CC BY
13
ЛИМАЦ. Если учесть, что температурный тест можно совместить с определением способности сбраживать лактозу, то выявление фекальных кишечных палочек ограничивается дополнительным посевом (при любом бродильном или мембранном методе) в среду Козера (при условии, что «вторичная бродильная проба» будет проведена в пептонной воде с лактозой вместо среды с глюкозой).
Выводы
1. Анализ штаммов бактерий группы кишечной палочки, выделяемых из вод открытых водоемов с фекальным загрязнением и вод, благоприятных в санитарном отношении, свидетельствует о том, что показателем фекального загрязнения следует считать лишь Е. coli I (индольного) и II (безиндольного) типов. Все остальные представители группы кишечной палочки не могут быть такими показателями. Поэтому при исследовании воды открытых водоемов, выборе новых источников водоснабжения и периодическом контроле уже существующих источников необходимо учитывать только указанные разновидности Е. coli.
2. Мембранный метод колиметрии в том виде, в каком он рекомендован ГОСТ 5216-50, допускает развитие на фильтрах значительного количества (по нашим данным, свыше 90%) колоний микробов, или не входящих в группу кишечной палочки, или не сбраживающих углеводы при 43°, или не санитарно-показательных. Устранить это возможно лишь инкубированием чашек с фильтрами на диагностических питательных средах при 43—44° и проверкой в средах с лактозой и Козера.
3. При выявлении санитарно-показательных Е. coli можно ограничиться определением способности сбраживать лактозу при 43—44° и отсутствием роста в среде Козера.
Поступила 12/Х 1965 г.
УДК 615.9:614.3]-092-07:616-008.922.1-074
ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ СКОРОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ТКАНЯМИ IN VIVO
В САНИТАРНО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Т. А. Попов, И. М. Эпштейн, И. П. Березин
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Государственный онкологический институт им. И. А. Герцена, Институт экспериментальной и хирургической аппаратуры и инструментов, Москва
Нарушение окислительно-восстановительных процессов в тканях характерно для многих химических ингредиентов и веществ. Поэтому в санитарно-токсикологическом эксперименте может оказаться необходимым использование ряда методик для определения кислородного баланса в тканях. При регистрации кислорода в живых тканях возможно применение полярографического метода.
Мы использовали полярографический метод регистрации напряжения кислорода (Р02) при помощи схемы с наложением внешней электродвижущей силы (э. д. с.) на электроды.
Ставился подострый опыт на белых крысах весом 280—320 г в 3 сериях (по 8 крыс в каждой), причем 1 из них была контрольной. Крысам I серии в течение 80 дней вводили перорально водный раствор 2, 4 динитрофенола (ДНФ) в концентрации '/го LD5o, т. е. 1,5 мг/кг (Т. А. Попов). Крысам II серии вводили ту же дозу ДНФ од-
5*
67
нократно в день опыта. В контрольной (III) серии опытов крысы ДНФ не получали. Во время опыта животные находились в специально сконструированной нами камере из органического стекла, позволяющей подавать в герметических условиях 100% кислород. Кислород подавали со скоростью 5 л/мин, что обеспечивало полный обмен воздуха с удалением выдыхаемой С02.
Для определения скорости потребления кислорода была использована кислородная нагрузка— дыхание кислородом в течение 30 сек. (А. Д. Снежко). Кислородный режим в мышечной ткани учитывали с помощью электронного самопишущего потенциометра ЭПП09, обеспечивающего непрерывную запись силы тока в цепи электродов (платина — хлорированное серебро). Запись вели на 15, 30, 60, 90 и 120-й минуте после затравки животного ДНФ.
Для анализа полученных результатов использовали коэффициенты: Ki — представляющий отношение максимальной силы тока к исходной и характеризует степень насыщения тканей кислородом после кислородной нагрузки; Кг, Кз и К4, представляющие отношение силы тока, регистрированной на 60, 120 и 180-й секунде после начала подачи кислорода к исходной; по этим коэффициентам можно приблизительно судить о степени утилизации кислорода тканью во времени. Средние величины этих коэффициентов, полученные через 90 мин. после затравки животных, показаны в табл. 1. В это время были выявлены наиболее существенные изменения.
Анализ полученных данных показывает, что однократное введение ДНФ приводит к значительному снижению насыщения мышцы кислородом (Ki I серии крыс 2,28±0,01 ; Ki III серии 3,05±0,075) и повышает его потребление (Кг).
ДНФ является ингибитором' фосфорилирующего пути окисления. Он разобщает дыхание от сопряженного с ним в норме фосфорилирова-ния. Разобщение дыхательного фосфорилирования ДНФ может считаться установленным, хотя механизм его еще во многом неясен (Е. С. Слей-тер). Многие авторы отмечают увеличение обмена веществ и потребления кислорода при воздействии ДНФ (С. М. Дубашинская и соавторы; Duvoir и Perrault; Derobert и соавторы; Э. Р. А. Мируэдзер; JT. Рачев и и соавторы). Однако сведений об интенсивности потребления кислорода тканями при воздействии ДНФ мы не нашли. Полученные нами данные (см. табл. 1) указывают на уменьшение степени насыщения мышечной ткани кислородом (Ki) и на ускоренную его утилизацию (Кг).
Использованный нами метбд измерения и интенсивности утилизации тканью Ог по Снежко обладает рядом существенных недостатков, снижающих точность определения. Действие ДНФ на дыхание тканей в большой степени маскируется компенсаторными реакциями организма (изменение легочной вентиляции, скорости кровотока, реакция прека-пилляров, являющаяся целесообразной реакцией сохранения постоянства Р02 в тканях, и т. д.).
Стремясь создать более строгие условия для определения интенсивности дыхания при воздействии ДНФ, мы измеряли скорость падения Р02 в мышцах после наложения артериального жгута.
Таблица 1
Влияние ДНФ на насыщение и потребление кислорода в мышечной ткани (на 90-й минуте после введения препарата)
s Дыхание кислородом в течение 30 сек.
-е- ■е-S î U III серия (контроль) I серия II серия Р
к! М±т
Ki К-2 Кз к, 3,05±0,075 2.55 ± 0,09 1.41 ± 0,06 1,15 ± 0,05 2,28±0,1 1,59 ±0,2 1,21 ±0,1 1,06±0,04 2,51 ±0,04 1,75 ±0,23 1,29 ±0,15 1,1 ±0,08 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05
Методика опыта1 заключалась в следующем. В бедренные мышцы крысы вводили медный амальгамированный электрод, активная поверхность которого имела форму цилиндра (диаметр 0,3 мм и длина 8 мм). Второй электрод — из углеродистой стали (диаметр 3 мм, длина 10 мм) —вводили по близости под кожу. После включения поляризации цепи давали время на установление приблизительно постоянной силы диффузионного тока (5—10 мин.). Затем на уровне тазобедренного сустава накладывали артериальный жгут, полностью прекращающий Циркуляцию крови в конечности.
После наложения жгута отмечалось быстрое падение силы диффузионного тока, вызванное падением Р02 в тканях. Артериальный жгут, вызывая артериальную ишемию в нижележащем участке конечности, создавал замкнутую систему, при которой ткань вынуждена была расходовать запасы кислорода в виде химически связанного (оксигемогло-бин крови и оксимиоглобин) и в виде физически растворенного в тканевой жидкости. Об интенсивности дыхания тканей можно было судить по темпу падения Р02. Потребление кислорода регистрировали на ЭПП09 в течение 15 сек. после наложения жгута при скорости движения диаграммной ленты 9600 мм в час.
Сразу после прекращения циркуляции крови в конечности возникали беспорядочные осцилляции, которые длились 1—2 сек., после чего начиналось закономерное падение тока, отражающее процессы потребления кислорода тканью.
Показания прибора считывали в делениях диаграммной шкалы (/<) через каждые 1,9 сек. (5 мм диаграммной бумаги). Для вычисления константы скорости дыхания в данных условиях пользовались методикой, предложенной одним из авторов настоящей статьи (И. М. Эпштейн).
Силу тока, соответствующую началу расходования кислорода, принимали за /о. Далее на основании полученных данных строили график в координатах:
Представленная данным способом кинетика дыхания графически выражалась отрезками прямых, имеющих соответствующие углы наклона. Больший угол между отрезком прямой и абсциссой времени указывал на большую скорость тканевого дыхания (рис. 1 и 2).
Как известно, химические реакции, изображаемые прямыми линиями в данной системе координат, являются химическими реакциями первого порядка. Здесь представляется возможным представить кинетику утилизации кислорода в терминах кинетики химических реакций. Быстрота химического процесса характеризуется определенной константой, называемой константой скорости реакции (М. Е. Захарьевский; В. А. Ки-реев и др.). Константа скорости реакции первого порядка может быть вычислена по следующей формуле:
. /о . /о
к ^-п.-^т,
А 0,43 (/¡> — <1) '
где /о — сила тока до наложения жгута; 1\ и /2— сила тока, измеренная в моменты времени (Л и ¿2)• Кривая падения силы диффузионного тока после наложения жгута схематически изображена на рис. 3.
Использована безбатарейная схема (И. М. Эпштейн).
Рис. 1. Полярограммы, полученные у одной и той же крысы, которой был наложен жгут до введения ДНФ (/) и жгут 2 через 1 '/г часа после
введения ДНФ. Время между двумя вертикальными линиями на диаграмме равно 3,8 сек.
/
(
-1-1-1-1-1-1_I_' »
О /.9 3.8 5.7 /3.3 /5.21 сек
Рис. 2. Кинетические кривые в координатах ----Л соответствующие полярограммам, показанным на рис. 1.
/сел
Рис. 3. Схематическая кривая падения силы диффузного тока в процессе утилизации мышцей запаса кислорода после наложения артериального жгута.
Обозначения в тексте.
При помощи методики мы изучали действие ДНФ на скорость потребления кислорода мышечной тканью. Опыты были поставлены на 15 белых крысах. Потребление мышцей кислорода после наложения жгута регистрировали до введения ДНФ на правой задней конечности и через 90 мин. после введения ДНФ (1,5 мг/кг) на левой. Характерные кривые потребления кислорода до и после введения ДНФ показаны на рис. 1. Как видно из полярограмм, ДНФ приводит к увеличению скорости потребления кислорода (/, кривая в контроле падает с меньшей скоростью, чем в опыте, а отрезок, соответствующий кинетической кривой, образует меньший угол с абсциссой времени).
Полученные экспериментальные данные были обработаны статистически.
Анализ полученных данных показывает, что однократное введение животным ДНФ приводит к значительному повышению (на 43% при Р<0,01) скорости потребления кислорода мышечной тканью (табл. 2).
Таблица 2
Влияние ДНФ на константу скорости дыхания мышцы задней конечности крысы
Группа животных Число животных Константа скорости дыхания мышечной ткани (1/сек) Различия (в %)
Контрольная 15 0,0715±0,006 43
*=5,0
Опытная . . . 15 0,1020 ±0,001 Р<0,01
Вычислить абсолютные величины интенсивности дыхания тканей по описанному методу в данной модификации невозможно потому, что трудно учесть роль кислорода, запасенного в окси-гемоглобине крови капилляров.
Следует отметить, что до сих пор интенсивность дыхания изучается по методу Варбурга (С. Е. Северин; Н. П. Мешкова и С. Е. Северин, и др.) путем измельчения ткани. Примененная нами методика позволяет производить сравнительное сопоставление интенсивности дыхания in vivo в интактной ткани и выражать кинетику дыхания через константу скорости реакции.
Предлагаемый метод регистрации скорости потребления 02 в живых тканях может быть использован в хроническом опыте и позволит проследить за воздействием малых доз изучаемого вещества в течение длительного времени.
Выводы
1. Полярографический метод исследования Р02 в тканях живых организмов является чувствительным тестом при определении ПДК. ряда веществ, спецификой токсикодинамики которых служит нарушение тканевого дыхания.
2. Можно считать целесообразным применение полярографического метода исследования кислорода в тканях в санитарно-токсикологическом эксперименте.
ЛИТЕРАТУРА
Дубашинская С. М., Каган А. И., M е л ь н и к о в а В. Ф. Труды и материалы Украинск. ин-та патологии и гигиены труда. Харьков, 1935, т. 14, с. 28. — Мешкова Н. П., С е в е р и н С. Е. Практикум по биохимии животных. М., 1950. — Попов Т. А. Фармакол. и токсикол., 1965, № 4, с. 493. — Северин С. Е. Биохимия, 1957, в. 1—2, с. 259. — Северин С. Е. Докл. АН СССР, 1959, т. 128, № 3, с. 628. — С н е ж к о А. Д. Биофизика, 1956, в. 6, с. 585. — Эпштейн И. М. Бюлл. экспер. биол., 1960, № 12, с. 104. — Рачев J1., Тодоров И., Статева С. Обмен веществ в детском возрасте. София, 1962, с. 38. — Derobert L., Deschaux P., HadenqueA. et al., Ann. med. legale, 1950, v. 30, p. 67. — D u v o i r M., P e r r a u 11 M. В кн.: Traite de medecine. Paris, 1948, v. 4, p. 475. — Мируэдзер Э. A. Некоторые проблемы гигиены труда и профессиональной патологии. М., 1960, с. 185. — Слейтер С. Е. В кн.: Доклады 5-го Международного биохимического конгресса. М., 1962, симп. 5, с. 343.
Поступила 7/1 1966 г.
