Наносенс и калибровка портативных биосенсорных аналитических устройств с использованием ДНК-биодатчиков Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2019, том 29, № 1, с. 76-81 РАБОТЫ С КОНФЕРЕНЦИИ -

УДК 681.7.08

© А. В. Хромов, А. В. Никулин, О. Н. Компанец, Д. П. Чулков, 2019

НАНОСЕНС И КАЛИБРОВКА ПОРТАТИВНЫХ БИОСЕНСОРНЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-БИОДАТЧИКОВ

Обсуждается возможность использования высокостабильного лекарственного противоракового препарата Наносенс в качестве дополнительного стандарта оптической активности для калибровки портативных биосенсорных аналитических устройств на основе ДНК-биодатчиков и дихрометра.

Кл. сл.: оптическая активность, круговой дихроизм, калибровка дихрометра, биосенсор на основе ДНК, биологически активные соединения

ВВЕДЕНИЕ

Спектрометры оптического кругового дихроизма (КД) — дихрометры — используются во многих лабораториях для изучения физико-химических свойств природных соединений и химических веществ, в том числе их оптической активности. В последнее время дихрометры стали широко применяться в портативных биосенсорных аналитических системах с использованием в качестве биодатчиков "жидких" частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) или наноконструкций (НаК) двухцепочечной ДНК, в которых молекулы ДНК пространственно упорядочены и "сшиты" между собой различными на-номостиками [1, 2]. Для биодатчиков на основе НаК ДНК характерна не только аномальная оптическая активность, проявляемая в виде интенсивной полосы в спектре КД на длине волны ~ 260270 нм, но и дополнительная аномальная оптическая активность в области поглощения элементов наномостиков (450-650 нм), "сшивающих" НаК ДНК, в частности хромофоров антибиотиков. Величина аномальной оптической активности таких биодатчиков в полосе поглощения антибиотика остается неизменной в течение длительного времени и может уменьшаться (вплоть до полного исчезновения) под действием биологически активных соединений (БАС), "мишенью" для которых служат структурные элементы наномостиков. Встраивание в структуру "жидких" частиц ХЖКД ДНК биологически активных соединений (например, противоопухолевых антибиотиков) также приводит к появлению в спектре кругового дихроизма дополнительной аномальной полосы в видимой области спектра, амплитуда которой исполь-

зуется для установления в анализируемой жидкой среде их наличия и концентрации.

Задачу исследования оптических свойств и контроля качества биодатчиков на основе ДНК, а также изменения этих свойств при взаимодействии с БАС можно решать с использованием портативных дихрометров, работающих как в широком диапазоне длин волн от 200 до 750 нм (излучатель — ксеноновая лампа), так и на дискретных длинах волн (источники — миниатюрные светоиз-лучающие диоды), одна из которых — 270 нм, а другие в полном соответствии с особенностями спектра КД ДНК-биодатчиков, — на длинах волн дополнительной аномальной полосы КД в видимой области спектра. Важным требованием при этом остается точность измерений дихрометром величины оптической активности исследуемого биодатчика в исходном состоянии и при его взаимодействии с БАС. Важно также, чтобы соединения, используемые в качестве эталонов оптической активности, были стабильными и могли воспроизводить эту характеристику в течение длительного периода. Для повышения точности калибровки желательно, чтобы характерные рабочие линии в спектре КД эталонных соединений находились в области длин волн, в которой используется дихрометр биосенсорной системы.

В качестве эталонных соединений для измерения регистрируемой дихрометром характеристики оптической активности чаще всего используют d-10-пропиламмниевую соль камфорсульфо-новой кислоты (КСК), водный раствор которой обладает КД положительного знака при Л = = 290.5 нм и отрицательного знака при Л = = 192.2 нм, и d-10-камфорсульфонат с практически теми же характеристиками, а также

Наносенс

и

о

200 0 -200 -400

нм

Рис. 1. Спектр кругового дихроизма (КД) Наносенса в УФ и видимой областях спектра

о<5 2-6-

ш 5

0 го

1 ¥

Г

О.

О

-его

I

го I

го®

о-е-5. ^зЕГ

—¿го го 51

о&х ^ о

■=;

г-г к го

%

"О" .3"

_■

о.

Е Ш

I_

X

го о

X

^

го X

л г 1

5, ь

о го 1

г> 1

о

-е- X . го X .

го

о 1

О X 1 0) 1

■П о 1

X 1

го 1

Г I 1

-е-

О.

о

с

-к

X

^

го X

5«! 25|

0Ф§

свд0

то? >.Уго «о. г:

ххх

дпп

го го го ХХХ

го

X

Е 3"

ГО

го

I-

о с; го

•А

ь

го т о

X

о о.

го о

X

го X

о а.

го о

X

го X

200

300

400

500

600

700

Длина волны, нм

Рис. 2. Положение аномальной полосы КД ХЖКД ДНК отрицательного знака, полос КД КСК и Наносенса (положительного знака) в области 300 нм и аномальных полос КД отрицательного знака (пунктирные линии) молекулярных и нано-конструкций (НаК) ДНК с разными интеркаля-торами, встраиваемыми в их структуру, в области 500 нм.

Видно, что спектр КД Наносенса хорошо "накладывается" на положение полос КД в обеих областях спектра

иодид трис(этилендиамин)кобальта(Ш) моногидрата, водный раствор которого генерирует полосу КД с максимумом при 490 нм [3].

Для тестирования и калибровки оптической ак-

тивности биодатчиков на основе ДНК предлагалось использовать также полимерные материалы на основе вышеупомянутых наноконструкций ДНК, включенных в состав полимерного гидроге-

0102020200000200010201020002010002010002010202020200010000020102010202000202000001020002000002020102910002010102020200

ля [4]. Существенным недостатком, препятствующим использованию таких материалов для калибровки дихрометров, остается сложность их изготовления: по этой причине они могут быть доступны пока только узким специалистам, профессионально работающим с НаК ДНК и полимерными гелями.

В настоящей работе предлагается рассмотреть в качестве вторичного стандарта оптической активности в области длин волн, на которых работают дихрометры биосенсорных устройств, разработанный в НИОПИК препарат Наносенс, имеющий характерные рабочие линии в спектре КД одновременно как в ультрафиолетовой, так и в видимой областях спектра (рис. 1), которые стабильны и могут воспроизводить характеристику оптической активности в течение длительного периода (более трех лет).

НАНОСЕНС И ЕГО ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Наносенс представляет собой стабильную на-нодисперсию фталоцианина цинка (средний размер частиц 100-150 нм) — органического красителя (пигмента), практически нерастворимого в воде и органических растворителях, в виде жидкости ярко-синего цвета с содержанием фталоциа-нина цинка 0.1-0.2 %, поверхностно-активной добавки (Проксанол 268) 0.1-10.0 %, хлорида натрия 0.1-1.5 % и воды (остальное). Химическое название препарата — тетрабензо-5,10,15,20-тетрааза-порфирин цинка. Хранится он в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °С или в замороженном виде при температуре не выше -8 °С. Основное назначение препарата — лечение злокачественных новообразований методом импульсной лазерной абляции наночастиц [5]. После лазерного облучения некоторая часть фталоциа-нина цинка, находящегося в опухоли в виде нано-частиц и подвергшаяся воздействию лазерного импульса, прямо на месте воздействия излучения испаряется и переходит в молекулярную форму, превращаясь в один из самых эффективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии. При дополнительном облучении опухоли непрерывным лазером фотосенсибилизатор генерирует синглетный кислород и перекись водорода, которые поражают клетки опухоли повторно — тем самым реализуется двойное избирательное воздействие на опухоль при однократном введении препарата.

Спектр кругового дихроизма Наносенса (с исходной концентрацией 2 мг/мл) в области 190750 нм приведен на рис. 1. Он имеет два выраженных пика: положительный на длине волны 295 нм и отрицательный на длине волны 550 нм. Для сравнения на рис. 2 показаны положения аномаль-

ных полос КД комплексов ДНК с интеркалятора-ми (раздельно) дауномицином, порфином, миток-сантроном, сангвиритрином, PicoGreen, SYBR Green, оптическую активность которых и связанную с нею концентрацию требуется контролировать.

НАНОСЕНС КАК ВТОРИЧНЫЙ СТАНДАРТ ОПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Предпосылки

Решение поставленной задачи состоит в определении и контроле характеристик оптической активности Наносенса при помощи первичного эталона (водный раствор КСК) и поверки характеристик КД дихрометров биосенсорных устройств на основе ДНК при их работе в УФ и видимом диапазонах длин волн по аттестованным характеристикам оптической активности Наносенса. В данной работе все измерения выполнялись на спектрометре кругового дихроизма (дихромет-ре) СКД-2МУФ, входящем в состав биосенсорной аналитической системы, в которой в качестве биодатчика используются "жидкие" частицы ХЖКД комплексов ДНК с интеркаляторами.

Решению задачи, как следует из сказанного выше, способствуют:

• наличие аномальной положительной полосы в спектре КД Наносенса на длине волны 295 нм;

• стабильность амплитуды и положения этой полосы при установленной концентрации раствора препарата;

• близость указанной полосы Наносенса в УФ-области к полосе КД положительного знака на 290.5 нм первичного эталона — водного раствора КСК;

• наличие дополнительной оптической активности Наносенса, проявляемой в виде отрицательной полосы в спектре его КД на длине волны 550 нм, располагаемой в области аномальных полос КД "жидких" частиц ХЖКД комплексов ДНК с интеркаляторами;

• наличие для Наносенса при соблюдении фиксированных условий его разбавления определенного соотношения между амплитудой интенсивной положительной полосы в спектре КД в УФ-области (295 нм) и амплитудой отрицательной полосы в видимом диапазоне (550 нм);

• долговременная стабильность оптических характеристик Наносенса.

Калибровка дихрометров по величине оптической активности Наносенса реализуется в три этапа.

Этап 1 калибровки

На этапе 1 определяется величина оптической активности на длине волны 295 нм (ААНС, 295) стандартного раствора Наносенса (2 мг/мл), содержащего распределенные по объему наночастицы фталоцианина. Для ее определения используются близость полос КД и наблюдаемое при измерениях соотношение ^ между величинами (амплитудами) регистрируемых дихрометром положительного сигнала КД раствора эталона (КСК) на длине волны 290.5 нм (кдА4290), соответствующего [3] известной величине эталонной оптической активности раствора КСК (ААэталон), и положительного сигнала КД раствора Наносенса с максимумом кдАЛ295 на длине волны 295 нм.

Спектрометр КД измеряет отношение переменной составляющей сигнала на частоте модуляции круговой поляризации излучения (с длиной волны А), пропорциональной величине кругового дихроизма ДАа (ДАа = - Аь)а — разность поглощения Аа в веществе света с правой и левой круговыми поляризациями), к постоянной составляющей регистрируемого сигнала, пропорциональной средней величине светового потока 1А. При этом переменная составляющая величины измеряемого на выходе фотоприемника сигнала КД АиА = А1а х х SА х Та, а постоянная (не модулированная) составляющая и0 = 1А х SА — чувствительность фотоприемника, ТА — величина усиления электронного тракта спектрометра КД), из чего следует АиА = (а1а / 1А) х и0 х Т. В этих условиях регистрируемые при измерениях сигналы КД растворов КСК и Наносенса можно записать в виде:

КДАА290 = ААКСК, 290 Х и0 (1290 Х ^90) Х Т290

и

КДАА295 = ААНС, 295 Х и0 (1295 Х <$295) Х Т295.

С учетом одинакового значения усиления электронного тракта Т для двух близких длин волн (290.5 и 295 нм) находим из приведенных выше выражений искомое значение ААНС, 295 КД раствора Наносенса (толщиной L) на основе наночастиц фталоцианина цинка на длине волны 295 нм:

ААНС, 295 Ь (А - АИ)КСК, 290 = ^ А^КСК, 290СКСК, МL.

Здесь круговой дихроизм водного раствора КСК АеКСК, 290 = 2.37 М_1см_1 и является эталонной величиной для КСК на длине волны 290.5 нм, концентрация СКСК, М выражена в М/л и длина оптического пути L — в см [3].

Для калибровки используются водные растворы КСК, имеющие концентрацию 3, 15, 150 мкг/мл, с оптической плотностью соответственно 31 х 10-6, 154 х 10-6 и 1544 х 10-6 оптических единиц (о.е.) и растворы Наносенса с такой же концентрацией. Исходя из измеренной величи-

ны сигнала КД раствора Наносенса на длине волны 295 нм, находим, что оптической плотности раствора Наносенса ААНС, 295 = 150 * 10"6 о.е. соответствует концентрация КСК в растворе СКСК = = 6.5 * 10-5 М/л (при длине оптического пути в кювете L = 1 см). Это означает, что при помощи спектрометра КД, откалиброванного согласно описанной выше процедуре измерений и ставшего в результате этого рабочим средством измерения КД, можно проводить тестирование и определение величины сигнала КД любого другого оптически активного соединения или материала при облучении его циркулярно-поляризованным светом вблизи 295 нм, исходя из соотношения регистрируемых спектрометром КД сигналов КД этого соединения (материала) и дополнительного стандарта — раствора Наносенса (КДАЛ295).

Этап 2 калибровки

На этапе 2 определяется величина ААНС, 537 кругового дихроизма раствора Наносенса в видимой области. При определении этой величины используем, во-первых, определенную на этапе 1 величину оптической активности на длине волны 295 нм (ААнс, 295) раствора Наносенса и, во-вторых, измеренное соотношение k2 максимума сигнала КД Наносенса на длине волны 295 нм (КДАЛ295) и наблюдаемого минимума его сигнала КД в видимой области на длине волны 550 нм:

ААНС, 550 _ k2 * ААНС, 295 * Т295 / T550

(здесь Т295 и T550 — измеряемые характеристики усиления Тх электронного тракта дихрометра в фиксированной полосе частот на указанных выше длинах волн).

Этап 3 калибровки

На этапе 3 полученные на дихрометре характеристики КД дополнительного стандарта на основе раствора Наносенса на длине волны 550 нм используются непосредственно для калибровки в видимой области оптической активности образцов, имеющих в своем составе "жидкие" частицы ХЖКД комплексов "ДНК + интеркалятор" (рис. 2). Задача определения величины (кдАЛдНК+бас, вид) решается аналогично решенной на этапе 1, т. е. путем непосредственного измерения соотношения k сигналов КД ААНС, 550 и сигналов КД в видимой области спектра образцов, содержащих тот или иной (i-й) комплекс "ДНК + интеркалятор", например, "ДНК-SYBR Green", при этом используется близость их полос КД (Т550 ~ T500). Аналогичным образом могут быть получены результаты измерения КД других образцов, содержащих комплексы "ДНК-PicoGreen", "ДНК-сангвиритрин", "ДНК-дауномицин", "ДНК-митоксантрон".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведение описанных выше измерительных процедур означает, что при помощи дихрометра, откалиброванного таким образом и ставшего рабочим средством измерения КД на длине волны 295 и 550 нм, можно проводить определение оптической активности любого другого обладающего этим свойством соединения при облучении его циркулярно поляризованным светом, исходя из соотношения регистрируемых дихрометром сигналов КД от этого соединения (материала) и от вторичного стандарта на основе раствора Наносенса.

Рассмотренный способ калибровки спектрометров кругового дихроизма (поверки измерительной системы спектрометра КД), входящих в состав биосенсорных систем на основе ДНК-биодатчиков, с применением в качестве дополнительного стандарта оптической активности (кругового дихроизма) растворов препарата Наносенс, содержащих наночастицы фталоцианина цинка, может найти применение в спектральном приборостроении и аналитической биохимии, в том числе клинической биохимии.

struments // Analitical Chemistry. 1981. Vol. 53, no. 6. P. 778-782. DOI: 10.1021/ac00229a008 Гусев В.М., Компанец О.Н., Павлов М.А., Чулков Д.П., Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г. Наноконструкции ДНК для тестирования и калибровки спектрометров кругового дихроизма // Наукоемкие технологии. 2013. № 4. C. 68-76.

Хромов А.В., Коган Б.Я., Фейзулова Р.К.-Г., Панкратов А.А., Якубовская Р.И. Доклинические исследования лекарственного препарата Наносенс // Biomedical Photonics. 2015. № S1. С. 12-13.

Центр фармсинтеза и биотехнологии ЦКП (НОЦ), РУДН, Москва (Хромов А.В.)

ЦКП (НОЦ), РУДН, Москва (Никулин А.В.)

Институт спектроскопии РАН, Москва

(Компанец О.Н.)

ФГУП "Ремонтно-монтажное производство медицинской техники "Медтехника" УДПРФ, Москва

(Чулков Д.П.)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов С.В., Скуридин С.Г. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова. М.: Радиотехника, 2008. 294 с.

2. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Скуридин С.Г. Наноструктуры и наноконструкции на основе ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова. М.: САЙНС-ПРЕСС, 2010. 254 с.

3. Schippers P.H., Dekkers H.P.J.M. Direct determination of absolute CD data and calibration of commercial in-

Контакты: Компанец Олег Николаевич, [email protected]

Материал поступил в редакцию 28.06.2018

ISSN 0868-5886

NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2019, Vol. 29, No. 1, pp. 76-81

NANOSENS AND CALIBRATION OF PORTABLE BIOSENSOR ANALYTICAL DEVICES WITH USING DNA BIOSENSING UNITS

^ V. Nikulin1, A. V. Khromov1, O. N. Kompanets2, D. P. Chulkov3

1RUDN University, Moscow, Russia

2Institute of Spectroscopy of the Russian Academy of Sciences, Troitsk, Moscow, Russia 3Medtekhnika of the RFPresident' Administration Moscow, Russia

The possibility of using the highly stable anti-cancer drug Nanosens as an additional standard of optical activity for calibration of portable biosensor analytical devices based on DNA biosensing units and a dichrometer is discussed.

Keywords: optical activity, circular dichroism, dichrometer calibration, DNA based biosensor, biologically active substances

REFERENСES

1. Evdokimov Yu.M. (ed.), Salyanov V.I., Semenov S.V., Skuridin S.G. Zhidkokristallicheskie dispersii i nanokon-strukcii DNK [Liquid crystal dispersions and nanodesigns of DNA]. Moscow, Radiotekhnika Publ., 2008. 294 p. (In Russ.).

2. Evdokimov Yu.M. (ed.), Salyanov V.I., Skuridin S.G. Nanostruktury i nanokonstrukcii na osnove DNK [Nano-structures and nanodesigns on the basis of DNA]. Moscow, SAYNS-PRESS, 2010. 254 p. (In Russ.).

3. Schippers P.H., Dekkers H.P.J.M. Direct determination

of absolute CD data and calibration of commercial instruments. Analitical Chemistry, 1981, vol. 53, no. 6, pp. 778-782. DOI: 10.1021/ac00229a008

4. Gusev V.M., Kompanets O.N., Pavlov M.A., Chulkov D.P., Evdokimov Yu.M., Skuridin S.G. [DNA nanoconstruc-tions for testing and calibration of CD spectrometers]. Naukoemkie tekhnologii [Science Intensive Technologies], 2013, no. 4, pp. 68-76. (In Russ.).

5. Hromov A.V., Kogan B.Ya., Fejzulova R.K.-G., Pankra-tov A.A., Yakubovskaya R.I. [Preclinical researches of the medicinal medicine Nanopsychic]. Biomedical Photonics, 2015, no. S1, pp. 12-13. (In Russ.).

Contacts: Kompanets Oleg Nikolaevitch,

[email protected] Article received in edition 28.°6.2018