CC BY
56
ПОРТАТИВНАЯ БИОАНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА НА ОСНОВЕ ДИХРОМЕТРА С ВЕРТИКАЛЬНОЙ СХЕМОЙ ОСВЕЩЕНИЯ ГЕЛЕВЫХ ОБРАЗЦОВ ДНК-БИОДАТЧИКОВ
В. М. Гусев, С. Ф. Кольяков, О. Н. Компанец, А. М. Павлов, М. А. Павлов,
Институт спектроскопии РАН, 142190, Троицк Московской обл., onkomp@isan.troitsk.ru;
Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН
Создан экспериментальный образец биосенсорной аналитической системы на основе портативного полифункционального спектрометра кругового дихроизма СКД-3 с вертикальной схемой освещения гелевых образцов ДНК-биодатчиков. Проведены пробные эксперименты, демонстрирующие при помощи созданной портативной биоаналитической системы разрушение наноконструкций ДНК в составе гидрогеля под действием биологически активных соединений и ее аналитические возможности.
1. Особенности аналитической системы на основе ДНК-биодатчиков
Разработанная портативная биоаналитическая система реализует возможности биосенсорного метода определения биологически активных и токсичных соединений (БАС) в жидкости [1], в котором в качестве биодатчиков используются наноконструкции ДНК (разработка ИМБ РАН), а регистрация изменений аномального сигнала кругового дихроизма (КД) при взаимодействии БАС с ДНК-биодатчиками осуществляется с помощью портативного дихрометра (разработка ИСАН).
Образцы не имеющих аналогов гелевых ДНК-биодатчиков получены в ИМБ РАН в результате разработки новой технологии направленного конструирования нанобиоматериалов, основанной на «сшивании» соседних молекул ДНК в частицах их холестерических жидкокристаллических дисперсий искусственными наномостиками. Образование наноконструкций (НаК) ДНК с упорядоченной пространственной структурой сопровождается амплификацией аномальной оптической активности в полосе поглощения ДНК с ^max~270 нм, характерной для исходных холестериков, а также появлением новой оптической активности в полосе поглощения компонентов наномостиков c ^max~500 нм, вводимых в НаК.
Анализируемым образцом (пробой) в данном методе является оптически изотропный, прозрачный гидрогель с распределенными в нем НаК ДНК, который обрабатывается исследуемой жидкостью, содержащей в малой концентрации определяемое БАС. Регистрируемая дихрометром степень уменьшения амплитуды аномальных полос в спектре КД наноконструкций ДНК может быть прямо связана с концентрацией диффундирующего в гидрогель БАС, тем или иным способом нарушающего целостность структуры специфических наномостиков между молекулами ДНК или самих молекул ДНК в составе наноконструкций.
На рынке спектрометров КД представлено большое число спектрополяриметров и дихрометров, выпускаемых известными фирмами Jobin Yvon (Франция), Shimadzu (Япония), Jusco (Япония), Applied Photophysics Ltd (Англия) и др.. Все они имеют чувствительность регистрации сигнала КД ЛА/A на уровне 10-5-10-6, но при этом достаточно громоздки, дороги, требуют квалифицированного персонала и не предназначены для работы с биодатчиками. С другой стороны, в ИСАН (Троицк) разработаны портативный полифункциональный дихрометр СКД-2 (№ 26900-04 в Государственном реестре средств измерений) на рабочий диапазон 250-750 нм и его усовершенствованная модель СКД-2М с расширенным в УФ область (до 220 нм) диапазоном, которые эффективно используются во многих лабораториях в сочетании с жидкокристаллическими биодатчиками на основе ДНК «пробирочной формы» для определения низких концентраций ряда БАС как в тестовых растворах, так и плазме крови [2, 3]. Высокая эффективность такой аналитической системы
(оптического биосенсора) совместной разработки ИМБ РАН и ИСАН, ее новизна и значимость подтверждены в 2006 г. дипломами Торгово-промышленной Палаты РФ, выставки «Инновационные достижения» (С.-Петербург) и III специализированной выставки нанотехнологий и материалов (Москва). Оптический биосенсор на основе портативного дихрометра СКД-2М с использованием ДНК-биодатчиков обладает в 10 раз лучшей по сравнению с коммерческими приборами чувствительностью и экспрессностью определения БАС и требует в 5 раз меньших эксплуатационных затрат. Области его применения - медицина, фармакология, экология, пищевая и биотехнологическая промышленность, научные исследования.
Гелевые биодатчики с иммобилизованными в них наноконструкциями ДНК имеют, в отличие от «пробирочной» формы ДНК-биодатчиков, седиментирующих в жидкости, свои характерные особенности. Их преимущества - сохраняющаяся на протяжении года и более аномальная оптическая активность и лучшие возможности для миниатюризации (создания биочипов). Наряду с этим для гелевых ДНК-биодатчиков характерны более плотная поверхность, большее время диффузии определяемых в жидкости БАС в гидрогель, большее рассеяние света, меньшая длина взаимодействия со световым лучом.
Указанные особенности учтены в разработанной версии портативного дихрометра СКД-3, в основе которой лежит оригинальная схема вертикального формирования светового потока и освещения пленочного образца на малой площадке. Такая схема допускает возможность миниатюризации узла загрузки гелевых ДНК-биодатчиков за счет использования стандартных микроплат, решая тем самым задачу проведения массовых анализов. Подобное решение реализовано и в модели Chirascan CD Spectrometer (Applied Photophysics Ltd), но она обладает упомянутыми выше недостатками приборов, не предназначенных для работы с ДНК-биодатчиками.
2. Портативный дихрометр СКД-3 с вертикальным ходом луча
Принцип действия дихрометра СКД-3, как и его предшественников [2], основан на измерении сигнала КД в анализируемом образце при пропускании через него поляризованного по кругу излучения с периодически изменяющимся во времени направлением вращения круговой поляризации. В соответствии с этим в состав полифункционального дихрометра входят: источник широкополосного светового излучения (ксеноновая лампа L2273 фирмы HAMAMATSU мощностью 150 ватт); монохроматор, выполненный по схеме Черни-Тернера с компенсацией комы Фасти, выделяющий световой поток с заданной длиной волны; призменный поляризатор излучения; фотоэластический модулятор круговой поляризации на основе склейки двух блоков из кристаллического и плавленого кварца; кювета для помещения исследуемого образца; фотоприемник (ФЭУ R1464 фирмы HAMAMATSU); управляющий миникомпьютер.
Проходя через исследуемый образец, обладающий свойством аномального кругового дихроизма, световой поток становится модулированным по интенсивности, благодаря чему на выходе ФЭУ возникает электрический сигнал, переменная составляющая которого ЛА на частоте модуляции поляризации пропорциональна величине сигнала КД. С выхода ФЭУ сигнал поступает на вход цифровой системы регистрации и после усиления, фильтрации и преобразования в цифровой код передается в компьютер. Микроконтроллер осуществляет необходимое взаимодействие всех узлов прибора, сбор и предварительную обработку сигнала КД, передачу данных в компьютер, а также тестирование параметров всех систем дихрометра. Компьютер управляет работой прибора с помощью программного пакета, предлагающего различные режимы работы и поддерживающего библиотеку методик для определения различных БАС, а также
выдающего результат в виде значения концентрации выбранного соединения в исследуемом образце (пробе).
Ниже приведены основные отличия дихрометра СКД-3 (рис.1) от предшествующих моделей СКД-2(М):
- Реализован оптимальный температурный режим осветителя практически без образования озона и с повышением выхода УФ-излучения вблизи 200 нм в 2 раза;
- В монохроматоре использован надежный и технологичный шаговый привод поворота дифракционной решетки (1800 штр/мм);
- Использована конструкция призмы-поляризатора и модулятора круговой поляризации, объединяющая их в один узел;
- Реализована стабилизация рабочего тока модулятора поляризации, обеспечившая более высокую стабильность характеристик модулятора;
- Предусмотрено автоматическое устройство двухкоординатного перемещения многолуночной микроплаты с образцами;
- Разработана конструкция узла ФЭУ, вертикально размещаемого на кронштейне (с возможностью его поворота) и применен управляемый блок питания ФЭУ;
- Уменьшены межмодульные связи, повышена надежность прибора;
- Управление прибором допускает возможность использования как внешнего, так и встроенного компьютера по интерфейсу USB.
- Для расширения рабочего диапазона в УФ область (до 190 нм) предусмотрена герметизация оптического блока и наполнение его газообразным азотом.
Испытания показали следующие характеристики дихрометра: Диапазон длин волн 230 (200) - 800 нм
Спектральное разрешение, не более 3 нм
Воспроизводимость длин волн ±2 нм
Время перестройки длины волны (на 30 нм), не более 2 с
Размер освещаемой области, мм 0,6х0,6
Точность перемещения образца в заданную позицию, не хуже 0,2 мм Минимальный детектируемый сигнал КД 5-10"6 ЛА/А
Габаритные размеры (мм) и масса (кг) 530х410х350 / 18
3. Определение БАС с помощью биосенсорного устройства
Алгоритм определения концентрации в анализируемой жидкости (растворе) БАС, образующих прочные комплексы с двухцепочечными молекулами ДНК, включает в себя: определение качества приготовленного ДНК-биодатчика; помещение образца биодатчика в лунку микроплаты или на прозрачную подложку; измерение его исходной оптической активности; обработка исследуемой жидкостью с последующей экспозицией, необходимой для осуществления диффузии БАС в гидрогель; измерение изменения оптической активности ДНК-биодатчика под действием БАС на характерной для проявления такого взаимодействия длине волны; определение концентрации БАС при помощи предварительно полученной калибровочной кривой.
Ниже приведены данные, зарегистрированные с помощью дихрометра СКД-3 и характеризующие разрушение под действием БАС наноконструкций ДНК с хелатными наномостиками, состоящими из чередующихся ионов Cu2+ и молекул дауномицина.
При тестировании прибора в качестве аналита, способного диффундировать в гидрогель и разрушать иммобилизованные в нем наноконструкции ДНК, был использован раствор, содержащий гомоцистеин - соединение, длительное присутствие которого в кровотоке приводит к развитию атеросклероза, тромбоваскулярной болезни, патологиям беременности и к ряду других
заболеваний. Обработка гомоцистеином ДНК-биодатчика (рис.2) сопровождается
постепенным исчезновением интенсивной отрицательной полосы в спектре КД в
области поглощения хромофоров дауномицина (^тах~500 нм). Это означает, что,
2+
проникнув в гидрогель, гомоцистеин "экстрагирует" ионы Си из состава наномостиков и разрушает наноконструкцию ДНК. Полученный результат ясно показывает, что иммобилизованные в гидрогеле частицы наноконструкции ДНК легко "отзываются" на присутствие гомоцистеина в растворе. Временная зависимость амплитуды полосы в спектрах КД гидрогеля, содержащего в своем составе наноконструкцию ДНК, характеризует динамику разрушения наномостиков под действием гомоцистеина. Аналогичные зависимости могут быть использованы для оценки "эффективного" коэффициента диффузии (рэфф.) БАС в гидрогель.
vi V,-V
f KM^H.-CW мн коон
v 4HKWH
400 JM И<1 550 « К. мы
050 ТОО 7»
Рис. 2. Спектры КД наноконструкций ДНК в составе гидрогеля, помещенного в раствор, Рис. 1. Общий вид образца портативного содержащий гомоцистеин, зарегистрированные
дихрометра СКД-3 с вертикальным ходом через 0 (кривая 1), 15, 25, 35, 45, 55, 65, 85 и 115
луча (кривая 9) мин.
Разработанный образец дихрометра СКД-3 и ДНК-биодатчики с методиками их использования расширяют возможности предложенной биосенсорной технологии и спектр оптических биосенсорных устройств для определения в жидкости биологически активных и токсичных соединений.
1. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов С.В., Скуридин С.Г.. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК, под ред. Ю.М.Евдокимова, М., Радиотехника, 2008.
2. О.Н.Компанец. Портативные оптические биосенсоры для определения биологически активных и токсичных соединений. Успехи физических наук, 2004, т.174, №6, с.686-690.
3. Скуридин С.Г., Дубинская В.А., Лагутина М.А., Компанец О.Н., Голубев В.Г., Ребров Л.Б., Быков В.А., Евдокимов Ю.М. Выявление генотоксикантов растительного происхождения при помощи биодатчиков пленочного типа. Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2006, №3, стр.38-43.
A PORTABLE BIOANALYTICAL SYSTEM BASED ON A DICHROMETER WITH A VERTICAL LIGHTENING GEL IMMOBILIZED DNA BIOSENSING UNITS
V. M. Gusev, S. F. Kolyakov, O. N. Kompanets, A. M. Pavlov, M. A. Pavlov, RAS Institute for Spectroscopy, 142190, Troitsk, Moscow Region, onkomp@isan.troitsk.ru; Yu.M.Yevdokimov, S.G.Skuridin, RAS V.A.Engelhardt Institute of Molecular Biology, 117984, Moscow
A laboratory prototype of a biosensor analytical system has been developed on the base of a portable polyfunctional CD spectrometer CDS-3 with a vertical lightening gel immobilized DNA biosensing units. The test experiments with the new portable bioanalytical system have been carried out that demonstrate destruction of DNA nanoconstructions in the hydrogel content under action of biologically active compounds, and analytical capabilities of the system.
