Научная статья на тему 'Ауторегуляция дыхательной активности Yersinia pestis'

Ауторегуляция дыхательной активности Yersinia pestis Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
49
1
Поделиться
Ключевые слова
ЧУМНОЙ МИКРОБ (YERSINIA PESTIS) / ОКИСЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ / АУТОРЕГУЛЯЦИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ / ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ / ПОЛЯРОГРАФИЯ / PLAGUE PATHOGEN (YERSINIA PESTIS) / GLUCOSE OXIDATION / AUTOREGULATION OF RESPIRATORY ACTIVITY / RESPIRATORY CONTROL / POLAROGRAPHY

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Чеботарев Е. В., Пименов Е. В., Бывалов А. А., Бакулин М. К., Кожемяко А. В.

С использованием полярографического метода обоснована возможность моделирования in vitro у бактерий Yersinia pestis ауторегулируемой последовательности метаболических состояний (по аналогии с изолированными митохондриями) путем введения в среду инкубации микроколичеств глюкозы. Предложен рассчитываемый по полярограмме показатель степени энергозависимой ауторегуляции дыхательной активности Y. pestis "метаболический дыхательный контроль" (МДК), численно равный отношению скорости дыхания бактерий в активном состоянии (состояние 3) к скорости дыхания в состоянии "отдыха" (состояние 4). На примере развивающейся и переживающей популяций Y. pestis показана возможность применения параметров ауторегуляции дыхательной активности для оценки физиологического состояния бактерий.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Чеботарев Е. В., Пименов Е. В., Бывалов А. А., Бакулин М. К., Кожемяко А. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Autoregulation of Respiratory Activity in Yersinia pestis

The polarographic techniques were used to substantiate the possibility of in vitro modeling of an autoregulated succession of metabolic conditions in Yersinia pestis bacterial cells (analogous to isolated mitochondria) by adding microconcentrations of glucose into the cultivation medium. The authors offer the index of "metabolic respiratory control" (MRC) which is estimated according to the polarogram to characterize the degree of energy-dependent autoregulation of Y. pestis respiratory function, and is numerically calculated as a ratio of bacterial breathing rate in the active state (condition 3) to that in the "rest" state (condition 4). Two Y. pestis populations, a developing and a surviving ones, were used to demonstrate the possibility of assessing physiologic conditions of bacteria on the basis of respiratory autoregulation parameters.

Текст научной работы на тему «Ауторегуляция дыхательной активности Yersinia pestis»

! СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

I

1.Варвашевич Т.Н., Никифорова JI.C.; Богомазова Т.В, // Лаб. дело. - 1989. - № 2. - С. 61—63. - 2, Василь^ ева О.В|., Любицкий О.Б., Гуськова Т. А.: и др.//Вопр. мед. химии. - 1999. -№4. - С. 326-332. -3. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Обыночная Е.Г. // Педиатрия. - 2003. -Т. 5, №9,. - С. 322-326. - 4. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г. А. // Микробиол. - 2003. - Т. 72, № 5. -С. 600-608. - 5. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1993. - № 6. - С. 34-37. -

6. Свободные радикалы в биологии / Под ред. Прайор У. -М.: Мир,! 1979. - Т. 1. - 318 с. - 7. Смирнова Г.В., Музыка

Н.Г., Глуховченко М.Н., Октябрьский О.Н.//Биохимия. - 1^97. - Т. 62, вып. 5. - С. 563-568. - 8. Соколенко А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультиви-руемых форм холерных вибрионов: Автореф. дис.... канд. биол. наук. - Саратов, 2000. - 18 с. - 9. Allen R.Y., Newton R.K., Sohal Ri.S. III. Cell Physiol. - 1985. r- Vol. 125, N 3. - P. 413-419. - 10. Benov L., Fridovich I. // J. Bacteriol. - 1995. -P. 3344—3346. - 11. Bensinger R.E., Johnson C.M.//Anal. BiochemJ- 1981. - Vol. 116, N 1. - P. 142-145. - 12.Hochman

A. // Crit: Rev. Microbiol. - 1997. - N 23. - P. 207-214. - 13. Liu Sh.V. H Logical Biology. - 2000. - Nl. - P. 17-20. -14. Mizunoi Y., Wai S.N., Ishikawa T.//FEMS Microbiol. Lett. - 2000. - Vol. 186, N 1. - P. 115-120. - 15.Tauati D. // Mol. Biol. Free. Radi. Scavering. Syst. - Cold Spring Harbor (N.Y.), 1992.-P. 231-261.

A.V.Sokolenko, E.A.Men'shikova, L.E.Aseyeva, A.V.Mironova, S.V.Titova

The Oxidation Stress as a Cause of Origination of Non-Culturable Vibrio cholerae Forms

Rostov-on Don Anti-Plague Research Institute

Alteration dynamics was studied in the enzymatic activity of the antioxidant systems of vegetative and non-culturable forms of the parent cholera vibrio strains and their subcultures resistant to hydrogen peroxide. In the transitional population catalase activity was slightly decreased while in the non-culturable state it grew 1.5 to 8.0 times as high as that at the initial stage. Catalase activity of the revertant strains was close to that of the vegetative cultures. Peroxidase activity in the non-culturable state cells increased 3 to 80-fold, being, however, not detectable at later terms (12 months). Superoxr ide dismutase activity varied analogously to that of peroxidase. The dynamics of activity variations of the antioxidant enzymes in the non-culturable vibrio forms, superoxide dismutase activity subsiding in the presence of some antioxidants such as adrenalin and arbidol, accompanied with the intensified growth of Vibrio cholerae, may be indicative of the influence of the oxidation stress involved in the formation mechanism of non-culturable cholera vibrios.

Key words: non-culturable forms, cholera vibrio, anioxidant enzymes, catalase, peroxidase, superoxide dismutase, oxidation stress.

Поступила 14.09.05.

УДК .616.981.452

Е.В.Чеботарев1, E.В.Пименов1, А.А.Бывалов2, М.К.Бакулин3, А.В.Кожемяко1 j АУТОРЕГУЛЯЦИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ YERSINIA PESTIS

'Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров;2Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар;3Вятский государственный университет, Киров

I . .

С использованием полярографического метода обоснована возможность моделирования in vitro у бактерий Yersinia pestis ауторегулируемой последовательности метаболических состояний (по аналогии с изолированными митохондриями) путем введения в среду инкубации микроколичеств глюкозы. Предложен рассчитываемый по полярограмме показатель степени энергозависимой ауторегуляции дыхательной активности Y. pestis - «метаболический дыхательный контроль» (МДК), численно равный отношению скорости дыхания бактерий в активном состоянии (состояние 3) к скорости дыхания в состоянии «отдыха» (состояние 4). На примере развивающейся и переживающей популяций Y. pestis показана возможность применения параметров , ауторегуляции дыхательной активности для оценки физиологического состояния бактерий.

! ‘

j Ключевые слова: чумной микроб (Yersinia pestis), окисление глюкозы, ауторегуляция дыхательной активности, дыхательный контроль, полярография.

В исследованиях физиологии патогенных микроорганизмов актуальным является изучение на клеточном и популяционном уровнях закономерностей регуляции биоэнергетических процессов, состояние которых во многом определяет функциональный статус бактерий на всех этапах их жизненного цикла [1, 9]. Несомненное преимущество в этих исследованиях имеют экспрессные высокочувствительные методы, позволяющие в адекватных условиях эксперимента получать кинетические характеристики ответных реакций изучаемого объекта на внейпше воздействия. К числу таких методов относится полярографическое исследование дыхательной активности бактерий [5, 10].

В то же время у микробиологов сформировалось критическое отношение к физиологической информативности такого параметра дыхания, , как абсолютная (валовая) скорость потребления кисло-

рода при окислении эндогенных или экзогенных субстратов [8, 12]. Однако попытки применения для исследования физиологического (функционального) состояния бактерий Yersinia pestis методических приемов, разработанных в митохондриологии, а именно, оценки степени ауторегуляции окислительной активности по величине дыхательного контроля (ДК) [13] путем добавления в среду инкубации клеток экзогенного аденозиндифосфата (АДФ) не имели успеха [2, 3,12,15].

Предложенные альтернативные варианты исследования ауторегулируемого дыхания факультативных анаэробов [12, 14, 15] не получили дальнейшего развития в микробиологической практике. Сложилось, таким образом, представление о слабом сопряжении дыхания и фосфорилирования у бактерий и о принципиальной невозможности моделирования у них ауторегулируемой последовательности

метаболических состояний [2, 3, 6, 12, 15].

Ранее нами было показано, что если к клеткам чумного микроба добавить глюкозу в микроконцентрациях (10-25 мкМ), то динамика потребления ими кислорода в течение 1^4 мин будет иметь двухфазный характер [7]. Данный эффект энергозависимой ауторегуляции дыхательной активности бактерий не только по внешней аналогии, но и по биохимическому механизму своего проявления и интерпретации весьма близок к классическому митохондриальному дыхательному контролю [13], а также к так называемому Крэбтри-эффекту - явлению угнетения дыхания клеток гликолизом [11].

Цель работы - изучить явление ауторегуляции дыхательной активности при окислении микроколичеств глюкозы клетками чумного микроба in vitro и установить физиологические закономерности ее изменения в развивающейся и переживающей популяции Y. pestis.

Материалы и методы

В работе использовали глубинные культуры Y. pestis (авирулентный штамм EV и вирулентный штамм 1300), выращенные в жидких средах на основе гидролизатов мяса и казеина в 10-литровом аппарате с аэрацией в течение 27 ч при температуре (27+1) °С и pH 6,7+1,0, а также поверхностные культуры Y. pestis этих же штаммов, выращенные на плотных питательных средах (ППС) на основе ферментативного гидролизата мяса в матрасах в течение 2 сут при температуре (27+1) °С, которые смывали с ППС физиологическим раствором. В опытах по изучению динамики параметров дыхания в процессе выращивания пробы глубинных культур отбирали через каждые 3 ч культивирования и на начальных этапах роста (до 9-12 ч) концентрировали их фильтрованием.

Дыхательную активность бактерий измеряли при температуре (27+1) °С. В качестве среды инкубации использовали водно-солевой раствор следующего состава: 60 мл 0,15 М Na2HP04-2H20; 40 мл 0,075 М КН2Р04; 0,4 мл 1М MgClr6H20 (pH 7,15). Исходная концентрация кислорода в среде инкубации составляла 240 нмоль 02. Скорости дыхания (V) рассчитывали по количеству кислорода, потребленного 1 млрд жизнеспособных клеток за 1 мин (нмоль 02/млрд кл.-мин). Растворы субстратов, разобщителей и ингибиторов дыхания готовили на среде, идентичной по составу среде инкубации. В работе использовали изготовленную в лабораторных условиях установку для полярографической регистрации скорости убыли кислорода из среды инкубации с бактериями, применяя поляризующийся платиновый электрод открытого типа [10]. Рабочий объем полярографической ячейки -2 см3. Объемы исследуемых проб культур бактерий составляли 10-50 мкл из расчета создания в среде инкубации полярографической ячейки общей концентрации примерно 1-3-109 кл./см3.

Гликолитическую активность бактерий определяли при температуре (27±1) °С по скорости закис-ления клеточных суспензий, приготовленных путем разведения исходных культур в объемном соотношении 1:5 физиологическим раствором NaCl. В ка-

честве субстрата использовали глюкозу в конечной концентрации МО-4 М. Скорость закисления регистрировали по показаниям рН-метра с записью на диаграммную ленту. Содержание глюкозы в пробе при определении скорости потребления углевода чумными бактериями измеряли с помощью анализатора глюкозы фирмы «Beckman», США.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Биологическую концентрацию (БК) определяли общепринятым «чашечным» методом, высевая разведенные клеточные культуры на ППС в чашках Петри и подсчитывая число колоний через трое суток выращивания при температуре (27+1) °С. Общую концентрацию (ОК) культур определяли по стандарту мутности ГИСК.

Статистическую обработку результатов измерений проводили в соответствии с рекомендациями Г.Ф.Лакина [4], вычисляя средние арифметические значения показателей и доверительные интервалы их отклонений (Х+195) для уровня вероятности 95 %. Достоверность различий при необходимости определяли, сравнивая расчетные (Ц,а1ГГ.) и табличные (tcrer.) значения критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Изучая динамику потребления кислорода при окислении бактериями глюкозы, нам удалось путем перехода на более низкие концентрации углевода наблюдать смену фазы активного дыхания (Уз), наступающей через 2-3 с после добавления субстрата, более медленной фазой окисления (V4). Разобщитель процессов переноса электронов и фосфорилирования

2,4-дишпрофенол (2,4-ДНФ) частично снимает эффект торможения, однако, не во всех опытах. Повторная добавка глюкозы приводит к новой стимуляции дыхания и последующему его торможению. Типичная для всех исследованных культур и штаммов Y. pestis полярограмма дыхания интактных бактериальных клеток приведена на рис. 1.

Необходимые пояснения, а также примеры расчета по полярограмме абсолютных (V) и относительных (СД, МДК) параметров дыхания приводятся в подрисуночном тексте. Полярограмма дыхания отражает ауторегулируемую последовательность метаболических состояний бактерий (V2 —> V3 —> V4), начиная с дыхания на эндогенных субстратах (состояние 2). Состояние 1 (V|) по классификации Чанса-Вильямса [13] характерно для полностью истощенных в голодной среде митохондрий и для бактерий является скорее гипотетическим, поскольку, в отличие от этих изолированных органелл, бактериальные клетки даже после интенсивного голодания всегда содержат некоторое количество эндогенных метаболитов. В наших опытах используются интактные бактерии in situ (в составе исследуемых культур) и не применяются такие процедуры, как разрушение бактериальных клеток, отмывка и истощение бактерий по эндогенным субстратам [12, 15], что обеспечивает физиологические условия эксперимента.

Проведя несложные расчеты, можно убедиться, что для полного окисления 25 нмоль глюкозы с образованием конечных продуктов С02 и Н20 требуется 150 нмоль кислорода. Фактически за период фазы быстрого окисления глюкозы (V3) бактерии потребляют, как правило, 30-40 нмоль кислорода

1 По оси абсцисс - время дыхания, мин; по оси ординат - концентрация кислорода в среде инкубации, нмоль 02-Стрелками указано время введения в среду инкубации добавок. Участки подпрограммы: а-а - базовая линия соответствует 100 % относительного содержания Ог, растворенного в среде инкубации (240 нмоль); а-б - фаза дыхания бактерий, окисляющих эндогенные субстраты (У**,,, или У2) - состояние 2; б-в - фаза быстрого (активного) дыхания бактерий после добавления в среду инкубации глюкозы (V„ и или Уз) - состояние 3; в-г - фаза медленного (ауторегулируемого) дыхания бактерий (У4) - состояние 4; г-д - фаза разобщенного дыхания бактерий после добавления ‘ 2,4-динитрофенола (Уда®).

Условные обозначения: ()ог - количество кислорода, потребленного в фазе быстрого дыхания бактерий, нмоль; х1 продолжительность фазы активного дыхания бактерий, мин.

Расчетные показатели: V - скорость потребления кислорода в той или иной фазе дыхания бактерий, нмоль СЬ/мин; СДп.,25 - коэффициент стимуляции дыхания бактерий глюкозой (СД-п.и = Уз/Уз), отн. ед.;

МДК - коэффициент метаболического дыхательного контроля (МДК = Уз/У4), отн. ед.; СДднф - коэффициент стимуляции дыхания бактерий 2,4-динитрофенолом (СДднф = Удна/У4), отн. ед.

(0о2). Однако в некоторых опытах мы не наблюдали торможения дыхания бактерий и после потребления 150 нмоль 02, либо это торможение было слабо выражено. ! В других опытах, напротив, торможение было значительным. Наблюдаемые порой существенные отклонения от стехиометрически рассчитанных и экспериментально установленных усредненных данных, а также отсутствие, в ряде случаев, двухфазности процесса дыхания клеток, окисляющих глюкозу в низких концентрациях, явились предпосылкой для более детального изучения данного явления.

Интактные клетки бактерий всегда содержат определенное количество эндогенных субстратов, АТФ и ХДФ, а Р„сорГ., по условиям наших экспериментов, I находится в избытке в среде инкубации. Первичные этапы катаболизма глюкозы у бактерий включают транспорт углевода и превращение его в глюкозо1-6-фосфат и фруктозо-1,6-дифосфат. Поскольку эти процессы требуют затраты энергии АТФ, можно предположить, что внутриклеточное отношение [АТФ]/[АДФ] у бактерий уменьшается, а активация дыхания в значительной мере обусловлена окислением эндогенных субстратов в дыхательной цепи (ДЦ) для компенсации низкоэнергетического сдвига. Для подтверждения этого предположения в! предварительных опытах с 8 культурами чумного] микроба (штамм ЕУ, смывы с ППС) мы убедились, что продолжительность фазы активного дыхания (т) бактерий, окисляющих 25 нмоль глюко-

зы, совпадает по времени с продолжительностью ее полного потребления клетками из среды инкубации (2,39+0,19 и 2,27+0,17 мин соответственно).

Используя, в основном, способы расчета параметров, принятые в митохондриологии, а также устоявшуюся терминологию, степень ауторегулируемого торможения дыхания исследуемых бактерий, мы также охарактеризовали показателем МДК (метаболический дыхательный контроль). Для подтверждения его информативности в качестве добавок, снижающих энергизованность клеток, использовали разобщитель - протонофор 2,4-ДНФ (1-10-4 М) и неметаболизируемый аналог глюкозы ог-МГ (1-10”2 М), энергозависимый транспорт которого в клетки связан с затратами энергии АТФ [12, 15]. Избирательное ингибирование протонтрансло-цирующей аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) ди-циклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) в концентрации 510-3 М, напротив, способствует энергизации клеток в экспоненциальной фазе развития, когда активность данного фермента наиболее высока [12]. Результаты исследования закономерностей ауторегуляции дыхательной активности У. под влиянием энергизующих и деэнергизующих добавок представлены в таблице, из данных которой следует, что изменение параметров дыхания, характеризующих степень ауторегуляции дыхательной активности (МДК, У4), при моделирующих воздействиях имеют статистически подтвержденный однотипный характер для различных культур и штаммов У. резйз. Так, воздействия, приводящие к разобщению окислительного фосфорилирования (2,4-ДНФ) и деэнергизации клеток (ог-МГ), вызывают ослабление ауторегулируемого торможения окислительной активности бактерий, что проявляется в увеличении скорости дыхания чумного микроба в метаболическом состоянии 4 (У4) и в снижении величины МДК. Напротив, энергизация клеток, обработанных ДЦКД, приводит к достоверному снижению скорости дыхания в состоянии «отдыха» (У4) и достоверному увеличению значений МДК. Разнонаправленный характер изменения других параметров дыхания в этих опытах взаимно не согласован и не под-

Изменение параметров дыхання У.ре*под действием разобщителя 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ), неметаболизи-руемого а-метил-^-О-глюкопиранознда (а-МГ) и ингибитора АТФ-азы дициклогексилкарбодиимида (ДЦКД), (X ±1»)

Параметры дыхания Относительное изменение параметров дыхания под действием

2,4-ДНФ (п=17) 2) а-МГ (п=14)3) ДЦКД (п=8)4)

У2 (Уэнд.) 109,8±5,9 147,3±13,8 69,2±13,2

ъ 115,7±16,6 82,1±7,5 54,3±14,6

V, 154,0±12,2 129,6±14,7 48,6±13,1

СДгл.25 111,8±5,2 59,4±7,1 87,9+11,3

МДК 76,1+4,0 64,1±6,2 127,3±14,4

Примечания: 1) За 100% принимаются значения параметров дыхания У. ре«й в контрольной пробе (без добавок 2,4-ДНФ, а-МГ, ДЦКД).

2) Исследованы 8 культур штамма ЕУ, из них 5 - смыв с ППС и 3 - глубинные 27-часовые культуры; 9 культур штамма 1300, из них 1 -смыв с ППС и 8 - глубинные 27-часовые культуры.

3) Исследованы 6 культур штамма ЕУ, из них 3 - смыв с ППС и 3 - глубинные 27-часовые культуры; 8 глубинных 27-часовых культур штамма 1300.

4) Исследованы 8 глубинных 18-часовых культур штамма 1300.

дается однозначной трактовке.

Совпадение продолжительности активного БК

дыхания (т) и продолжительности аккумуляции 30

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

25 нмоль глюкозы, а также результаты, представленные в таблице, позволяют полагать, что активация дыхания бактерий при добавлении микроколи- 25'' честв глюкозы связана не столько с окислением экзогенного углевода, сколько с инициацией окисле- 20 . ния эндогенных субстратов, компенсирующего затраты энергии на транспорт и первичные реакции 15 . фосфорилирования утилизируемого углевода. Фаза активного дыхания (состояние 3) продолжается, по крайней мере, до тех пор, пока происходит энерго- 10 ' потребляющий процесс утилизации глюкозы, т.е. создаются условия для сдвига равновесия реакции 5 . «фосфорилирование АДФ <ч> дефосфорилирование АТФ» в правую сторону.

Результаты исследования ауторегуляции дыхательной активности развивающейся популяции, традиционно используемой физиологами как модель, с помощью которой отрабатываются критерии физиологического состояния микробных культур, подтвердили информативность разрабатываемого подхода. Обобщенные результаты опытов с десятью культурами У. резйз (штамм 1300), выращиваемыми в 10-литровом аппарате с аэрацией при температуре (27+1) °С и pH 6,7+1,0, приведены на рис. 2.

Как следует из представленных на рис. 2 данных, в лаг-периоде развития культур (до 6 ч от начала выращивания) происходит некоторое снижение концентрации живых микробов. В этот же период значительно увеличивается удельная скорость эндогенного дыхания, снижаются величины параметров СДгл.25 и МДК. Показатель МДК к концу лаг-периода и началу экспоненциальной фазы роста (6-9 ч от начала выращивания) принимает, как правило, значения, близкие минимальному (1,00).

Во время экспоненциальной фазы роста, по мере накопления биомассы, происходят снижение удельной скорости эндогенного дыхания, более выраженное к 12-15 ч культивирования, а также увеличение значений параметров СДгЛ.25 и МДК вплоть до окончания культивирования. Через 9—12 ч от начала выращивания бактерии проявляют сначала слабую, а с увеличением продолжительности культивирования - более выраженную способность стимулировать дыхание под действием разобщителя

2,4-ДНФ, что свидетельствует об увеличении трансмембранного градиента протонов.

Активное размножение бактерий в экспоненциальной фазе роста периодической культуры требует значительных энерготрат, что, в свою очередь, обусловливает высокую скорость биоэнергетических процессов. Переход в стационарную фазу, напротив, сопровождается снижением скорости накопления биомассы и, следовательно, значительным уменьшением энерготрат на биосинтезы; энергизо-ванность покоящихся клеток при этом возрастает.

В стационарной фазе роста культуры характеризуются наиболее низкими за весь цикл развития скоростями окисления эндогенных субстратов. К концу стационарной фазы роста (27 ч культивирования) ауторегуляция дыхательной активности клеток по показателю МДК достигает максимальных значений

СД-..25

t, Ч

Рис. 2. Динамика параметров дыхания и биомассы Yersinia pestis (штамм 1300) в процессе периодического культивирования

По оси абсцисс - время культивирования, ч; по осям ординат -концентрация живых бактерий в культуре (БК), млрд кл./см3; удельная скорость эндогенного дыхания бактерий (V,1UJ, нмоль СЬ/млрд кп. мин;

коэффициент стимуляции дыхания бактерий глюкозой (СД-л.ц), отн. ед.; коэффициент стимуляции дыхания бактерий 2,4-динитрофенолом (СДцнф), отн. ед.; коэффициент метаболического дыхательного контроля (МДК), отн. ед.

Обозначения линий:-----БК;-V3raL; —о— - СД-,,.25;

—•— — СДцнф; —х— — мдк

(2,78+0,23 отн. ед.) и достоверно (Vkt.=8,38; tcrar.=2,10) отличается от ее значений в экспоненциальной фазе на 18 ч роста (1,60+0,22 отн. ед.). Характерно, что с 18 до 27 ч от начала культивирования достоверно (1факт.=3,65; ^.=2,10) возрастает и удельная гликолитическая активность клеток (с 1,69±0,75 до 9,53+4,80 нгион Н+/млрд кл.-мин-дм3).

Изменения таких параметров, как СД™^, СДцнф, а также скоростей дыхания клеток в экспоненциальной и стационарной фазах развития периодической культуры У. pestis оказались статистически недостоверными и, следовательно, менее информативными для характеристики физиологического состояния бактерий.

Прекращение аэрации и перемешивания культур, а также снижение температуры до (20+2) °С в последующие 3 ч (27-30 ч от начала культивирования) приводят к существенному (почти в 2 раза) возрастанию МДК, причем, как следует из данных, приведенных на рис. 2, уровень стимуляции дыхания глюкозой значительно уступает уровню его последующего угнетения (СДгл.25 < МДК). Последнее свидетельствует о том, что переживание культур, достигших физиологической зрелости, приводит к резкому снижению энерготрат на их поддержание и, как следствие, к увеличению энергизованности бактерий. Через 10-12 ч. переживания культур без перемешивания в захоложенном до температуры 8-10 °С состоянии мы наблюдали последовательное увеличение МДК до максимального значения 9,50 и далее -эффект полного прекращения стимуляции дыхания клеток глюкозой (СДгЛ.25=1,00), которая обратимо восстанавливалась интенсивной аэрацией культур.

I Физиолого-биохимический механизм регистрируемых эффектов ауторегуляции заключается, по-видимому, в том, что в условиях снижения энерготрат (по завершении стационарной фазы развития) переживающая популяция бактерий переключает свой метаболизм на менее энергопродуктивный - 'гликолитический путь, усиливая одновременно метаболический (аденилатный) контроль за дыхательной активностью клеток.

Таким образом, представленные в работе результаты свидетельствуют о том, что исследование ауторегуляции дыхательной активности Y. pestis является информативным способом оценки физибло-гического (функционального) состояния бактерий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Головлев E.JI., Головлева JI.А. //Микробиология. - 2000. - Т. 69, №2. - С. 149-162. - 2. Голубинский Е.П., Рублев Б.Д., Кирдеев В.К. // Вопр. мед. химии. 1971. - Т. 16, № 5. - С. 512-515. - З.Канчух А.А., Голубинский Е.П., Иванова B.C. // Биохимия. - 1973. - Т. 38, № 2. - С. 246-249. - 4. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 5.’Лукьянова Л.Д., Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. - М.: Наука, 1982. - 302 с. - 6.;Лу-коянова М.А., Тихонова Г.В. // Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия. - М.: ВИНИТИ, 1982. - № 17. - С. 33-74. -

7. Мартынов Н.В., Чеботарев Е.В., Лебединский

В. А. и др. // Журн. микробиол. - 1990. - № 12. - С. 19-21. -

8.Минкевич И.Г., Ерошин В.К. // Усп. совр. биол. -1976. - Т. 82, № 1. - С. 103-116.-9. Пименов Е.В., Дармов И.В., Бывалов А. А. и др. //Журн. эволюционной биохим. и физиол. - СПб: Наука, 2004. - Т. 40, №2. - С. 180-186. -10. Руководство по изучению биологического окисления

полярографическим методом / Под ред. Г.М.Франка. - М.: Наука, 1973. - 11. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды / Пер. с англ. Под ред. В.П.Скулачева. - М.: Мир, 1979. - 12. Burstein С., Tiankova L., Kepes А. //Eur. J. Biochem. - 1979. -N94. -С. 387-392. - 13. Chance В., Williams GЯ. II Adv. Enzymol. - 1956. - N 17. - C. 65-134. -14. Plate C.A. // Microbiology. - 1979..- P. 58-61. - 15. Tsu-chiya Т., Rosen B.P. // FEBS Lett. - 1980. - Vol. 120, N 1. -P. 128-130.

E.V.Chebotaryov, E.V.Pimenov, A.A.Byvalov, M.K.Bakulin, A.V.Kozhemyako

Autoregulation of Respiratory Activity in Yersinia pestis

Microbiology Research Institute, RF MD, Kirov; Physiology Institute, Komi Research Center of the Urals Department of RAS, Syktyvkar; Vyatka State University, Kirov

The polarographic techniques were used to substantiate the possibility of in vitro modeling of an autoregulated succession of metabolic conditions in Yersinia pestis bacterial cells (analogous to isolated mitochondria) by adding microconcentrations of glucose into the cultivation medium. The authors offer the index of "metabolic respiratory control" (MRC) which is estimated according to the polarogram to characterize the degree of energy-dependent autoregulation of Y. pestis respiratory function, and is numerically calculated as a ratio of bacteiial breathing rate in the active state (condition 3) to that in the "rest" state (condition 4). Two Y. pestis populations, a developing and a surviving ones, were used to demonstrate the possibility of assessing physiologic conditions of bacteria on the basis of respiratory autoregulation parameters.

Key words: plague pathogen (Yersinia pestis), glucose oxidation, autoregulation of respiratory activity, respiratory control, polarography.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Поступила 30.30.05.

ПАТОГЕНЕЗ, ИММУНОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА

УДК 616:932:576.8

С.А.Бугоркова, Л.ФЛиванова, И.М.Кобкова, Т.В.Бугоркова, Н.П.Коннов, О.С.Кузнецов,

Н.И.Смирнова

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА НА ОРГАНИЗМ БИОМОДЕЛИ

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

: Проведено изучение влияния рекомбинантных штаммов холерного вибриона 01- и 0139-серогрупп на ультраструктуру клеток кишечника биомодели для оценки их безопасности. Отличия, выявленные при исследовании ультрамикроскопических изменений у животных экспериментальных групп, позволили в определенной мере охарактеризовать особенности реакции клеток макроорганизма на рекомбинантный штамм 0139-серо-группы. Применение ультрамикроскопического анализа изменений в клетках подопытных животных при изучении рекомбинантных штаммов, предлагаемых в качестве вакцинных, на этапах авторских исследований в определенной степени способствует решению проблемы оценки значимости тех или иных нарушений, выявляе-; мых при световой микроскопии* и позволяет дифференцировать процессы адаптации и компенсации от патологий в организме биомодели.

! Ключевые слова', рекомбинантные штаммы* холерные вибрионы, электронная микроскопия, адаптационная реакция.

До тех пор пока существует угроза завоза и и экономические потери государствам, не утратит

распространения холеры, и эта инфекция в любое своей актуальности проблема разработки средств ее

время может вызывать неожиданные эпидемиче- специфической профилактики. Перспективными

ские осложнения, нанося значительные социальные препаратами для иммунопрофилактики холеры ос-