % (р<0,05).
В группе мышей после ФДТ с использованием "Фотосенса™" в физ. р-ре время удвоения опу-
холей в экспоненциальной фазе роста практически не отличалось от контрольного (Td=9). С 9 по 25 сутки ингибирующий эффект слабо выражен, ТРО не превышало 46 %. К концу наблюдения эффект увеличивался, ТРО достигал достоверного и значимого значения 52 % (р<0,05) (рис. 6). СПЖ в группе составила 56 дней (рис. 5), продолжительность жизни увеличивалась на 24 % (р<0,05).
Таким образом, при выбранных условиях проведения ФДТ использование "Фотосенса™", разбавленного физ. р-ром, для ФДТ мышей с БЬБ дает невысокий кратковременный противоопухолевый эффект без существенного увеличения продолжительности жизни.
В то же время применение "Фотосенса™', разведенного в Гемодезе, позволять получить длительный высокий противоопухолевый эффект в отношении первичного узла БЬБ со значимым увеличением продолжительности жизни мышей.
Выводы
Совместное внутривенное введение фотосенсибилизатора "Фотосенса™' с ПВП повышает эффективность ФДТ, предположительно - за счет уменьшения агрегации молекул "Фотосенса™", а также способствует повышению селективности накопления "Фотосенса™" в опухоли по сравнению с нормальной тканью и более быстрому выведению "Фотосенса™" из здоровых тканей.
Литература
1. Ворожцов Г.Н., Дмитриева Н.Д.,Зелихина В.А. и др. Способ получения субстанции фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии. Патент РФ № 2220722, опубл. 10.01.2004.
2. Трухачева Т.В., Шляхтин С.В., Исаков Г.А., Истомин Ю.П. Фотолон - новое средство для фотодинамической терапии. Обзор результатов фармацевтических, фармакологических и клинических исследований. - Минск: РУП «Белмедпрепараты», 2009 г. - 64 с.
3. Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия в клинической онкологии. - Под ред. В.И. Чиссова, Е.В. Филоненко. - М.: «Триумф», 2012. - 269 с.
4. Edrei R., Gottfried V., van Lier J.E., Kimel S. Sulfonated phthalocyanines: photophysical properties, in vitro cell uptake and structure-activity relationships // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. - 1998. - 2(3). - P. 191-284.
5. Flock S.T., Jacques S.L., Wilson B.C. et al. Optical Properties of Intralipid: A phantom medium for light propagation studies // Lasers in Surgery and Medicine. - 1992. - 12. - P. 510-9.
6. Vanderpitte J., Roelants M., van Cleynenbreugel B. et al. Biodistribution and photodynamic effects of polyvinylpyrrolidone-hypericin using multicellular spheroids composed of normal human urothelial and T24 transitional cell carcinoma cells // Journal of Biomedical Optics. - 2011. - 16(1). - P. 018001-6.
7. van Staveren H.G., Moes C.J.M., van Marle J. et al. Light scattering in Intralipid-10% in the wavelength range of 400-1100 nanometers // Applied Optics. - 1991. - 30. - P. 4507-14.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДИ - доверительный интервал
ПВП -Поливинилпирролидон
СПЖ - средняя продолжительность жизни
ТРО - торможение роста опухоли
УПЖ - увеличения продолжительности жизни
ФС - фотосенсибилизатор
ELD - перевиваемая аденокарцинома Эрлиха
Е.В. Бочаров, В.Г. Кучеряну, О.А. Бочарова, А.Ю. Барышников
ВЛИЯНИЕ ФИТОАДАПТОГЕНА ПРИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОМ ПРИМЕНЕНИИ НА СОМАТИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ВЫСОКОРАКОВЫХ МЫШЕЙ СВА
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН, Москва
Задача исследования. Оценить соматическое состояние мышей линии СВА, предрасположенных к возникновению спонтанных гепатокарцином, при профилактическом воздействии комплексного фитоадаптогена фитомикса-40.
Материалы и методы. Фитомикс-40 - стандартизованный препарат, включающий компоненты 40 растительных экстрактов; обладает иммуномодулирующим, адгезиогенным, интерфероногенным, антимутагенным, антиоксидантным, радиопротекторным эффектами. В работе использовали 140 мышей-самцов линии СВА: 1 группа (п=70) - контрольная, мыши получали в качества питья воду; 2 группа (п=70) - опытная, мыши получали фитомикс-40 с питьевой водой в профилактическом режиме в течение 1-го месяца постнатального развития, включая критический период дифференцировки ткани печени. В позднем онтогенезе оценивали вес животных, их двигательную активность, наличие алопеции. Двигательную активность определяли в тесте «открытого поля» в автоматическом режиме с помощью системы 0рЮ-Уаптех-3.
Результаты. Вес мышей в опытной группе в возрасте 22 месяцев был выше, чем в контрольной (34,6±0,5 г и 24,4±0,2 г соответственно, р<0,01). Это сочеталось с подавлением у мышей опытной группы уровня сывороточных интерлейкинов -6 и -10, которые могут негативно регулировать патогенез кахексии животных, снижая сывороточный уровень С-реактивного белка и предотвращая при этом расщепление мышечных белков. Мыши опытной группы так же имели полноценный шёрстный покров. Снижение сывороточного уровня ИЛ-6 в этой группе может препятствовать потере шерсти в результате стимуляции функциональной активности волосяных фолликулов при подавлении воспалительного процесса в кожном покрове. У мышей контрольной группы в 16,6% случаев наблюдалась алопеция. Показатели двигательной активности (пройденный путь, время без движения, число «стоек», число мелких движений) у мышей опытной группы были достоверно выше, чем в контроле. Полученные результаты сочетались со снижением уровня спонтанного опухолеобразования и более высокой продолжительностью жизни у опытных животных.
Выводы. Профилактическое применение комплексного фитоадаптогена способствовало улучшению соматического состояния высокораковых мышей СВА на фоне снижения уровня спонтанного опухолеобразования.
