CC BY
11
УДК 618.33:575.224.4(477-25)
Д. О. Микитенко , О.1. Тимченко
ПОШИРЕН1СТЬ ПОЛ1МОРФ1ЗМ1В ГЕНА МЕТИЛЕНТЕТРАГ1ДРОФОЛАТРЕДУКТАЗИ СЕРЕД ПОРОД1ЛЬ КШВСЬКОГО РЕГ1ОНУ
Клiнiкарепродуктивное медицини «Надiя» (дир. - к. мед. н. В. Д. ЗуКн)
ДУ «1нститут гтени та медично'1 екологИ АМН Украти» (дир. - д. мед. н., академж АМН Украти А. М. Сердюк) м. Киш
Ключовi слова: метилентетра-г1дрофолатредуктаза, пол1морф1зм, патолог1я вагтних та плоду Key words:
methlylentetrahydrofolate reductase, polymorphism, pregnant and fetus pathology
Резюме. Исследовано распространение полиморфизмов С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы среди рожениц Киевского региона и верифицированы результаты исследования. Показано, что распространение 677СС генотипа составило 60,0%, СТ - 31,11%, ТТ -8,89%. Частота 1298 АА генотипа была равна 42,96%, АС - 47,41%, СС -9,63% с 95%-доверительным интервалом ошибки выборки ±8,4%. Сделаны выводы в отношении необходимости усовершенствования лечебно-профилактических мероприятий соответственно генотипу по данным локусам. Определена группа риска женщин, которым рекомендовано проведение молекулярно-генетического исследования на носительство С677Т и А1298С полиморфизмов гена MTHFR.
Summary. It is studied the distribution of polymorphisms of methlylentetrahydrofolate reductase gene C677T and A1298C among parturients of Kyiv region and the obtained results were verified. It is shown that distributions of 677CC genotypes was as follows:: CC - 60.0%, CT - 31.11%, TT - 8.89%. The frequency of1298 AA genotype is 42.96%, AC - 47.41% and CC - 9.63% with a reliable interval of error 95% confidence interval ± 8.4%. The necessity of improvement ofpreventive measures in accordance with MTHFR genotype is confirmed. The group of women with the increased risk of MTHFR-associatedpathology development who are recommended to undergo investigation for the genotype MTHFR 677 and 1298 is defined.
Проблема патологи ваптних та плоду в умовах нишшшх темшв депопуляци в Украш вирiзняeться винятковою актуальшстю та сощально-медичною значущютю [1]. II найбшьш ютотним каталiзатором виступае вщсутшсть у державi ефективно! сощально! пол^ики, в т.ч. у сферi медицини. Причому поширешсть дано! патологи протягом останшх роюв продовжуе лише наростати та сшввщноситься з неспри-ятливою динамшою здоров'я ваптних та ново-народжених. Адекватна профшактика акушерсь-ко! патологи дозволить не лише уникнути розвитку критичних для матерi та плоду сташв, що потребуватимуть застосування штенсивних лшувальних заходiв та передчасного родороз-ршення, а й знизити рiвень перинатально! патологи та частоту вроджених аномалш. Причому об'ектом профшактичних заходiв мають бути фактори середовища та харчування, що тд-даються корекци.
Важливу роль у патогенезi значно! частини патологи ваптних та плоду вщпрае гомоцисте!н [14]. Щцвищення його рiвня в плазмi кровi матерi е патогенетичною причиною порушення процесiв iмплантацп, плацентаци, фетоплацен-
тарно! недостатностi [13], прееклампси [17; 18], вiдшарування плаценти [17] та народження дитини з низькою вагою й зниженим резервом життезабезпечуючих систем оргашв тощо [12]. Проникаючи через плаценту, ця амшокислота може спричиняти прямий тератогенний та фетотоксичний вплив [17], що призводить до виникнення дефекпв нервово! трубки та краню-фацiальних вад [8], а через порушення процесiв метилування та сегрегаци хромосом в ооцитах матерi - до тдвищеного ризику народження дитини з трисомiею 21 хромосоми [19]. Звщси випливае нагальна актуальнiсть дiагностики п-пергомоцистешеми та етюлопчно! й патоге-нетично! И корекци.
Одним iз основних засобiв профiлактики ппергомоцистешеми та вроджених вад розвитку плоду вважаеться фолiева кислота [6], порушення метаболiзму яко! в той же час е одшею з першопричин пiдвищеного рiвня гомоцисте!ну [14] та спостерпаеться за носiйства мутантних алелей гена метилентетрагiдрофолатредуктази (МТИЕЯ) за 677 та 1298 сайтами [9; 16]. Тож, застосування фола^в iз профшактичною метою вимагае iндивiдуального тдходу до кожного
пащента з огляду на його генотитчний профшь [4; 5].
Проте проблематика поширеносп полiмор-фiзмiв С677Т та А1298С серед населення Украши вкрай недостатньо охоплена науковими достд-женнями. Нез'ясованим остаточно залишаеться у свт i !хиш зв'язок з акушерською та перинатально! патологiею. Це пов'язано з тим, що полiморфiзми простих нуклеотидiв не е виключ-ними детермiнантами патологи, оскiльки !х клiнiчна значущiсть першочергово визначаеться особливостями харчового статусу, способом та умовами життя населення певно! територи [15], що зумовлюе варiацil !х ктшчних проявiв у рiзних регiонах та вшових групах вагiтних.
У зв'язку з цим метою дослщження стало дослщження поширеностi полiморфiзмiв С677Т та А1298С гена МТИЕЯ серед породшь Кшвсь-кого регiону.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ
Дослiдження проведено iз залученням 135 породiль, що проходили родорозршення протя-гом квiтня-червня 2009 року на базi Кшвського обласного центру охорони здоров'я матерi i дитини (КОЦОЗМiД). Всi жшки бути прошфор-мованi та надали згоду на використання кл> шчно! шформаци з науковою метою. КОЦОЗМiД було вибрано за базу дослщження з метою уникнення необхщносп вiдбору породшь iз декiлькох мiсць Ки1всько1 област та м. Киева, оскiльки в цш установi перебувають вагiтнi, що проживають на обох територiях. Породш включались у дослiдження шляхом ймовiрнiсноl вибiрки. Це дозволяе вважати отриману вибiрку якiсно репрезентативною вiдносно Кшвського регiону.
Параметри дослiджувано! групи породшь за вшом були наступними: мшмальний вiк стано-вив 17 роюв, максимальний - 40 рокiв, середнш - 27,51 ± 6,08 р. Вш 50% породiль знаходився в межах 23 32 роки. Захворювання статевих ор-ганiв мали 55 (40,74%) породiль. На екстрагеш-тальну патологiю страждали 58 (42,96%) жшок. Одночасно наявнiсть захворювань статевих орга-нiв та екстрагенiтальноl патологи спостер^алась у 22 (16,30%) породшь. Безплщдя в анамнезi мали 5 (3,70%) ж1нок, з них ваптшсть у однiеl породiллi настала за участю допомiжних репро-дуктивних технологш. Чоловiчого фактора без-плiддя жодна з жшок в процес анкетування не вщм^ила.
З метою виключення впливу вiкового та токсичного фактору у вибiрку не включенi породш понад 40 рокiв, тi, що мали професшний контакт iз токсичними речовинами в анамнез^
багатоплiдну ваптшсть, мертвонародження пiд час даного родорозршення, зловживали алкоголем (до чи шд час вагiтностi).
Матерiалом для дослщження слугував зразок венозно! кровг Забiр здiйснювався у вакуумнi стерильш пробiрки, обробленi лiтiй-гепарином (Sarstedt, Шмеччина), об'емом 1,2 мл. Видiлення ДНК проводилося з використанням комерцш-ного набору QIAmp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Шмеччина) згiдно з рекомендацiями виробника. Дослiдження полiморфiзмiв гена MTHFR здiйснювалось проведенням полiме-разно! ланцюгово! реакци (ПЛР) у режимi реального часу з наступною дискримiнацieю алелей при використаннi 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) з програмним за-безпеченням SDS v1.4. Дослiдження проводилось на основi комерцiйного тест-набору TaqMan® Genotyping Assays (Applied Biosystems, США) SNP ID hCV1202883 (refSNP rs1801133) для С677Т та hCV850486 (rs1801131) для А1298С з умовами, рекомендованими виробни-ком.
Розрахунок вибiрково! помилки при екстра-поляци результатiв дослiдження здшснений з використанням формули вибiркового обстеження
[3] (1):
d = z „
V
а
, N,
n
(1),
де: d - помилка B^ipKOBOi долц za - по-казник кратносп помилки обсягу вибiрки, який для piBM значущостi критерив P<0,05 рiвний 1,96 (табличне значення); N - обсяг генеральш! сукупност^ оаб; n -обсяг вибiрки, осiб; с -частка дослщжувано! ознаки у генеральнш сукупностi. В умовах, коли розрахунок вщбу-ваеться за якюно альтернативною ознакою i невiдома !! частка у генеральнiй сукупностi, як у нашому випадку, приймаеться значення с = 0,5 (до того ж, цей показник вважаться доцшьним з огляду на дослiдження [7]), оскшьки дисперсiя у таких випадках досягае максимуму [3].
Моделювання комбшацш генотипiв за 677 та 1298 локусами гена MTHFR проведено за використання програмного забезпечення Haplo-view 4.1 [10]. Достовiрнiсть результатiв моделювання ощнювалася за критерiем LOD (Logarithm of Odds) [11].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Попри достатньо широку вивченiсть наве-дених полiморфiзмiв, !х поширенiсть у межах Укра!ни лишаеться недостатньо вивченою. Так, шонерським можна вважати дослiдження, що
09/ Том XIV/ 3
101
проводилось на територп Харювсько! область За його результатами встановлено, що частота 677 СС, СТ та ТТ генотитв складае 52,26%, 40,70% та 7,04% вщповщно (частота Т-алеля - 27,39%). Аналогiчно, 1298 АА, АС та СС - 52,00%, 39,50%, 8,50% вщповщно (частота С-алеля -28,25%) [7]. Позитивно ощнюючи результати цитовано! пращ, вщзначимо, що у вищена-веденiй робот не висвiтленi особливостi форму-вання вибiрки, що унеможливлюе екстраполяцiю наведених частот на рiвень областi та держави в цшому. Тому, з огляду на ушкальшсть кожно! популяци за особливостями генотипу та умовами життя, питання встановлення iстинних меж частот поширення мутантних алелiв серед жь ночого населення Украши й дос лишаеться актуальним.
При проведеннi дослщження у породiль Кшвського регiону, що були включен у дослiд-ження, було визначено генотип за 677 та 1298 сайтами гена МТИЕЯ. Результати зведено в таблицю 1.
Таблиця 1
Поширення полiморфiзмiв С677Т та А1298С серед породшь Кшвського регюну
Сайт, генотип Поширетсть пол1морф1зм1в
абс. Ввди., %
677 сайт
СС 81 60,00
СТ 42 31,11
ТТ 12 8,89
Всього 135 100,00
1298-сайт
АА 58 42,96
АС 64 47,41
СС 13 9,63
Всього 135 100,00
ностi взято середнiй трирiчний показник кшь-костi народжених осiб за 2006-2008 роки за даними Головного управлшня статистики в Кшвськш областi [2], тобто 18652 особи (2006 р. - 17383 дггей, 2007 р. - 18378, 2008 р. - 20195). В дшсносп це число буде дещо перевищувати загальну кiлькiсть жшок, що вщповщають вста-новленим критерiям, в област загалом, однак це не е недолгом через те, що зумовлюе засто-сування додатково бiльш жорстких вимог до розрахунку обсягу вибiрки. Таким чином, з формули (1) випливае розрахунок (2):
d = 1.96
0.5(1 - 0.5)^. 135 1 —
135
18652,
0.084 (2)
Вiдтак, проведенi дослiдження дозволяють встановити частоту поширення алельних варь антiв гена МТИЕЯ серед породшь Кшвського регюну з помилкою вибiрковоl долi 0,084 (або 8,4%). Тобто, з рiвнем значущостi Р<0,05 ютинна популяцiйна частота поширення дослiджуваних полiморфiзмiв у когортi жшок, якi вщповщають критерiям вiдбору, не буде вiдрiзнятись вiд розрахунково! бiльш нiж на 8,4%.
Зауважимо, що при проведенш дослiдження в жодному випадку не було виявлено гере-тозиготного носiйства мутаци за одним iз сайтiв одночасно з гомозиготним носшством мутаци за шшим (тобто, 677 СТ та 1298 СС, або 677 ТТ та 1298 АС одночасно), а також одночасного гомозиготного носшства мутаци за обома сайтами (тобто, 677 ТТ та 1298 СС одночасно), що наведено в таблищ 2.
Таблиця 2
Комбшащ*1 генотишв за С677Т та А1298С у дослщжуваних пород1ль
Як випливае з наведених результапв, кiль-кiсть носив полiморфiзму С677Т в гетеро- та гомозиготному сташ (СТ + ТТ) становила 54 (40,9%) особи. Вщтак, частота нормального («дикого») С-алелю склала 75,56%, мутантного Т-алелю - 24,44%. Кшьюсть носilв А1298С полiморфiзму в гетеро- та гомозиготному сташ (АС + СС) склала 77 (57,04%) оаб, причому, частота нормального («дикого») А-алелю склала 66,67%, мутантного С-алелю - 33,33%.
Для екстраполяци отриманих даних на рiвень Ки!вського регюну як обсяг генеральное' сукуп-
Сайт, oci6 1298 сайт Всього, оаб
677 сайт АА 1 АС | СС
СС 30 38 13 81
СТ 16 26 - 42
ТТ 12 - - 12
Всього, оаб 58 64 13 135
Варто зазначити, що iншi дослiдники також не виявили зазначених комбiнацiй генотитв [7; 8]. При цьому [8] припустив, що мутаци за вказаними сайтами виникли еволюцшно не-залежно одне вщ одного та запропонував розглядати таке явище в якосп неврiвноваженого зчеплення (eng.: linkage disequilibrium) [8, 11]. Як
зрозумшо з отриманих власних результатiв та цитованих праць, на однiй xpoMOCOMi з пари, що мiстить ген MTHFR (1р36.3), з дослiджуваних локушв може одночасно бути мутантним лише один. Проте, залишаються нез'ясованими питання: чи можуть взагалi обидва мутантш локуси одночасно знаходитись на однш хро-мосомi та чи може виникнути така комбiнацiя мутацiй випадково або в результатi процесу рекомбшаци хромосом? З метою отримання вщповщ на це питання було проведено вiр-туальне моделювання можливих комбшацш генотипiв за дослiджуваними сайтами гена MTHFR з використанням програми Haploview 4.1. За даними побудовано! моделi частота носiйства «дикого» 677 С-алелю складала 75,8%, мутантного 677 Т-алелю - 24,2%. За 1298 сайтом: «дикого» А-алелю - 64,2%, мутантного 35,8%. Змодельоваш частоти комбiнацiй були наступними: 677С/1298А - 40,0%, 677С/1298С -35,8%, 677Т/1298А - 24,2%, 677Т/1298С - 0%. Тобто, комбшаци 677Т/1298С також не було змодельовано. Статистична достовiрнiсть роз-рахунюв при цьому склала Р<0,0001 (LOD>3,0). Отримаш розрахунковi данi спiввiдносились iз результатами власних ктшчних спостережень в межах встановлено! вибiрково! помилки, що тдтверджуе iстиннiсть та репрезентативнiсть отриманих в результат клiнiчних спостережень даних, а також правильшсть вибору методу фор-мування вибiрки.
Таким чином, можна заключити, що близь-кiсть знаходження полiморфних сайтiв унемож-ливлюе розходження даних локушв в процесi рекомбшаци хромосом. Вщтак, мутантнi алелi за 677 та 1298 сайтами, що виникли незалежно одне вщ одного не можуть бути присутшми одночасно на однiй хромосома Це й обумовлюе такi особливосп комбiнацiй генотипiв за С677Т та А1298С полiморфiзмами гена MTHFR, що спо-
стерiгались як у наших дослщженнях, так i у роботах попередниюв. Проте питання можли-вост виникнення одночасно на однiй хромосомi таких полiморфiзмiв шляхом випадково! мутаци та сумiснiсть тако! комбiнацi! з життям лиша-еться вiдкритим для подальшого дослiдження.
ВИСНОВКИ
У результат проведеного дослiдження встановлено поширешсть полiморфiзмiв гена мети-лентетрагiдрофолатредуктази серед породшь Ки!вського регiону та верифшовано отриманi результати шляхом моделювання, що дозволяе заключити наступне:
1. Частота 677 СС генотипу серед породшь Ки!вського регюну складае 60,0%, СТ - 31,11%, ТТ - 8,89%. 1298 АА генотипу - 42,96%, АС -47,41%, СС - 9,63% з 95%-довiрчими межами вибiрково! помилки ±8,4%.
2. Кожна популящя е ушкальною за частотою мутантних алелiв та середовищем iснування, а оскшьки останне переважно й визначае ктшчш асоцiацi! полiморфiзмiв, це необхщно врахову-вати при провадженнi профшактичних заходiв. Вiдтак, не можна екстраполювати результати дослщження поширеностi полiморфiзмiв та !х клiнiчно! значущостi в одному регюш на iнший без проведення додаткових дослiджень.
3. Рекомендувати жшкам, що мають схильнiсть до соматично! гомоцисте!н-асоцiйовано! патологi!, мали проблеми, пов'язанi з жiночим фактором безплщдя, чи вагiтнiсть котрих в анамнезi перебiгала з ускладненнями, а також тим, що мали плщ з уродженими кранюфащальними вадами чи патолопею нервово! трубки, рекомендувати генотипування за 677 та 1298 локусами гена MTHFR з наступною модифшащею лшувально-профшак-тичних рекомендацiй вiдповiдно до встановле-ного генотипу.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Генофонд 1 здоров'я: поширешсть 1 чинники ризику виникнення щшин губи 1/або пвднебшня / О. 1.Тимченко, Т.А.Приходько, 1.П.Линчак, 1.П. Кривич. - К. : Медшформ, 2008. - 155с.
2. Демограф1чна ситуащя. Населення (1995-2009 рр.) [ Електронний ресурс ] / ГУ статистики у Ки-!вськш обласл. - http://www.oblstat.kiev.ua.
3. Дубина И. Н. Математические основы эмпирических социально-экономических исследований: учебное пособие. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2006. - 283 с.
4. Запорожан В. М. Набуп та генетичш форми тромбофшй в патогенез! акушерсько! патологи / В.
М. Запорожан, В. I. Лшшков // 1нтегративна антрополог. - 2006. - №2(8). - С. 3 - 7.
5. Микитенко Д.О. Вплив пвдвищених piBrnB го-моцисте!ну на виникнення патологй' ваптних та вроджених вад розвитку плоду / Д. О.Микитенко, О. I. Тимченко // Актуальш питання ппени та екологiчноï безпеки Укра!ни: збipка тез доповвдей науково-прак-тичноï конференци молодих вчених (П'ятi марзе-eвськi читання), 21-22 травня 2009 року, м.Ки!в. - К., 2009. - Вип. 9. - С. 107 - 110.
6. Первинна профшактика вроджено! i спадковоï патологи: методичш рекомендаци. - К.: Мшстерство охорони здоров'я, 2001. - 27 с.
09/ Том XIV/ 3
103
7. Поиск фено- и генотипических соотношений при дефектах фолатного цикла за пределами обычной генетики (часть II) / Е. Я. Гречанина, Р. Маталон, Ю. Б. Гречанина [и др.] // Ультразвукова перинатальна д1агностика. - 2008. - № 26. - C. 3-14.
8. A second common mutation in the methy-lenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects? / N. M. van der Put, F. Gabreëls, E. M. Stevens [et al.] // Amer. J. Human Genetics. - 1998. - Vol. 62, N 5. - P.1044-1051.
9. Bailey L. B. Folic acid supplements and fortification affect the risk for neural tube defects, vascular disease and cancer: evolving science / L. B. Bailey, G. C. Rampersaud, G. P. A. Kauwell // J. Nutrition. - 2003. - Vol. 133, N 6. - P. 1961S-1968S.
10. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps / J. C. Barrett B. Fry , J. Maller, M. J. Daly // Bioinformatics. - 2005. -Vol. 2, N2. - P. 263 -265.
11. Linkage Disequilibrium and Association Mapping / edited by A. R. Collins. - Totowa: Humana Press Inc. - Series: Methods in Molecular Biology.- 2007. -Vol. 376. - 255 p.
12. Maternal Homocysteine before Conception and throughout Pregnancy Predicts Fetal Homocysteine and Birth Weight / M. M. Murphy, J. M. Scott, V. Arija [et al.] // Clinical Chemistry. - 2004. - Vol. 50, N 4. - P.1406-1412.
13. Maternal MTHFR polymorphism and risk of spontaneous abortion / M. d. R. Rodrígues-Guíllen, L. Torres-Sanches, J. Chen [et al. ] // Salud Pública de México. - 2009. - Vol. 51, N 1. - P. 19-25.
14. Medina M. Roles of homocysteine in cell metabolism: old and new functions. / M. Medina, J.Uradiales, M. Amores-Sauches // Eur. J. Biochemistry. - 2001. - Vol. 268, N 14. - P. 3871-3882.
15. Miller M. S. Genetic polymorphisms and susceptibility to disease / M. S. Miller, M. T. Cronin. -Boca Raton : CRC Press, 2000. - 266 p.
16. Mills J. L. Fortification of foods with folic acid -how much is enough? / J. L. Mills // New Engl. J. Medicine. - 2000. - Vol. 342, N 19. - P. 1442-1445.
17. Plasma total homocysteine, pregnancy complications, and adverse pregnancy outcomes: the Hordaland Homocysteine Study / S. E. Vollset, H. Refsum, L. M. Irgens [et al.] // Amer. J. Clinical Nutrition . - 2000. -Vol. 71. - P. 962-968.
18. Wilkins-Haug L. Inherited thrombophilia and adverse pregnancy out-comes: What the evidence shows. / L. Wilkins-Haug // OBG Management. - 2003. - April Issue. -P. 34 - 48.
19. Zintzaras E. Maternal gene polymorphisms involved in folate metabolism and risk of Down syndrome offspring: a meta-analysis / E. Zintzaras // J. Human Genetics. - 2007. - Vol.52, N 11. - P. 1434 - 1461.
♦
ТОКСИЧН1СТЬ ТА ДЕЯК1 СТОРОНИ ТОКСИКОДИНАМ1КИ КОМБ1НОВАНОГО ФУНГЩИДУ СУЛЬФОКАРБАТЮНУ ПК
УДК 632.952: 615.9
1.М. Пельо Л.М. Шкарапута , С. Т. Омельчук,
Л.М. Састович ,
**
В.В. Даниленко , Л. О. Тищенко , Л.А. Шевченко
1нститут гтени та екологи Нацюнального медичного ymíeepcumemy ÍMern О. О.Богомольця м. Kuie
1нститут бюоргатчно'1 xímíí та нафтохiмii НАН Украши м. Kuie
K^ronoBi CTOBa: cynb$oKap6amioH nK, moKcuuHicmb, nodpa3Hmmua din, cmергеннi enacmueocmi, геnaтотоксицнiстb Key words: sulfocarbatione PK, toxicity, irritant action, allergic properties, hepatotoxicity
Резюме. В результате токсикологического изучения установлено, что новый комбинированный фунгицид Сульфокарбатион ПК умеренно опасен при поступлении в организм животных различными путями, не оказывает выраженного местно-раздражающего действия, не аллерген. При повторном введении оказывает слабое гепатотоксическое действие.
Summary. As the result of toxicologic study it was determined that a new combined fungicide Sulphocarbatione PK is moderately dangerous on entry by means of different ways into animals' organism, does not cause marked locally-irritating effect, it is not an allergen. On repeated introduction it causes a slight hepatotoxic action.
