CC BY
70
УДК 31.27.21
Л.С.Кожамжарова, А.С.Кожамжарова, * З.Б.Есимсеиитова**
Таразский Государственный университет имени М.Х.Дулати *Казахский Национальный медицинский университет имени СД.Асфендиярова **Казахский Национальный университет имени аль-Фараби
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ЭФЕДРЫ ХВОЩЕВОЙ
Изучены популяции эфедры хвощевой Е. вдш8випа. на юго-востоке Казахстана. Показаны различия между популяциями по продуктивности, накоплению алкалоидов эфедрина и псевдоэфедрина, компонентному составу пероксидазы, неспецифичной эстеразы и кислой фосфатазы. Обнаружены различие между популяциями в структуре ДНК. Применение нуклеотидных и изоферментных маркеров позволило предположить, что исследованные популяции различаются друг от друга генетически. Ключевые слова: Е. вдш8випа, эфедра, биологически активные добавки, эфедрин, алкалоид, тонкослойная хроматография, силуфоловые пластинки.
Растения из рода Эфедра привлекают внимание исследователей в связи с высоким содержанием таких биологически активных веществ, как алкалоиды. Эфедрин широко применяется в медицине при гипотонии, послеоперационных шоках, бронхиальной астме, коклюше, сенной лихорадке, крапивнице и других заболеваниях. Эфедра, по сей день является наиболее заготовляемой из всех лекарственных растений.
Запасы эфедры Казахстана достаточно богаты и в лекарственном ресурсоведении это самостоятельное научное направление. Кроме того заросли E. equisetina укрепляют горные склоны, каменистые и щебнистые осыпи, т.е. также эфедра имеет и большое экологическое значение. В связи с этим вопросы рационального использования и сохранности популяций эфедры имеют первостепенное значение [1].
Эфедра относится к подотделу гнетовых голосеменных растений, семейству Ephedraceae, порядку Ephedrales, и роду Ephedra. Это обычно или невысокие, сильно ветвистые кустарники или небольшие деревья высотой до 6 м. Побеги прутьевидные, членистые; листья обычно редуцированные (функция фотосинтеза переходит к молодым ветвям), мелкие, супротивные. Большинство видов накапливает алкалоиды. Эфедрин, используемый в медицине, накапливается только у нескольких видов. В Казахстане произрастает 9 видов эфедры, из которых практическое применение имеют эфедра хвощевая (каз «;ылша»)- Ephedra equisetina Bunge и эфедра средняя Ephedra intermedia, т.к. только в них накапливается большое количество эфедрина.
В последние годы интерес к натуральному сырью из эфедры сильно возрос в связи с тем, что высушенные и растолчённые веточки эфедры являются основным компонентом биологически активны добавкок для похудения. БАДы на основе эфедрина изготавливаются в Китае и других странах юго-восточной Азии и продаются в США и Европе. В другой композиции, в виде чая, эфедра используется для повышения работоспособности и тонуса человека. Этот чай особо популярен в США среди выходцев из Азии. После его употребления человек способен активно работать около 20 часов в сутки [2]. Рынок эфедры огромен. Постоянно приходят заявки в Казахстан на приобретение значительного количества травы. В последние 10 лет не производится заготовка эфедры. Мы не знаем современных запасов эфедры в Казахстане, а самое главное, мы не знаем качества сырья в различных популяциях этого растения. Исходя из этого, основной целью наших исследований являлось изучение популяционного полиморфизма и биохимических особенностей эфедры хвощевой в местах массового её произрастания.
Объекты и методы исследования. Объектом нашего исследования являлась эфедра хвощевая (горная, Е.equisentina Bge.), которую собирали в Алматинской (в Саркандском и Алакольском районах), Жамбылской (Кордайском и Меркенском районах) областях на каменистых склонах гор. Эфедра хвощевая - кустарник до 1,5 м высоты, с серым стволом до 4 см в диаметре. Как исключение встречаются древовидные экземпляры до 2,5 м высот, со стволом до 20 см толщины. Веточки прямые, гладкие, тонкобороздчатые, 1-2 мм в диаметре, с междоузлиями 1,5 - 3 см длины. Листья имеют вид
небольших пленок и располагаются супротивно по два, причем внизу на треть и более срастаются. Растение двудомное: на одних кустах развиваются лишь мужские генеративные органы, на других - женские. Мужские колоски одиночные или скучены по 2-3, на ножках 1-2 мм длины, 2-4-цветковые, 4-5 мм длины, почти шаровидные. Наружные прицветники округлоовальные, притупленные, в основании на треть спайные, тонкие, с узкой окраиной; внутренние- округлые, более длинные. Тычинка едва выставляется, пыльники в числе 6-8, почти сидячие. Женские колоски на прямых или вниз отогнутых ножках, длиной от 1до 12 мм, одноцветковые, с выставляющейся прямой или слегка изогнутой, цельной или лопастной трубочкой. Прицветников 2-3 пары, нижние, широкоовальные, по краю узкоперепончатые, внизу на одну треть спайные; внутренние - спайные на две трети или почти до половины. Зрелые шишкоягоды удлиненные, 67мм длины, красные или оранжевые, мясистые, односемянные. Семена округлые, каштановые, с обеих сторон выпуклые, слегка выступают из шишки, 4-6 мм длины; абсолютный вес семян (1000 штук) - 7-9 г [1,3]. Сбор эфедры производили в июле-августе.
Морфологические различия отдельных особей весьма значительны. Варьируют размеры кустов, толщина ветвей, длина члеников и другие показатели. Цвет ветвей в основном ярко зеленый, но иногда встречаются сизоватые и редко, совершенно сизые ветви. Причина вызывающая сизую окраску, не ясна. Эфедра хвощевая имеет мощную, хорошо развитую корневую систему, благодаря чему может селиться на участках с маломощными почвами, на каменистых и щебнистых осыпях, в расщелинах скал и на других субстратах, мало подходящих для жизни более требовательных растений. Она обычно размножается вегетативно, образуя парциальные кусты [4]. Определение содержания алкалоида. Для количественного определения алкалоидов использовали не общепринятый титрометрический метод, а вариант метода Р.В. Лыковой (1985), усовершенствованный М.Ж. Журиновым и др. (1990 г.) с применением тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках. Для очистки алкалоидов от примесей их переводили в соответствующие соли и далее в основания. Десорбции алкалоидов с хроматограмм производилась цитратно-фосфатным буфером с рН 8,0. Для проявления алкалоидов применялась качественная реакция с периодатом калия, в результате которой образуется бензальдегид. Концентрация последнего легко определяется спектрофотометрически.
Разделение ферментов. Компонентный состав ферментов определяли с помощю метода изофокусирования в пластинчатом ПААГе [Wrigley, 1968] использовали амфолины с широким рН 3,5-9. Размер пластинки 160х160, ширина трека 4 мм. На каждый трек наносили по 15-20 мкл вытяжки в зависимости от активности. Сила токо 20 мА на пластинку, продолжительность изофокусировали 3 ч. Фермент экстрагировали из хвои 0,05 М ацетатным буфером, рН 5,2. Компоненты пероксидазы в чем проявляли 0,2 мМ бензидином в 0,2 ацетатном буфере, рН 5,2. При этой рН активность пероксидазы максимальна. [6]. Неспецифичной эстеразу проявили в геле - по методу Яаска [7]. Гели инкубировали 30 мин при комнатной температуре в 0,2 М малеинатном буфере с рН 6,0-6,5 для снижения рН
геля, затем окрашивали в смеси, содержащей 2,002 М свежий гексаазотированный основной фуксин и 0,5 мг/мл а-нафтилацетата в 0,1 М малеинатном буфере с конечным рН 6,0-6,5.
Кислую фосфатазу определяли с методом Яаска [8]. Гели инкубировали 30 мин в 0,2 М малеинатном буфере рН 5,2 для снижения рН геля. Затем переносили гель в реакционную смесь, содержащую 0,25 мг/мл 1-нафтилфосфата и 0,001 М гексоазотированного основного фуксина в 0,1 М малеинатном буфере рН 5,0. Выделение ДНК из хвои эфедры. 100 мг сухого растительного материала растирали в ступке вместе с 20 мг окиси алюминия, затем полученный гомогенат переносили в пробирки типа Эппендорф и экстрагировали 700 мкл СТАВ-буфером, содержащим 50мМ трис-HCl, pH 8,0; 0,7 М NaCl; 10 мМ ЭДТА; 1%-ный (по весу) цетилтриметил аммониум бромид (СТАВ) и 20 мМ 2-меркаптоэтанол. Гомогенаты экстрагировали 15 мин при 65°С, периодически перемешивая содержимое пробирки. После 15 минут экстракции пробирки охлаждали при комнатной температуре и добавляли в них равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), осторожно перемешивали и центрифугировали при 8000g при комнатной температуре.
Водные фазы переносили в чистую пробирку и к оставшемуся осадку добавляли 200 мкл буфера для гомогенизации и проводили реэкстрацию. Полученные водные фазы объединяли, добавляли 0.1 объема 10% СТАВ, тщательно перемешивали и депротенизировали смесью хлороформ:изоамиловый спирт. После центрифугирования супернатант отбирали в чистую пробирку типа эппендорф. Для осаждения ДНК к полученной водной фазе добавляли равный объем буфера, содержащего 50мМ трис-HCl pH 8,0; 10 мМ ЭДТА; 1% (по весу) СТАВ. После двухчасовой инкубации осадок, состоящий из комплекса нуклеиновые кислоты: СТАВ осаждали в бакет- роторе при 1500g в течение 10 - 15 мин при комнатной температуре. Полученный осадок подсушивали и растворяли в 1мл 1М NaCl. После полного растворения осадку добавляли равный объем холодного изопропанола. Для получения ДНК через 60 мин пробирки центрифугировали, и полученный осадок ДНК промывали 70% этанолом охлажденным до -20С0 для удаления следов детергента. Осадок подсушивали и растворяли в стерильной, деионизированной воде. Чистоту полученных препаратов ДНК проверяли
электрофоретическим разделением в агарозном геле [15]. Проведение ПЦР реакций использовали двадцать 10-членных случайных праймеров, наиболее подходящими из них являлись следующие: Pr-3 - CCGAATTCGC; Pr-12 -CCGGCACGCA; Pr-15 - GCCTCGCCCA; Pr-23 - GGTGCCGTAC. Реакционная смесь для ПЦР объемом 20 мкм содержала 2.5 ед. Таg-полимеразы (Бион, Россия), 10мМ трис-HCL pH 8.3; 50мМ KCL; 0.01% Tween 20; по 100 млМ dATP, dGTP, dCTP и dTTP ("Pharmacia", Щвеция); 1мкМ праймера; 4мМ MgCl и до 25 ng ДНК.
Амплификацию проводили в программируемом термостате в следующих условиях: 2 цикла: денатурация - 95°, 3мин; отжиг-30°, 1мин; синтез-72°, 1 мин и 35 циклов при значениях соответствующих процессов 94°, 1мин; 37°, 1мин и 72°. Электрофорез проводили в 8%- ном
полиакриламидном геле и анализировали с помощью прибора Gel-Doc фирмы Bio-Rad в проходящем
ультрафиолетовом свете при длине волны от 260 до 360 нм. Генетические дистанции RAPD - спектров для популяций были рассчитаны программным пакетом
Quantity One-4.1.1 (GelDoc, BioRad) и построены генеалогические дендрограммы с помощью невзвешанного парногруппового метода с арифметическим усреднением -UPGMA.[9,15].
Результаты исследования. Морфологические особенности и накопление алкалоидов. Сравнительный анализ накопления алкалоидов в шести образцах хвоии эфедры показал наличие во все образцах алкалоидов эфедрина и псевдоэфедрина. Визуальная оценка тонкослойных хр омото грамм по казала, что эфедрин преобладал в образцах из: а) из ущелья Теректы и б) 61 км от ущелья Теректы, а псевдоэфедрин, который содержался в значительно меньших количествах, преобладал в образцах из ущелья Теректы (вглубь 2 км) и горы Кзыл-тал (у речки). Отмечено, но в очень малых количествах (следы), наличие других алкалоидов с Rf=0,8 и Rf=0,55. По этим алкалоидам выявлены различия между образцами. Например, по алкалоиду с Rf=0,8 между образцами взятыми из точки расположенной в 61 км от ущелья Теректы и горы Кзыл-тал, (у речки). Концентрация этого неидентифицированного алкалоида у них была немного меньше псевдоэфедрина, но выше, чем у других образцов. Различия имеются и по алкалоиду с Rf=0,55. У образца из ущелья Теректы концентрация его была значительнее, чем у других растений. Кроме того, в образце из точки взятой в 61 км от ущелья Теректы отмечено присутствие в ощутимых количествах еще одного не идентифицированного алкалоида с Rf=0,65. У других образцов данный алкалоид отсутствовал.
Спектрофотометрически было показано, что содержание эфедрина у образцов колеблется от 2,16 до 4,6%. Максимальное его количество содержится в образце из ущелья Теректы (4,6%) и горах Кзыл-тал (3,6%). Минимальное - в образце, взятого у горы Кзыл-тал, возле сухого русла реки (2,16%).
Таким образом, образцы эфедры хвощевой содержат группу эфедриновых алкалоидов, в которую входят эфедрин, псевдоэфедрин и другие не идентифицированные алкалоиды. Концентрация их довольно значительная. В среднем около 3%, что свидетельствует о пригодности данных зарослей эфедры для промышленной заготовки. Кроме качественного и количественного определения алкалоидов мы также замеряли морфометрические показатели у растений из различных популяций. В качестве показателей были взяты высота растения, количество побегов, толщина стебля, длина хвои, вес надземной части. Было обнаружено, что наиболее развитыми являются растений из горного массива Кзыл-тал. Их высота составляла 107 см, число побегов - 5, толщина стебля у основания побега - 2,8 см, длина хвои - 24,5 см, вес надземной части куста - 2,4 кг. В массиве эфедры, расположенной в предгорьях близ аула Билжан, ростовые процессы менее активны - высота составляла - 48 см, число побегов - 9, толщина стебля у основания побегов - 0,8 см, длина хвои - 23,5 см, вес надземной части - 0,3 кг. Отсюда следует, что эфедра хвощевая в условиях высокогорья произрастает лучше и превышает по морфометрическим показателям растения, произрастающие в низине. У растений, произрастающих на Кордайском перевале морфометрические показатели ниже, чем у образцов из Джунгарского Алатау. (рис. 1, 2) Анализ накопления эфедрина показал, что его содержание у них не превышает 0,9%.
Таблица 1 - Морфометрические показатели эфедры хвощевой
№ участ. Место произрастания Высота растения (см) Число побегов (см) Толщина стебля у основа-ния (см) Длина листьев (хвои, в см) Вес надземной части (кг)
1 Аул Билжан, (Саркандский р-н) 48± 3,9 9,0± 0,2 0,8± 0,2 23,5± 0,4 0,3±0,1
2 Горы Кызыл-Тал (Саркандский р-н) 107± 2,3 15± 1,3 2,8± 0,6 24,5±0,2 2,4± 0,3
3 Ущелье Теректы 67± 3,1 13± 0,2 2,4± 1,2 11,2± 0,1 0,5± 0,1
(Саркандский р-н)
4 Ущелье Теректы вглубь, 2 км (Саркандский р-н) 80± 1,9 17± 1,8 3,0± 0,9 18,5± 0,1 1,0± 0,2
5 Сухая речка 61 км от ущелья Теректы (Саркандский р-н) 57± 31 10±0,9 1,1± 0,4 18,5± 0,2 0,5± 0,1
6 Горы Кзыл-Тал у речки (Саркандский р-н) 51± 2,9 10± 1,9 1,0± 0,3 21,7± 0,7 0,4± 0,2
7 Курдайский перевал (Джамбульская область) 57 ± 3,9 12 ± 0,4 2,0 ±0,5 26,0±0,5 0,3±0,1
8 Тургеньское ущелье 74 ± 3,9 14 ± 0,3 3,1 ± 1,0 21,0±0,1 1,2±0,3
9 Горы Кетмень 45 ± 1,2 9,1 ± 0,5 2,0 ± 0,1 17,0±0,2 0,8±0,1
Наличие морфологических различий между популяциями эфедры позволило предположить, что они различаются между собой биохимически и генетически. Для выяснения этого вопроса мы использовали молекулярные маркёры: компонентный состав ферментов и структуру ДНК. Компонентный состав ферментов. В веточках эфедры с помощью метода изофокусирования в ПААГе определили компонентный состав пероксидазы, фосфатазы и неспецифичной эстеразы. Было выявлено, что спектр
фермента у неспецифичной эстеразы более гетерогенен [13], чем у других исследуемых ферментов. Число компонентов колеблется от 19 до 21. Различия, в основном, касаются компонентов с нейтральной рН. У «кордайских» образцов число компонентов в спектре - 19. Меньше, чем у образцов из Джунгарского Алатау - варианты 1 и 2. Можно отметить высокую активность компонентов у образцов из вариантов - ущелье Теректы, в начале и в конце ущелья, 114 км от Уш-Арала (рисунок 1).
Рисунок 1
Компонентный состав неспецитфичной эстеразы у популяций эфедры хвощевой. Изофокусирование проводили при рН 4-10. Варианты: 1-ущелье Теректы, вначале, 2-вход в ущелье, 114 км от Уш-Арала, 3- близ аула Билжан, 4-Кзыл тал, у речки, 5-Ущелье Теректы , 2 км вглубь, 6- сухое русло реки, 7-популяция 1 из Кордая, 8- популяций 2 из Кордая.
Компонентный состав кислой фосфатазы у исследуемых популяций также неодинаков. Число компонентов в спектре 17-18. Общее расположение фракций одинаково. Различия касаются 1 компонента в нейтральной рН. Можно отметить неодинаковую активность компонентов в средней части геля (рисунок 2).
Компонентный состав фосфатазы у популяций эфедры хвощевой. Изофокусирование проводили при рН 4-10. Варианты: 1-ущелье Теректы,в начале, 2-вход в ущелье, 114 км от Уш-Арала, 3- близ аула Билжан,, 4-Кзыл-тал, у речки, 5-Ущелье Теректы , 2 км вглубь, 6- сухое русло реки, 7-популяция 1 из Кордая, 8- популяций 2 из Кордая. Компонентный состав пероксидазы у исследуемых образцов также неодинаков. Число компонентов в спектре колеблется
к 2
от 3 до 9. Наиболее гетерогенный спектр у образца из Кордая - 9. Интересно, что спектр пероксидазы менее богатый, чем у неспецифичной эстеразы. Это, обычно, не характерно для видов накапливающих фенольные соединения. У вариантов - ущелья Теректы, в начале и вход в ущелье, 114 км от Уш-Арала - спектр состоит только из 3-х компонентов (рисунок 3).
Рисунок 3
Компонентный состав пероксидазы у популяций эфедры хвощевой. Изофокусирование проводили при рН 4-10. Варианты: 1-ущелье Теректы, вначале, 2-вход в ущелье, 114 км от Уш-Арала, 3- близ аула Билжан,, 4-Кзыл тал, у речки, 5-Ущелье Теректы , 2 км вглубь, 6- сухое русло реки, 7-популяция 1 из Кордая, 8- популяций 2 из Кордая. Попытка проанализировать компонентный состав растворимых белков и полипептидов была неудачной. Полученный экстракт был желеобразным. Выделить белки и полипептиды из этой массы не удалось. Вероятно, происходит связывание белков алкалоидами и образование нерастворимых в растворах со слабой ионной силой комплексов. Чувствительность изоферментного анализа намного выше, белкового, поэтому удалось проявить только ферменты.
Полиморфизм ДНК. Для изучения генетических особенностей исследуемых популяций мы изучали структуру ДНК с помощью ПЦР-анализа. Явление полиморфизма ДНК делает возможным разрешение спорных вопросов систематики и филогении в разных таксономических группах растений [9,11,12]. В ряду существующих молекулярно-генетических методов изучения полиморфизма ДНК центральное место занимает ПЦР анализ основанный на применении произвольных олигонуклеотидов, направленных на обращенные повторяющиеся последовательности (Randomly Amplified Polymorphic DNA - RAPD) [12,14].
RAPD - анализ широко используется для изучения генетического полиморфизма растений. В список растений, исследованных RAPD методом, уже в 2003 году входили представители 150 родов. В настоящее время RAPD-технология отработана на целом ряде сельскохозяйственных культур: капуста, лук, виноград, картофель, томат, морковь, фасоль и ячмень. Она широко используется в изучении растительного генома при конструировании генетических карт, анализе генетической структуры популяции, генотипировании, маркировании признаков, а также в селекционных программах для быстрой идентификации важных для селекции признаков [9, 11,12]. RAPD-технология является уникальным инструментом, позволяющий проводить экспресс-идентификацию любых организмов. Для этого можно использовать один из универсальных праймеров, который даёт возможность детально изучать структуру генома отдельных организмов и генетическую структуру популяции и видов любых организмов по локусам, ранее не подлежащих анализу. Выявленный по ряду праймеров ПЦР полиморфизм может быть использован в качестве генетических маркеров сортов, популяций, особей, клонов и других внутривидовых структур. С помощью кластерных методов анализа осуществляют построение дендрограмм, отражающих степень различий или сходства между RAPD -спектрами исследуемых объектов, что важно для изучения меж- или внутривидовых взаимоотношений. Наиболее широко используются методы UPGMA: невзвешенный парногрупповой метод с арифметическим усреднением [15].
При решении конкретных задач сопоставления геномов с помощью RAPD- метода существует проблема выбора праймера, позволяющего получать достаточно информативные, т.е. содержащие полиморфные фрагменты, RAPD- спектры.[11,15] Из 20 ранее использовавшихся нами при анализе геномов эфедры праймеров только 4 дают полиморфные фрагменты ДНК и вполне пригодны для выявления генетического полиморфизма у популяций эфедры.
Нами было обнаружено, что каждая из исследуемых популяций эфедры имеет специфический спектр RAPD -продуктов, характеризующиеся определенным количеством фрагментов, их размерами и степенью выраженности. Все используемые праймеры эффективно обеспечивали синтез специфических и воспроизводимых наборов фрагментов (ампликонов). Число ампликонов в зависимости от использованного праймера составляло от 5 до 20, их размеры варьировали в пределах 100-2000 пн [14]. Наряду с наличием общих ампликонов, большую часть спектров составляют фрагменты, которые присутствуют в одних и отсутствуют в других геномах. Эти фрагменты являются полиморфными маркерами исследуемых ДНК[11, 12, 15]. На рисунках 6 - 9 представлены RAPD- спектры разных популяция вида E. equisetina, полученные при использовании праймеров инициировавших синтез наибольшего числа полиморфных фрагментов различных линий.
Для количественной оценки RAPD-полиморфизма и определения уровня дивергенции между популяциями, полученные матрицы состояния ампликонов были обработаны программным пакетом Quantity One-4.1.1 (GelDoc, BioRad) и представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков. В них наличие или отсутствие в RAPD
- спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно и переводилось в процентное соотношения вариации. По матрицам состояний тем программным пакетом были рассчитаны матрицы различий. При этом использовался коэффициент Жаккарда Dj = Na + Nb/N a + Nb + Nab, где Na -число полос, имеющихся в спектре а, но отсутствующих в спектре b, Nb - число полос в спектре b, но не в спектре а, и Nab
- число полос, общих для обоих спектров. Исходя из этой матрицы, невзвешанным парно-групповым кластерным методом (UPGMA) была построена дендрограммы генетического родства между разными популяциями (рис 8).
Для определения внутривидового полиморфизма были исследованы 5 популяций E. equisetina. Более сходными по генетической дистанции (0.90) были образцы, собранные в популяциях, произрастающих в ущелье Теректы. Распределение коэффициента кластерного сходства с остальными популяциями было равно соответственно: горы Тургень - 0.74; горы Кетмень - 0.68; Кордайский перевал -0.64. Очевидно, что наименьшая дивергенция по RAPD -маркерам, наблюдаемая в популяциях, произрастающих в ущелье Теректы, связана с общностью их происхождения.
1 2 3 4 5 М
1000
450
250
1-Горы Кетмень, 2 - ущ Теректы, 3 - ущ Теректы 4 - Кордайский перевал, 5 - Тургень
Рисунок 4 - ЯАРО-спектры полученные с РЯ-15
1 2 3 4 5 М
1-Горы Кетмень, 2-ущ Теректы, 3-ущ Теректы, 4-Кордайский перевал, 5-Тургень
Рисунок 6 - ЯАРБ-спектры полученные с РЯ-23
1 2 3 4 5 М
тЯ ф
Г
1020
1 2 3 4 5 М
Я
650 600 550 500 450
400 350 300 250
200
150
100
700
11000 — 700
500 450 400
350 300 250 200
150
1-Горы Кетмень,2-ущ Теректы, 3-ущ Теректы, 4-Кордайский
перевал,
5-Тургень
Рисунок 5 - ЯАРБ-спектры полученные с РЯ-3
100
1-Горы Кетмень, 2 - ущ Теректы, 3 - ущ Теректы, 4 Кордайский перевал, 5 - Тургень
Рисунок 7 - ЯАРБ-спектры полученные с РЯ-12
Рисунок 8 - Кластерный анализ состояния ампликонов УРСМА-методом в НАРБ-спектрах 5 популяций Е. equisetina
Таким образом, нами показаны различия между популяциями по продуктивности, накоплению алкалоидов, компонентному составу пероксидазы, неспецифичной эстеразы, кислой фосфатазы и структуре ДНК. Показано, что у популяций эфедры из Джунгарского Алатау накапливается больше алкалоидов и ростовые процессы активнее, чем у растений из других популяций. Достоверные различия
между популяциями также показаны по биохимическим маркерам. Использованные в работе праймеры достаточно надежно дифференцируют популяции Е. equisetina. Применение нуклеотидных и изоферментных маркеров позволило предположить, что исследованные популяции различаются друг от друга генетически.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Иллюстрированный определитель растений Казахстана. - Алма-Ата.: 1969. Т.1 -С 40-41.
2 www.fito.nnov.ru/special/alkaloids/alkaloids.phtml - 24 k.
3 Атлас ареалов и ресцурсов лекарственных растений СССР. - М.: 1980. -С 334-335.
4 Губанов И А., Синицин Г.С. Биологические и экологические особенности эфедры хвощевой. Тр. Ин-та ботаники. АН КазССР. 1966. -С 1-20.
5 Wrigley J. Jel electrofocusing. A technique analyzing multiple proteins camples by isoelectrofocusing. // Science tools, 1968. V 15. P17-23.
6 Сарсенбаев К.Н., Полимбетова Ф.А. Роль ферментов в устойчивости растений. - Алматы.: Наука, 1986. 184 с.
7 Jasska V, Jasska V. Soluble phosphohydrolases and esterases in maize seedlings.// Eesti NSV TA Toimet. 1968. Т 17. №3. Р 274-283.
8 Jasska V, Genetic polimorhism of acid phosphatase in population of Rye, Secale cereale L. // Eesti NSV TA Toimet. 1979. V 28. N 3. P 185193.
9 Хавкин Э. А. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельскохозяйственная биология. - 1997. - №5 -C. 3-21.
10 Karp A., Edwards K.J. Molecular techniques in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity // Analysis, Characterization and conservation of PGR, P. 11-22.
11 Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов // Генетика, 1997, Т.33, -C 476-483.
12 Klin Lankhorst R.M., Vermunt A., Weide R. e.a. Isolation of molecular markers for tomato (L.esculentum) using random amplified polymorphic DNAs (RAPDs). // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992. V 89. P 1477-1481.
13 Shaw.C.R, Pzasad. R., Starch gel elektrophoresis of enzymes-A complitation of zecipes.,1970. USA P 14-21.
14 Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. 1994. Т.35, N11, C. 1538-1549.
15 Маниатис Т. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 100 с.
Л.С. Кожамжарова, А.С. кожамжарова,* З.Б. Есимсеиитова**
М.Х.Дулати атындагы Тараз мемлекетт!к университет! *С.ЖАсфендияров атындагы К,азац улттыц медицина университетi **Эл-Фараби атындагы К,азац улттыцуниверситетi
КЫРЬЩБУЫН КЫЛШАНЫН, ПОПУЛЯЦИЯЛЬЩ ПОЛИМОРФИЗМ1
tywh: Казак;станныц оцтустш-шыгыс белшнщ E.equisetina к;ырык;буын к;ылшасыныц популяциясы зерттелшдъ Эфедрин жэне псевдоэфедрин алкалоид жина;тарыныц, пероксидаза, арнайыландырылмаган эстераза жэне ;ышк;ыл фосфатаза компоненттш курамыныц популяция араларындагы айырмашыльщтары корсетшдь Популяция араларындагы айырмашыльщтарымен ДНК курамы ай;ындалды. Нуклеотидт жэне изоферментп маркерлермен зерттелшген популяциялардыц б1р-б1ршен генетикалы; ерекшелешлетшше болжау жасалды.
TYffiH^ свздер: E. equisetina, эфедра, биологиялы; белсенд1 ;оспалар, эфедрин, алкалоид, жу;а ;абатты хроматография, силуфолды пластинкалар.
L.S. Kozhamzharova, A.S. Kozhamzharova,* Z.B. Yesimseiitova**
M. Kh. Dulatty TarazState University *Asfendiyarov Kazakh National Medical University ** al-Farabi Kazakh National University
POPULATIONAL POLYMORPHISM OF THE EPHEDRA
Resume: Biochimical features of the different populatious of Ephedra equisetina was studied. It was found that on south-east part of Kazakhstan concentration of alkaloids, ephedrine, pseudoephedrin, compound complex of acid phosphatase, peroxidase, nonspecific esterase differ in different population. Analisis of DNA structure by RAPD-methode showed specific complex of acuplicons in ezch population. Proposed than the population task difference on genetical leril.
Keywords: E. equisetina, ephedra, biologically active additives, ephedrine, alkaloid, thin-layer chromatography, silifol plates.
УДК 581.5; 581.19; 577.15;633.88
А.С. Кожамжарова, Л.С. Кожамжарова,* З.Б. Есимсеиитова**
Казахский Национальный медицинский университет имени С.Д.Асфендиярова * Таразский Государственный университет имени М.Х.Дулати **Казахский Национальный университет имени аль-Фараби
МЕЖВИДОВОЙ ПОПУЛЯЦИОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ НА ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ РОДА EPHEDRA L.
ФЛОРЫ КАЗАХСТАНА
Впервые масс-селективнодетекторным газохроматографическим методом исследован качественный и количественный состав 7 видов эфедры, произрастающих в различных регионах Казахстана. Установлен полный спектр алкалоидов эфедринового ряда. Исследованы биохимические и генетические особенности растений.
Ключевые слова: эфедра (Ephedra), морфологические и генетические особенности, алкалоид, масс-спектрометр, хроматограмма, газожидкостная хроматография, спектр.
