CC BY
28
УДК 581.5; 581.19; 577.15;633.88
Л.С.Кожамжарова, А.С.Кожамжарова, * З.Б.Есимсеиитова**
Таразский Государственный университет имени М.Х.Дулати *Казахский Национальный медицинский университет имени СД.Асфендиярова **Казахский Национальный университет имени аль-Фараби
МЕЖВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ НА ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ GLYCYRRHIZA L. ФЛОРЫ КАЗАХСТАНА
Проведены комплексные исследования по выявлению морфологических, генетических, физиологических и биохимических особенностей 24 популяции Glycyrrhiza glabra L., G.uralensis Fisch. Показаны генетические и биохимические различия между популяциями ценной технической культуры Glycyrrhiza L. с помощью биохимических маркёров. Выявлены различия между популяциями по составу ДНК.
Ключевые слова: солодка, экономически ценный вид, флора, глицирризиновая кислота, растительное сырье, лекарственные препараты, промышленное использование, медицина, систематика, вид, популяция, гибрид, форма плода, корневая система, корневище, тип ассоциаций, полиморфизм межвидовой и внутривидовой, генетические признаки, ДНК, амплификация, секвинирование, праймер, апликон, специфические маркёры.
Glycyrrhiza L. - солодка относится к числу наиболее ценных технических растений флоры Казахстана. Её ценность обусловлена высоким содержанием в корнях глицирризиновой кислоты (до 8%), которая является исходным сырьём для получения множества лекарственных препаратов широкого спектра: антиспазматических, противовоспалительных, противоаллергических,
противораковых и других. Солодка также довольно интенсивно используется в пищевой, парфюмерной промышленности и пожарном деле в качестве пенообразователя. Наличие больших запасов растительного сырья в природе делает её очень перспективной для промышленного использования [1,2].
Комплексные исследования по выявлению генетических, физиологических, морфологических и биохимических особенностей различных популяций экономически ценных видов приобретающих особую актуальность при решении вопросов изучения природных растительных богатств и освоения их для нужд медицины, агропромышленного комплекса [3].
Целью работы является комплексное исследование популяции некоторых видов Glycyrrhiza L., флоры Казахстана по выявлению их морфологических, генетических, физиологических и биохимических особенностей.
Материалы и методы исследования.
Объектами исследования являются 24 популяции Glycyrrhiza globra L. - солодка голая (Кзылмия) и G.uralensis Fisch -солодка уральская (Мия тамыр), собранные в низовье реки Или, а также в предгорной зоне близ Алматы, близ г.Токели, близ курорта Капал-Арасан близ г.Шу, возле заповедника Аксу-Джабаглы и вдоль дорог - Алматы-Капал-Арасан, Алматы-Шу, Алматы-Ванновка, Ванновка-Ташкент. Выявления генетического полиморфизма особей были использованы современные методы с применением молекулярно-генетических маркеров. Обнаруженные полиморфные продукты могут быть полезными при
выявлении сцепления с изученными генами в селекционных программах, значительно упрощая и ускоряя процесс создания новых селско-хозяйственных культур [4,5]. Результаты исследований и обсуждение. Одним из существенных факторов определяющих конечный результат идентификации различий в геноме исследуемых объектов - это наличие высокомолекулярной очищенной ДНК.
Известны различные методы выделения ДНК из большинства органов некоторых видов растений, которые позволяют получить хорошо очищенные препараты с достаточно длинными молекулами.
Существенным фактором при выделении ДНК из растительных клеток является эффективное разрушение клеточных стенок. К сожалению, многие методы, используемые для этого, приводят к фрагментации ДНК. В дальнейшем, количество фрагментированной ДНК влияет на результаты ПЦР, поэтому количество анализируемого образца нуклеиновых кислот подбирается эмпирическим путем.
Нами был выбран оптимальный метод выделения высокомолекулярной очищенной ДНК и определена ее концентрация в расчете на единицу веса объекта по сравнению с известной. Используя одинаковое количество ДНК - (1 мкг из каждого объекта) - проведен ее электрофорез в агарозном геле, а также выбрана оптимальная концентрация агарозы для эффективного разде-ления амплифицированных фрагментов и тотально выделенной, - (для проведения ПЦР) - ДНК. Следующим этапом исследования было проведение анализа выделенных образцов ДНК различных растений с помощью ПЦР с использованием 10-членных рандом праймеров:
ОРТ-01 ОРТ-02 ОРТ-03
ОРТ-04 ОРТ-05 0РТ-06
0РТ-07 0РТ-08 0РТ-09
ОРТ-10 ОРТ-11 ОРТ-12
ОРТ-13 ОРТ-14 ОРТ-15
По результатам анализа было выявлено, что наиболее характерным является праймер ОРТ-08 и ОРТ-129. Остальные менее специфичны. Для всех популяций характерны 6 зон, которые располагаются по величине молекулярной массы от 200 до 1200 пар нуклеотидов (п.н.). Возможно, с помощью праймера ОРТ-12 невозможно выявить различия между популяциями. С помощью праймера ОРТ-10 также не удалось выявить различий между популяциями.
Из рисунка 1 (здесь в качестве праймера был использован ОРТ-08) следует, что для изучаемых популяций солодки характерен ряд уникальных продуктов.
Для всех шести популяций характерны зоны в районах 1290 и 280 пар нуклеотидов, т.е. можно предположить, что зоны 1290 и 280 пар нуклеотидов являются характерными и мономорфными для всех популяций и, впоследствии, эти продукты амплификации можно использовать в качестве молекулярно-генетического маркера вышеуказанных популяций.
В сведово-солодковой и волоснецово-солодковой популяциях отсутствуют зоны в районе 320 пар нуклеотидов, что является характерным отличием этих популяций на уровне ДНК от остальных. Эти популяции полиморфны. Ажреково-солодковая и волоснецово-солодковая ассоциации также имеют отличие от всех других популяций, низким содержанием ДНК в зоне в районе 1200 п.н. и тоже являются полиморфными (рисунок 2). Нами также проведён анализ продуктов амплификации образцов семян из трёх популяций солодки, собранных из различных областей Казахстана. Для всех образцов характерны три мономорфных продукта располагающихся в районе 1200, 800 и 200 п.н. Здесь наблюдается отсутствие зоны в образце собранном в Атырауской области и эта популяция является полиморфной.
Одной из возможных причин такой вариабельности может служить разная частота встречаемости соответствующих последовательностей.
В результате данной работы, из 15-ти праймеров, различающихся по последовательностям оснований, СС - содержанию, подобраны оптимальные праймеры, позволяющие выявить специфичные, для каждого из объектов, продукты амплификации. Было показано, что число полиморфных
продуктов зависит от используемого объекта, праймера, а также от конкретных условий проведения реакции. Выявленные наборы продуктов амплификации являются специфичными для каждого из исследуемых объектов, поэтому в дальнейшем могут использоваться для паспортизации.
Обнаруженные полиморфные продукты могут быть применены в качестве молекулярно-генетических маркеров и служить таким образом, для насыщения физических карт, при выявлении сцепления с изученными генами могут быть полезными в селекционных программах, значительно упрощая и ускоряя процесс создания новых сельскохозяйственных культур. Однако, применение наборов продуктов амплификации, а также обнаруженных полиморфных продуктов в перечисленных целях, станет возможным только после того числа реакций амплификации, которое является достаточным для подтверждения воспроизводимости наблюдаемых картин и, в случае необходимости, подбора условий, необходимых для воспроизводимости.
Рисунок 1 - Схема электрофореграммы тотальной ДНК семян солодки уральской из различных популяций: ■ солодковая, 2 - чингилово-солодковая, 3 - сведово-солодковая, 4 - вейниково-солодковая, 5 - ажреково-солодковая, волоснецово-солодковая после рестрикции эндонуклеазой НтШП.
1
6
Для использования полиморфных продуктов в качестве молекулярно-генетических маркеров необходимо подтвердить их наследуемость согласно законом Менделя. Наши, а также последние исследования показывают, что RAPD-анализ не всегда эффективен сравнительном изучении близкородственных таксонов и популяций (Vogel et all, 1996, Baird et all, 1996) [5].
В нашем случае нам удалось однозначно показать только различия между исследуемыми популяциями на одном
праймере. Однако утверждать, что они находятся на уровне различий по первичной структуре ДНК мы не можем, для этого необходимы более углубленные исследования. Методы анализа компонентного состава белков и ферментов в настоящее время широко используются для выявления различий между видами, сортами, популяциями. Поэтому нам представлялось интересным изучить влияние условий обитания и генетических особенностей солодки с помощью биохимических маркёров (рисунок 3).
Рисунок 2 - Схема электрофореграммы тотальной ДНК семян солодки уральской из различных популяций: 1 - солодковая, 2 -чингилово-солодковая, 3 - сведово-солодковая, 4 - вейниково-солодковая, 5 - ажреково-солодковая, 6 - волоснецово-солодковая
после рестрикции эндонуклеазой НтШП.
Для амплификации и секвинирования гена rbcL была экстрагирована тотальная ДНК из свежих листьев cetyltrimetilammonium bromide "(СТАВ) по Murray and Thompson (1980). Фрагмент 1374 bp ДНК кодирующий большую последовательность гена rbcL был амплифицирован в полимеразноцепной реакции (PCR) для чего использовали тотальную ДНК, Taq-DNA-полимеразу
(Takara, Japan) и два праймера -5'- ATGTCACC AC A AACAGA AACTAA AGC-3' и 5'-AGCAGCAGCTAATTCAGGACTCCA-3'. Количество ингредиентов листьев и корней определялось по числу и величине площади пика по UV-поглощению при 254 нм. Каждый компонент был идентифицирован путём сравнения времени его появления и UV-спектром соответствующего метчика.
"ос", л, ргесзмпих
Рисунок 3 - Филогенетические взаимогеномных различий между видами солодки на основании сравнении ими р^а.
Таблица 1 -Некоторые данные о солодке, собранной в различных точках Казахстана
№ Место произрастания Код Вид Характерис-тика плода Хемотип * Генотип Примеч.
Форма плода Наличие оволос- нения
1 В районе города Алматы 01A05 G. uralensis изогн. + IQC-URA не опред.
2 15 км западнее от Алматы 01A07 G. uralensis изогн. - IQC-URA не опред.
3 15 км восточнее от Алматы 01A10 G. uralensis изогн. - IQC-URA G-A тип
01A11 G. glabra ? прямая - RTN-HYB A-T тип Гибрид
01A12 G. glabra прямая - RTN-GLA A-T тип
01A13 G. glabra ? прямая + RTN-HYB G-A тип Гибрид
4 2 км западнее от Самсу 01A14 G. uralensis изогн. + IQC-URA не опред.
5 5 км западнее от Таргана 01A15 G. uralensis изогн. + IQC-URA не опред.
6 5 км северо-восточнее от Курдая 01A16 G. glabra прямая - RTN-GLA не опред.
01A17 G. uralensis изогн. + IQC-URA не опред.
7 5 км северо-восточнее от Жазуд 01A18 G. uralensis изогн. + IQC-URA не опред.
01A19 G. glabra прямая - RTN-GLA не опред.
01A20 G. glabra прямая + RTN-GLA не опред.
8 5 км южнее от Благовещенска 01A2! G. glabra прямая + RTN-GLA A-T тип
01A22 G. glabra прямая - RTN-GLA A-T тип
01A23 G. glabra ? прямая + RTN-HYB G-A тип Гибрид
01A24 G. glabra ? прямая + RTN-HYB A-T тип Гибрид
01A25 G. uralensis изогн. + IQC-URA G-A тип
9 20 км южнее от Чу 01A26 G. uralensis изогн. + IQC-URA G-A тип
01A27 G. glabra ? прямая + RTN-HYB G-A тип Гибрид
01A28 G. glabra прямая - RTN-GLA A-T тип
10 5 км западнее от Акыртобе 01A29 G. glabra прямая - RTN-GLA не опред.
11 20 км юго-западнее от Тараза 01A30 G. glabra прямая - RTN-GLA не опред.
12 5 км западнее от Жаскешу 01A31 G. glabra прямая + RTN-GLA не опред.
* G. uralensis, G-A тип; G. glabra, A-T тип.
Из 24 проанализированных образцов солодок - 5 являются гибридными. Форма плода у них прямая. Может быть оволоснена или нет. У солодок голой и уральской встречаются как оволоснёные плоды, так и не оволоснённые плоды (табл.1). Нами также сопоставлялась нуклеотидная последовательность (первичная структура) гена rbcL (рибулёзобифосфат-карбоксилазы/оксигеназы) солодок голой, уральской и гибридной. Ранее было выявлено, что разница между 2 видами по последовательности этого фермента составляет 2 нуклеотида (Hayashi et all, 2000). На основании полученных данных последовательность нуклеотидов в гене большой субъединицы rbcL была обозначена у с.уральской G-A типом, у с.голой - А-Т типом (табл.2). У гибридной формы встречаются как G-A. так и А-Т
типы последовательностей. Т.е. хотя последовательность гена rbcL видоспецифична у гибридных форм она неодинакова. Последовательность гена rbcL не может быть использована для определения степени родства гибридных форм к тому или иному виду.
Таким образом, комплексные исследования по выявлению морфологических, генетических, физиологических и биохимических особенностей 24 популяции Glycyrrhiza glabra L., G.uralensis Fisch., показали, что у солодок голой и уральской видоспецифичные флавоноиды, тритерпены и нуклеотидная последовательность гена rbcL. У гибридной формы набор этих маркёров также специфичен, хотя недостаточен для отнесения к тому или иному виду.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Кузьмин Э.В. Биоэкологические особенности солодки голой и уральской как основа их интродукции. автореф.....дисс. докт.
биол. наук. - Алматы, 1997. - 100 с.
2 Худайбергенов Э.Б. Запасы и распространение солодки в среднем течении Сыр-Дарьи. Труды Института ботаники АН КазССР, 1962. - Т.13. - С. 181-188.
3 Сарсенбаев К., Хайаши Х., Гишо Х., Абдрахманов О. Биохимические особенности популяций глицирризинсодержащих видов солодки Казахстана. - Алматы: 2002. - 177 с.
4 Худайбергенов Э.Б. Биологическая и хозяйственная характеристика видов солодки Казахстана. - Алма-Ата: Наука КазССР, 1990. - 113 с.
5 Кожамжарова Л.С., Сарсенбаев К.Н., Барамысова Г.Т. // Вестник КазНУ. - Алматы: 2006. - №1. - С. 19-27.
Л.С. Цожамжарова, А.С. кожамжарова,* З.Б. Есимсеиитова**
М.Х.Дулати атындагы Тараз мемлекетт!к университет! *С.ЖАсфендияров атындагы К,азац улттыц медицина университетi **Эл-Фараби атындагы К,азац улттыцуниверситетi
КАЗАХСТАН ФЛОРАСЫ GLYCYRRHIZA ЬвЮЛШЩ ГЕНЕТИКАЛЬЩ БЕЛГ1ЛЕРШЩ ТУРАРАЛЬЩ ПОЛИМОРФИЗМ1
tywh: Glycyrrhiza glabra L., G.uralensis Fisch турлершщ 24 популяциясыныц морфологиялы; генетикалы; физиологиялы; жэне биохимиялы; ерекшелштер1 зерттелген. Биохимиялы; маркерлердщ кемепмен ;унды техникалы; да;ыл Glycyrrhiza L. туршщ популяция аралы; генетикалы; жэне биохимиялы; ерекшелштер1 керсетшген. ДНК ;урамы бойынша популяция аралы; айырмашыльщтары дэлелденген.
ТYЙiндi сездер: мия, флора, глицирризин ^ш^лы, еймдш шигазаты, емдш препарат, ендарктш ;олданыс, медицина, систематика, тур, популяция, гибрид, жемк формасы, тип ассоциация, туршШк жэне тураральщ полиморфизм, генетикалы; белп, ДНК, амплификация, секвинирлеу, праймер, апликон, арнайыландырылган тацбалагыш.
L.S. Kozhamzharova, A.S. Kozhamzharova,* Z.B. Yesimseiitova**
M. Kh. Dulaty TarazState University *Asfendiyarov Kazakh National Medical University ** al-Farabi Kazakh National University
INTERDISCIPLINARY POLYMORPHISM OF GENETIC SIGNS AT REPRESENTATIVES OF GLYCYRRHIZA L. FLORA OF KAZAKHSTAN
Resume: have been carried out integrated research into revelation of morphological, genetic, physiological and biochemical peculiarities of 24 populations of Glycyrrhiza glabra L, G.uralensis Fisch. Have been shown genetic and biochemical distinctions between populations of valuable technical culture Glycyrrhiza L. with the help of biochemical markers. Have been revealed distinctions between populations in composition of DNA.
Keywords: licorice, flora, glycyrrhizic acid, plant raw material, medicinal preparations, industrial use, medicine, systematization genus, species, population, hybrid, taxon of species and intraspecies grade, shape of fruit, trimming of fruit, vegetative shoot, generative shoot, root system, rhizome, type of association, interspecies and intraspecies polymorphism, genetic signs, DNA, amplification, sekvinirovanie, primer, aplikon, specific markers.
УДК 581.5; 581.19; 577.15;633.88
Л.С. Кожамжарова, А.С. Кожамжарова,* З.Б. Есимсеиитова**
Таразский Государственный университет имени М.Х.Дулати *Казахский Национальный медицинский университет имени С.Д.Асфендиярова **Казахский Национальный университет имени аль-Фараби
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ E.EQUISETINA И E.INTERMEDIA ИЗ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
Определялось содержание полезных веществ надземных органов в вегетативных побегах видов рода Ephedra L. Работа проводилась в полевых и лабораторных условиях.
Ключевые слова: Ephedra L, природные соединение, алкалоид, дубильные вещества, E. equisetina, количественная морфометрия растений, E.intermedia, полиморфизм, строения куста.
Вопросы изучения природных растительных богатств и освоение их для нужд медицины и агропромышленного комплекса приобретает особую актуальность за последнее время [1]. Виды рода эфедры привлекают внимание исследователей как источники растительного сырья, используемого для получения ценных лекарственных препаратов. При анализе литературных данных показано, что биологически активные вещества этих растений относятся к достаточно изученным в настоящее времени группам природных соединений - алкалоидам, дубильным веществам и фенольным соединениям. В результате проводимых в мире исследований накоплены и частично опубликованы обширные материалы по исследованиям химического состава растений рода эфедры, выделены мажорные соединения. Однако все исследования носят фрагментарный характер. В связи с этим практический интерес представляют работы по выявлению и пополнению сведений о химическом и биохимическом составе этих ценных растений флоры Казахстана в свете последних достижений биохимии, биоорганической химии и химии природных соединений. При этом основной задачей является поиск элементов сближения
или расхождения в межвидовых и внутривидовых взаимоотношениях по химическим и биохимическим признакам различных видов рода эфедра флоры Казахстана. Изучению морфологической изменчивости посвящено много работ, тогда как характер структурной интеграции растений мало изучен, а методы ее анализа недостаточно разработаны. Существенный вклад в решение этой проблемы может внести количественная морфометрия растений, методы которой активно разрабатываются в последнее десятилетие [2].
Ботанические методы: маршрутные исследования с использованием картографической основы 1: 1 000 000 и 1: 200 000 [3], определение видового состава и размещения видов растений в фитоценозах А.А.Корчагин [4]. Определение видов растений, собранных при маршрутных исследованиях проводилось по флоре Казахстана. Полевые исследования состояли из маршрутно-рекогносцировочных обследований, которые включали выявление участков или массивов зарослей и их ботаническое описание [5-10]. В основных сообществах учитывались годичный прирост фитомассы надземных органов. Фенологические
