CC BY
65
^М^етНЫЙ БИОСЕНСОР БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ ГЕЛЕВОГО ДНК-БИОДАТЧИКА И ОДНОВОЛНОВОГО ДИХРОМЕТРА
В.М.Гусев, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Ю.М.Евдокимов*, С.Г.Скуридин*, Институт спектроскопии РАН, Троицк Московской обл., onkomp@isan.troitsk.ru;
*Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН, Москва
Разработан и испытан лабораторный макет компактного оптического биосенсора на основе иммобилизованных в гидрогель наноконструкций ДНК (биодатчик) и компактного одноволнового дихрометра. Простая, мобильная и недорогая биосенсорная система может стать базовой для определения биологически активных соединений в жидкости при решении практических задач медицины, фармакологии, экологии, контроля технологических процессов и качества продукции пищевой и биотехнологической промышленности.
Практика проведения массовых биохимических анализов, децентрализованных измерений, «персонифицированной» медицины, «онлайнового» технологического контроля потребовала развития методов биосенсорного анализа и создания новых, стабилизированных форм биодатчиков и миниатюризации измерительных устройств.
Примером успешного решения задачи определения в жидкостях биологически активных соединений (БАС), основной мишенью которых являются молекулы двухцепочечные молекулы (дц) нуклеиновых кислот, является предложенный в ИМБ РАН метод с использованием биодатчиков на основе частиц холестерической жидко-кристаллической дисперсии (ХЖКД) дцДНК и преобразователя на основе портативного дихрометра, регистрирующего изменения присущей ДНК-биодатчику аномальной оптической активности при взаимодействии с БАС [1]. Оптические биосенсоры на основе портативных дихрометров СКД-2 и СКД-2М с использованием таких ДНК-биодатчиков обладают значительно меньшими по сравнению с коммерческими приборами габаритами и весом, не уступающей им детектирующей способностью, в несколько раз лучшей экспрессностью определения БАС и требует в 3-5 раз меньших эксплуатационных затрат [2].
Проблема осмотического давления содержащего частицы ХЖКД дцДНК раствора и постепенной седиментации этих частиц решена недавно [1] путем создания наноконструкций (НаК) ДНК из исходных частиц ХЖКД за счет введения межмолекулярных сшивок - «наномостиков», обеспечивающих формирование жесткой упорядоченной структуры НаК ДНК, и стабилизации их свойств за счет иммобилизации в составе прозрачного, химически нейтрального по отношению к ним и проницаемого для низкомолекулярных веществ полиэтиленоксидного гидрогеля. Важно отметить, что (1) образование НаК ДНК сопровождается амплификацией аномальной оптической активности в полосе поглощения ДНК с ^т^~270 нм и появлением новой оптической активности в полосе поглощения (с ^т^~500 нм) вводимых в НаК компонентов наномостиков (чередующихся ионов
и молекул дауномицина); (2) полученные таким способом гелевые ДНК-биодатчики сохраняют свою высокую оптическую активность в течение весьма длительного времени, по крайней мере, не менее года.
Эти два обстоятельства открыли перспективу разработки новых, значительно более компактных биосенсорных устройств для детекции БАС в жидкости, основанных на регистрации изменений оптической активности ДНК-биодатчиков под действием БАС только в одном диапазоне длин волн (^^~500 нм), в котором в наибольшей степени проявляется влияние БАС на целостность и конформационные свойства наноконструкций ДНК. В этом случае основные узлы дихрометра -широкополосный (в том числе УФ) ламповый источник излучения с высоковольтным источником питания и монохроматор с устройством перестройки длины волны заменяются миниатюрным одноволновым диодным излучателем.
Конструкция дихрометра становится очень компактной с размерами, в несколько раз уменьшенными по сравнению с разработанными моделями широкодиапазонных (полифункциональных) дихрометров, без какой-либо потери чувствительности регистрации сигнала КД.
Исследуемой пробой служит исходный гелевый ДНК-биодатчик, а также тот же ДНК-биодатчик, обработанный анализируемой биологической жидкостью, содержащей в малой концентрации определяемое БАС. Дихрометр регистрирует изменение оптической активности ДНК-биодатчика, реагирующего на присутствие диффундирующего в гидрогель БАС, которое тем или иным способом нарушает целостность НаК ДНК, после чего концентрация БАС определяется по величине изменения оптической активности с помощью калибровочной кривой.
Мы сообщаем здесь о разработке и испытании простейшего биосенсорного устройства на основе иммобилизованных в гидрогель/пленку НаК дцДНК (биодатчик) и компактного одноволнового дихрометра (условно СКД-4). Макет одноволнового дихрометра содержал установленные последовательно миниатюрный и дешевый светодиод, излучающий в полосе поглощения хромофоров ДАУ мостиковой структуры ДНК-биодатчика (Àmax~500 нм); поляризатор пленочного типа, модулятор направления линейной поляризации и четвертьволновую пластинку из кристаллического кварца, вместе формирующие поляризованное по кругу излучение с периодически изменяющимся во времени направлением вращения вектора поляризации; ячейку для размещения исследуемой пробы и фотодетектор.
Тестовые эксперименты проводились с раствором гипорамина -противовирусного и противомикробного препарата, концентрация которого менялась в интервале от 0 до 4 мкг/мл. Добавление гипорамина сопровождалось исчезновением интенсивной отрицательной полосы в спектре КД. Поскольку биологически активными компонентами гипорамина являются гидролизуемые таннины, склонные к формированию комплексов с ионами двухвалентных металлов, разрушение наномостиков в данном случае обусловлено "экстракцией" ионов Cu2+ из состава наномостика и формированием в результате вторичного комплексообразования более устойчивого комплекса между гипорамином и ионами Cu2+.
Минимальная зарегистрированная концентрация гипорамина составила величину ~ 0,5 мкг/мл, сравнимую с чувствительностью определения этого же аналита при помощи классических (био)химических методов.
Разработка макета компактного дихрометра и ДНК-биодатчики с методиками их использования расширяют возможности предложенной биосенсорной технологии и спектр оптических биосенсорных устройств для определения в жидкости биологически активных и токсичных соединений.
1. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов С.В., Скуридин С.Г.. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК, под ред. Ю.М.Евдокимова, М., Радиотехника, 2008.
2. О.Н.Компанец. Портативные оптические биосенсоры для определения биологически активных и токсичных соединений. Успехи физических наук, 2004, т.174, №6, с.686-690.
