CC BY
38
Потенциальная опасность мяса птицы как фактора передачи кишечного иерсиниоза
Т.В. Каримова1 (adm@chumin.irkutsk.ru), В.Т. Климов2, М.В. Чеснокова2, М.Б. Черепанова2
1ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области» Роспотребнадзора, г. Новосибирск
2ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Резюме
Исследовано 99 смывов с тушек птицы оптово-розничных предприятий. Y. pseudotuberculosis и ее ДНК не обнаружены. Методом ПЦР в 59,6% случаев установлено наличие ДНК Y. enterocolitice, подтвержденное выделением 11 культур Y. enterocolitice 1А биотипа и одной культуры Y. entero^it^ 2-го биотипа серовара 09. Наличие у последней комплекса молекулярно-генетических (ail, ystA, ystB) и фенотипических (Са2+-зависимость и аутоагглютинабельность) признаков подтверждает реальную роль мяса птицы как фактора передачи кишечного иерсиниоза. Результативность ПЦР превышает результативность бактериологического метода в 4,9 раза, а экспрессность метода для оценки патогенных свойств Y. enterocolitica позволяет оперативно проводить комплекс противоэпидемических мероприятий.
Ключевые слова: иерсиниозы, мясо птицы, ПЦР, патогенность, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis
potential Danger of Fowl Meat as a Factor of Intestinal Yersiniosis Transmission
T.V. Karimova1 (adm@chumin.irkutsk.ru), V.T. Klimov2, M.V. Chesnokova2, M.B. Cherepanova2
1Federal Budget Institution of Public Health «Center of Hygiene and Epidemiology in the Novosibirsk Region»of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Novosibirsk
2Federal State Institution of Public Health «Irkutsk Antiplague Research Institute»of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance Abstract
Ninety nine washouts from poultry carcasses wholesale-retail enterprises were investigated. Yersinia pseudotuberculosis and its DNA failed to reveal. Y. enterocoliticа DNA presence confirmed by isolation of 11 Y. enterocolitюа 1А biotype cultures and one culture of Y. enterocoliticа biotype 2 serovar 09 was detected by PCR in 59.6%. Presence in the latter a complex of molecular-genetic (ail, ystA, ystB) and phenotypic (Ca2+-dependence and autoagglutination) properties proved a real role of fowl meat as a factor of intestinal yersiniosis transmission. PCR efficiency exceeded that of a bacteriological method in 4.9 times, and expressivity of a method for estimation of Y. enterocolitica pathogenic properties permit to conduct operatively a complex of anti-epidemic actions. Key words: yersinioses, fowl meat, PCR, pathogenicity, Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis
Введение
Иерсиниозы (псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз) - острые бактериальные инфекционные болезни, вызываемые энтеропатоген-ными иерсиниями (Yersinia pseudotuberculosis и Y. enterocolitica), - относятся к алиментарным сапрозоонозам с природной очаговостью и характеризуются симптомами общей интоксикации, полиморфизмом клинических проявлений с поражением желудочно-кишечного тракта, кожи, опорно-двигательного аппарата, других органов и систем, рецидивирующим и затяжным течением. Иерсиниозы имеют повсеместное распространение среди людей и животных во всех странах мира (Япония, Скандинавия, Восточная и Центральная Европа, Бразилия, США, Канада) [1]. Особенно
высокая заболеваемость отмечается в странах с высокоразвитой пищевой индустрией, где наряду со спорадической заболеваемостью нередко отмечаются эпидемические вспышки с фекаль-но-оральным механизмом передачи при употреблении контаминированных пищевых продуктов растительного и животного происхождения и питьевой воды.
В России проявления псевдотуберкулеза носят преимущественно эпидемический характер (2,1 ± 0,001 на 100 тыс. населения), факторами передачи Yersinia pseudotuberculosis являются пищевые продукты, которые обычно употребляются человеком без термической обработки, - капуста, морковь, лук, творог, молоко [2]. Резервуаром и источником инфекции при псевдотуберкулезе
являются мышевидные грызуны, сельскохозяйственные животные и домашние питомцы [3 - 5].
При кишечном иерсиниозе важное значение как источнику инфекции, отводится свиньям поскольку именно от них выделяется наибольшее количество патогенных штаммов Y. е^егосо1Шса се-роваров О:3 и О:9 [6]. Факторы передачи инфекции при вспышках, по данным зарубежных авторов, - свиное мясо, субпродукты, соевый сыр, молоко, пахта [7]. В России установлена обсемененность Y. е^егосо1Шса овощей, информации об истинной инфицированности продуктов животного происхождения недостаточно, имеются лишь единичные исследования в этом направлении [8, 9], данные же об инфицированности птицеводческой продукции в настоящее время отсутствуют. Эпидемические проявления болезни, вызванные этим возбудителем, носят спорадический характер (1,8 ± 0,001 на 100 тыс. населения).
Психрофильная природа иерсиний позволяет им размножаться на продуктах питания при температуре +4 - 10 0С и накапливаться при длительном хранении [3, 10, 11], обусловливая потенциальную биологическую опасность для человека.
При осуществлении эпидемиологического надзора за иерсиниозами большое значение придается эффективным методам лабораторной диагностики, обеспечивающим оперативную и достоверную ^ информацию об инфицированности возбудителями I продуктов питания. Наиболее приемлемый метод £ для этой цели - полимеразная цепная реакция ^ (ПЦР), которая в данном случае является альтер-л нативой бактериологическому исследованию, | поскольку обладает рядом преимуществ по срав-| нению с культуральным методом - высокой скоро-"о стью получения результата (несколько часов), ана-§ литической чувствительностью (единичные клетки), | избирательностью мишени (выявление специфиче-™ ского участка в геноме микроба) [12, 13]. § Цель работы - установление потенциальной
§ опасности мяса птицы как фактора передачи ки-| шечного иерсиниоза, оценка эффективности ПЦР I для определения энтеропатогенных иерсиний.
со
Материалы и методы
Для оценки роли мяса птицы как возможного фактора передачи энтеропатогенных иерсиний взяты смывы с 99 тушек кур, хранившихся в условиях холодильника торговых оптово-розничных предприятий. Исследование материала проводили методами ПЦР (электрофоретический вариант) и бактериологическим. Для ПЦР образцы смывов предварительно инкубировали в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) при температуре +4 - 6 °С в течение 48 и 72 часов. Пробы в количестве 100 мкл центрифугировали при 5000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость декантировали, а осадок суспендировали в таком же объеме дистиллированной воды и прогревали при 100 оС в течение 30 минут. Затем пробы по-
вторно центрифугировали в течение 1,5 - 2 минут при 8000 тыс. об/мин и в ПЦР-смесь вносили 5 мкл надосадочной жидкости.
Для детекции Y. pseudotuberculosis применили ПЦР с праймерами на ген инвазивности inv [14]. Для амплификации ДНК Y. enterocolitica использовали мультиплексную ПЦР с двумя парами праймеров на гены 16S РНК и ail [15]. Прайме-ры на 16S РНК позволяли определять видовую принадлежность к Y. enterocolitica, а праймеры на фрагмент ail-гена - обнаружить в материале ДНК патогенных Y. enterocolitica. В выделенных культурах иерсиний определяли ген термостабильного токсина ystA, обнаруживаемый у безусловно патогенных микроорганизмов Y. enterocolitica биотипов 1В, 2, 3 и 4, и ген ystB, выявляемый у Y. enterocolitica биотипа 1А [16]. Синтез оли-гонуклеотидных праймеров осуществляли в ЗАО «Синтол» (Москва). Последовательность прайме-ров, детерминирующие фрагменты ДНК, размер ампликонов и температура отжига представлены в таблице 1.
Параллельно делали первый и второй высевы на дифференциально-диагностическую среду СБТС (ГНЦПМиБ, пос. Оболенск Московской области), посевы инкубировали при температуре 28 оС в течение 48 часов. Третий высев на среду СБТС проводили на 5-е сутки со смывов, в которых был зарегистрирован положительный результат в ПЦР. Выделение и идентификацию культур, их био- и серотипирование выполняли согласно общепринятым методам [17].
Результаты и обсуждение
Возбудитель Y. pseudotuberculosis не обнаружен в смывах с тушек кур ни бактериологическим, ни ПЦР-методом. Мультиплексной ПЦР в 59 пробах (59,6%) выявлены специфические фрагменты ДНК Y. enterocolitica, в том числе в 58 пробах - с праймерами на фрагмент гена 16S РНК и в одном случае - на оба гена: 16S РНК и ail. При бактериологическом исследовании выделены 11 культур Y. enterocolitica 1A биотипа и одна культура Y. enterocolitica 2-го биотипа 09 серотипа (Y. enterocolitica 2/09). Результативность бактериологического метода составила 12,1% от общего числа исследованных проб и 20,7% - от числа полученных положительных результатов молеку-лярно-генетического исследования.
Для Y. enterocolitica 1A было характерно обнаружение в ПЦР гена ystB (у восьми штаммов - 72,7%). Фенотипические признаки, такие как Са2+-зависимость, аутоагглютинабельность при 37 °С, которые детерминируются плазмидой вирулентности pYV, были отрицательными.
В настоящее время вопрос об эпидемической значимости Y. enterocolitica 1A дискутируется. Предполагается, что они могут вызывать у человека гастроэнтерит, при котором ведущая роль принадлежит термостабильному токсину YSTb, имеющему
Таблица 1.
Праймеры, используемые для определения видовой принадлежности и патогенности иерсиний
Фрагмент гена Структура праймеров (5 - 3 ) Размер ампликона (н.п.) Температура отжига (оС) Ссылка на источник
inv 5~-TTTGGGTACTATCGCGGCGGA-3~ 5 ~ -CGTGAAATTAACCGTCACACT-3 ~ 295 66 [14]
16SРНК 5~-AATACCGCATAACGTCTTCG-3~ 5~-CTTCTTCTGCGAGTAACGTC-3~ 330 62 [15]
ail -TTAATGTGTACGCTGGAGTG-3 ~ -GGAGTATTCATATGAAGCGTC-3 ~ 425 62 [15]
ystA 5 ~ -ATCGACACCAATAACCGCTGAAG-3 ~ 5~-CCAFTCACTACTGACTTCGGCT-3~ 79 61 [16]
ystB -GTACATTAGGCCAAGAGACG-3~ -GCAACATACCTCACAACACC-3 ~ 146 61 [16]
Рисунок 1.
Схема лабораторного исследования на энтеропатогенные иерсинии
ystAч
I
Т
ystB-t
Идентификация культур:
- биохимические свойства;
- факторы патогенности;
- био- и серотипирование;
- плазмидный спектр
Патогенная Y.ent.
«Условно» патогенная Y.ent. 1А
Эпидемиологическое обслед ование очагов, проведение комплекса противоэпидемических мероприятий
Примечание: *Бактериологическое исследование на 5-е сутки проводится только для ПЦР-положительных образцов.
функциональное и структурное сходство с токсином энтеротоксигенных эшерихий [16, 18]. Ранее нашими исследованиями было установлено наличие гена ystB при отсутствии плазмиды pYV и гена ail у штаммов Y. enterocolitica 1A, выделенных от больных с выраженной клинической картиной гастроэнтерита [4]. Для Y. enterocolitica 2/09 были обнаружены следующие факторы патогенности: гены термостабильного энтеротоксина A и В (ystA, ystB), адгезии-инвазии (a/7), Са2+-зависимость и аутоагглю-тинабельность. Факт выделения этой патогенной иерсинии с тушек птиц установлен нами впервые.
Предложенный алгоритм лабораторного исследования, позволяющий уже на этапе экспресс-индикации/идентификации подозрительных коло-
ний типировать микроб по основным факторам патогенности (способность к адгезии-инвазии, наличие генов термостабильных энтеротоксинов, плазмиды вирулентности РУУ), представлен на рисунке 1.
Значительный процент выделения кишечных иерсиний из куриного мяса (59,6%), в том числе патогенной У. е^егосо1Шса 2/09, подтверждает, что мясо птицы - фактор реализации пищевого пути передачи кишечного иерсиниоза. Это необходимо учитывать при выяснении причин и условий возникновения единичных или множественных эпидемических очагов данной нозоформы. Контаминация пищевого продукта может происходить при прямом инфицировании в результате нарушения целостно-
сти тонкого кишечника при убое и разделке птицы, особенно в мелких фермерских хозяйствах и в домашних условиях. Не исключается, что мясо птицы может быть промежуточным фактором передачи кишечного иерсиниоза через загрязненные возбудителем оборудование пищеблока и руки персонала, что приводит к вторичному накоплению Y. е^егосо1Шса в готовых блюдах при условии нарушения технологии их приготовления или хранения.
Необходимость проведения комплекса противоэпидемических мероприятий (нейтрализация факторов передачи, поиск источника инфекции и активное выявление больных) в очагах решается эпидемиологом дифференцированно, с учетом результатов экспресс-индикации/идентификации иерсиний.
Выводы
1. Впервые с мяса птицы изолирована патогенная Y. е^егосо1Шса 2/О9, что свидетельствует о значении этого пищевого продукта как фактора передачи кишечного иерсиниоза.
2. Показано, что ПЦР эффективнее бактериологического метода в 4,9 раза и позволяет экс-прессно оценивать патогенность выделенных культур Y. е^егосо1Шса.
3. Обследование эпидемических очагов кишечного иерсиниоза и принятие управленческих решений целесообразно проводить, основываясь на результатах экспресс-индикации/идентификации патогенных иерсиний. ш
Литература
1. Annual epidemiological report on communicable diseases in Europe. Editors Andrew Amato-Gauci and Andrew Ammon. ECDC. Swedem. 2007: 254 259.
2. Tseneva G.Ya., Chesnokova M.V., Klimov V.T., Voskresenskaya E.A., Burgasova O.A., Sayapina L.A. et al. Pseudotuberculosis in the Russian Federation. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 954: 63 - 68.
3. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. Москва: Медицина; 2001: 256.
4. Чеснокова М.В., Климов В.Т., Иванова Л.К., Попов А.В. Эпидемиологические аспекты псевдотуберкулеза и иерсиниоза в России. В кн.: Иерсинии и иерсиниозы. Г.Я. Ценева, ред. Санкт-Петербург: OOO «Бастинон»; 2006: 7 - 35.
5. Backhans A., Fellstr m C., Lambertz S.T. Occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in small wild rodents. Epidemiol. Infect. 2011; 139 (8): 1230 - 1238.
6. Kapperud G. Yersinia enterocolitica in food hygiene. Int. J. Food. Microbiol. 1991; 12 (1): 53 - 66.
7. Arora D., Menta N., Saini R. Epidemiological pattern and detection of Yersinia enterocolitica in food of animal origin: a review. J. Cell Tissue Res. 2012; 12 (1): 3021 - 3028.
8. Рыбакова H.A., Ценева Г.Я., Смирнова Е.Ю., Тебекин А.Б., Евсюкова H.A., Литвинова Р.Г. Эпидемиологический мониторинг иерсиниозов в практике государственного санитарно-эпидемиологического надзора. Здоровье населения и среда обитания. 2004; 6 (135): 12 - 17.
9. Иерсиниозы в Российской Федерации. Информационный бюллетень (Санкт-Петербург) 2014. Вып. 1. Доступно на: http://pasteurorg.ru/nauchnaya-produktsiya.
10. Aulisio С.С^., Mehlman I.J., Sanders A.C. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol. 1980; 39: 135 - 140.
11. Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т., Малов И.В., Марамович А.С. Псевдотуберкулез. Новосибирск: Наука; 2003: 320.
12. Чеснокова М.В., Климов В.Т., Марамович А.С., Антонюк В.Я., Бренева Н.В. Оценка эффективности полимеразной цепной реакции при расследовании вспышек псевдотуберкулеза. Журн. микробиол. 2003; 3: 7 - 11.
13. Fukushuma H., Shimizu S., Inatsu Y. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis detection in food. J. Pathogens. 2011. Article ID 7353308: 9.
14. Wang R.F., Cao W.W., Cerniglia C.E. A universal protocol for PCR detection of 13 species of footborne pathogens in foods. J. Appl. Microbiol. 1997; 83: 727 - 736.
15. Wim J.B., Wannet M., Reessink H.A., Brunings H.M.E. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2001; 39 (12): 4483 - 4486.
16. МУ 3.1.1.2438-09 «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Методические рекомендации. Утв. Руководителем Роспотребнадзора Г.Г. Онищенко 22.01.2009 г. Москва; 2009: 66.
17. Thoerner P., Bin Kingombe C.I., B gli-Stuber K., Bissing-Choisar B., Wassenaar T.M., Frey J., Jemmi T. PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and investigation of virulence gene distribution. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69 (3): 1810 - 1816.
18. Ramamurthy T., Yoshino Ki, Huang X., Balakrish Nair G., Carniel E., Maruyama T. et al. The novel heat-stable enterotoxin subtype gene (ystB) of Yersinia enterocolitica: nucleotide sequence and distribution of the yst genes. Microb Pathog. 1997; 23 (4): 189 - 200.
References
1. Annual epidemiological report on communicable diseases in Europe. Editors Andrew Amato-Gauci and Andrew Ammon: ECDC. Swedem. 2007: 254 - 259.
2. Tseneva G.Ya., Chesnokova M.V., Klimov V.T., Voskresenskay E.A., Burgasova O.A., Sayapina L.A. et al. Pseudotuberculosis in the Russian Federation. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 954: 63 - 68.
3. Somov G.P., Pokrovsky V.l., Besednova N.N., Antonenko F.F. Pseudo-tuberculosis. Moscow: Medicine; 2001: 256 (in Russian).
4. Chesnokova M.V., Klimov V.T., Ivanova L.K., Popov A.V. Epidemiological aspects of pseudotuberculosis and yersiniosis in Russia. In Book: Yersinia and yersinioses. Editors prof. G.Ja.Tseneva. Saint.-Petersburg; 2006: 7 - 35 (in Russian).
5. Backhans A., Fellstrom C., Lambertz S.T. Occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in small wild rodents. Epidemiol. Infect. 2011; 139 (8): 1230 - 1238.
6. Kapperud G. Yersinia enterocolitica in food hygiene. Int. J. Food. Microbiol. 1991; 12 (1): 53 - 66.
7. Arora D., Menta N., Saini R. Epidemiological pattern and detection of Yersinia enterocolitica in food of animal origin: a review. J. Cell Tissue Res. 2012; 12 (1): 3021 3028.
8. Rybakova N.A., Tseneva G.Ya., Smirnova E.Yu., Tebekin A.B., Evsiukova N.A., Litvinova R.G. Epidemiological monitoring of yersinioses in practice of the State sanitary and epidemiologic surveillance. Zdorovie naseleniya i sreda obitaniya. 2004; 6 (135): 12 - 17 (in Russian).
9. Yersinioses in the Russian Federation. The newsletter. Issue.1. St. Peterburg; 2014. Avaible at: http://pasteurorg.ru/nauchnaya-produktsiya (in Russian).
10. Aulisio C.C.G., Mehlman I.J., Sanders A.C. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol. 1980; 39: 135 - 140.
11. Shurygina I.A., Cesnokova M.V., Klimov V.T., Malov I.V., Maramovich A.S. Pseudotuberculosis. Novosibirsk: Nauka; 2003: 320 (in Russian).
12. Chesnokova M.V., Klimov V.T., Maramovich A.S., Antoniuk V.Ya., Breneva N.V. Estimation of efficiency of polymerase chain reaction in investigation of pseudotuberculosis outbreaks. Zhurn. mikrobiol. 2003; 3: 7 - 11 (in Russian).
13. Fukushuma H., Shimizu S., Inatsu Y. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis detection in food. J. Pathogens. 2011. Article ID 7353308: 9.
14. Wang R.F., Cao W.W., Cerniglia C.E. A universal protocol for PCR detection of 13 species of footborne pathogens in foods. J. Appl. Microbiol. 1997. 83: 727 - 736.
15. Wim J.B., Wannet M., Reessink H.A., Brunings H.M.E. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2001. 39 (12): 4483 - 4486.
16. Methodical Guideline 3.1.1.2438-09 «Epidemiological surveillance and prevention of pseudotuberculosis and intestinal yersiniosis. Methodical Recommendations. 22.01.2009. Moscow; 2009: 66 (in Russian).
17. Thoerner P., Bin Kingombe C.I., Bogli-Stuber K., Bissing-Choisar B., Wassenaar T.M., Frey J., Jemmi T. PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and investigation of virulence gene distribution. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69 (3): 1810 - 1816.
18. Ramamurthy T., Yoshino Ki, Huang X., Balakrish Nair G., Carniel E., Maruyama T. et al. The novel heat-stable enterotoxin subtype gene (ystB) of Yersinia enterocolitica: nucleotide sequence and distribution of the yst genes. Microb Pathog. 1997; 23 (4):189 - 200.
