CC BY
55
DOI: 10.21055/0370-1069-2020-4-47-52
УДК 616.91:616-07
н.В. Волкова, А.В. Иванова, А.А. Нсаева, о.А. Полежаева, А.В. Зайковская, д.н. Щербаков,
Е.Н. казачинская
получение рекомбинантных антигенов для проведения
серологической диагностики лихорадки марбург
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово, Российская Федерация
цель работы - получение рекомбинантных вирусных антигенов основных иммунодоминантных белков: гли-копротеина (GPAMLD), нуклеопротеина (NP) и матриксного белка (VP40) вируса Марбург, а также исследование их антигенных и иммуногенных свойств. материалы и методы. Для создания рекомбинантных белков GPAMLD, NP и VP40 вируса Марбург использовали синтезированные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти белки, клонированные в составе экспрессионного вектора pET21a. Иммуногенные и антигенные свойства полученных рекомбинантных белков проверяли с использованием ряда биомоделей (мыши, куры и морские свинки). результаты и обсуждение. Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие гены, кодирующие белки GPAMLD, NP, VP40 вируса Марбург, а также штаммы-продуценты Escherichia coli, с выходом очищенных препаратов рекомбинантных белков GPAMLD, NP, VP40 с одного литра культуральной жидкости - 5, 10 и 10 мкг соответственно. Рекомбинантные белки GP, NP и VP40 MARV при иммунизации мышей вызывают синтез антител с высоким титром (рекомбинантные белки NP и VP40 - более 409600, а рекомбинантный белок GPAMLD - 12800). Мышиные антитела, специфичные к рекомбинантным белкам, взаимодействуют в иммуноферментном анализе с антигеном инактивированного MARV. Антитела кур, иммунизированных вирусоподобными частицами, содержащими на поверхности поверхностный гликопротеин вируса Марбург, и антитела морских свинок, иммунизированных экспериментальной ДНК-вакциной, содержащей ген GPAMLD MARV, узнают рекомбинантный белок GPAMLD и вирусный белок в составе инактивированного MARV. Полученные рекомбинантные белки обладают иммуногенностью/антигенностью и могут использоваться для разработки иммуноферментных тест-систем.
Ключевые слова: вирус Марбург (Marburgvirus, MARV), гликопротеин (GP), нуклеопротеин (NP), матриксный белок (VP40), рекомбинантные белки, серологическая диагностика.
Корреспондирующий автор: Волкова Наталья Вячеславовна, e-mail: vector@vector.nsc.ru.
Для цитирования: Волкова Н.В., Иванова А.В., Исаева А.А., Полежаева О.А., Зайковская А.В., Щербаков Д.Н., Казачинская Е.И. Получение рекомбинантных антигенов для проведения серологической диагностики лихорадки Марбург. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 4:47-52. DOI: 10.21055/0370-1069-20204-47-52
Поступила 29.09.20. Отправлена на доработку 09.11.20. Принята к публ. 22.12.20.
N.V. Volkova, A.V. Ivanova, A.A. Isaeva, O.A. Polezhaeva, A.V. Zaykovskaya, D.N. Shcherbakov, E.I. Kazachinskaya
Obtaining Recombinant Antigens for the Development of serological Diagnosis of Marburg Fever
State Scientific Centre of Virology and Biotechnology "Vector", Kol'tsovo, Novosibirsk Region, Russian Federation
Abstract. Aim. Production of recombinant viral antigens of the main immunodominant proteins: glycoprotein (GPAMLD), nucleoprotein (NP) and matrix protein (VP40) of the Marburg virus, as well as the study of their antigenic and immunogenic properties. Materials and methods. To create recombinant proteins GPAMLD, Np and VP40 of the Marburg virus, synthesized nucleotide sequences encoding these proteins cloned into the pET21a expression vector were used. The immunogenic and antigenic properties of the obtained recombinant proteins were tested using a number of biomodels (mice, chickens, and guinea pigs). Results and discussion. Recombinant plasmids containing genes encoding proteins GPAMLD, NP, VP40 of the Marburg virus, as well as Escherichia coli producing strains, with the yield of purified preparations of recombinant proteins GPAMLD, NP, VP40 from one liter of culture fluid - 5, 10, and 10 ^g were obtained, respectively. When mice are immunized, recombinant proteins GP, NP, and VP40 MARV induce the synthesis of high titer antibodies (recombinant proteins NP and VP40 - more than 409600, and recombinant protein GPAMLD -12800). Mouse antibodies specific to recombinant proteins interact in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with the antigen of inactivated MARV. Antibodies of chickens immunized with virus-like particles containing the surface glycoprotein of the Marburg virus and antibodies of guinea pigs immunized with an experimental DNA vaccine containing the GPAMLD MARV gene recognize the recombinant GPAMLD protein and the viral protein in the inactivated MARV The resulting recombinant proteins are immunogenic/antigenic and can be used for the development of enzyme-linked immunosorbent assay systems.
Key words: Marburg virus (MARV), glycoprotein (GP), nucleoprotein (NP), matrix protein (VP40), recombinant proteins, serological diagnostics.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Natalya V. Volkova, e-mail: vector@vector.nsc.ru.
Citation: Volkova N.V., Ivanova A.V., Isaeva A.A., Polezhaeva O.A., Zaykovskaya A.V., Shcherbakov D.N., Kazachinskaya E.I. Obtaining Recombinant Antigens for the Development of Serological Diagnosis of Marburg Fever. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; 4:47-52. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2020-4-47-52
Received 29.09.20. Revised 09.11.20. Accepted 22.12.20.
Volkova N.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5010-9424 Ivanova A.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9102-6756 Isaeva A.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4085-2887 Polezhaeva O.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4256-5064
Вирус Марбург (Marburg Marburgvirus, MARV, род Marburgvirus семейства Filoviridae) является возбудителем высококонтагиозной геморрагической лихорадки, входит в I группу патогенности [1]. Согласно официальным данным, к настоящему времени от болезни, вызванной этим вирусом, погибло более 400 человек [2], в то же время от лихорадки Эбола, вызванной родственником вируса Марбург, в последние пять лет в ходе двух крупнейших вспышек в Западной и Центральной Африке погибло свыше 11 тыс. [3]. Это говорит о большом эпидемическом потенциале филовирусов в целом и MARV в частности и требует разработки надежных и чувствительных методов диагностики. в настоящее время в Российской Федерации нет коммерчески доступных иммуноферментных тест-систем для быстрого выявления специфичных антител и/или антигенов MARV. Комплексная диагностика заболевания включает методы обнаружения генетического материала возбудителя (полимеразная цепная реакция) и методы детекции специфических антител. Для выявления антител используется ряд подходов (иммунохрома-тографический анализ, ИФА, дот-блот), эффективность всех этих подходов определяется качеством антигена. В работе J.T. Paw^ska et al. описывается использование инактивированного MARV в качестве антигена при разработке экспериментальных имму-ноферментных тест-систем, например для выявления специфических антител в сыворотках крови рукокрылых, являющихся естественным резервуаром вируса [4]. Однако получение антигена на основе инактивированного вируса сопряжено с работой по требованиям BSL-4 (Biosafety level 4, уровень биобезопасности 4). Рекомбинантные филовирусные белки в иммуноферментных тест-системах могут быть альтернативой тест-системам на основе белков инактивированного вируса [5].
Цель работы - получение рекомбинантных вирусных антигенов основных иммунодоминантных белков гликопротеина (GP), нуклеопротеина (NP) и матриксного белка (VP40) MARV, исследование их антигенных и иммуногенных свойств.
Zaykovskaya A.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0450-5212 Shcherbakov D.N., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8023-4453 Kazachinskaya E.I., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1856-6147
Материалы и методы
Из базы данных Genbank были взяты нуклео-тидные последовательности, кодирующие основные белки GP (CAA82539.1), NP (CAA82536.1) и VP40 (CAA82538.1) MARV. С помощью программного обеспечения SnapGene 3.2.1 [6] рассчитаны прай-меры для амплификации генов. Синтез олигону-клеотидных праймеров (табл. 1) и генов в составе плазмидного вектора pGH проведен в коммерческой научно-производственной фирме OOO «ДНК-Синтез» (г. Москва).
С помощью набора «БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2*)» («БиолабМикс», Россия) проведена амплификация районов, кодирующих целевые белки. очистку продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 1%-м агарозном геле с последующим выделением при помощи набора Cleanup Standard («Евроген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Для клонирования генов GPAMLD, VP40 и NP MARV в составе экспрессионного вектора рЕТ-21а использованы эндонуклеазы рестрикции XhoI и NheI (НПО «Сибэнзим», Россия). Реакционные смеси готовили в соответствии с активностью ферментов (2-5 ед. акт. на 1 мкг ДНК) и концентрацией ДНК. Условия реакции: температура, состав буферного раствора и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подобраны в соответствии с инструкциями производителя. Продукты гидролиза после очистки лигировали с помощью лига-зы бактериофага Т4. Реакцию лигирования проводили 30 минут при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды рЕТ-21а и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 (НПО «Сибэнзим», Россия) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буферном растворе. Полученными продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки Escherichia coli штамма BL21/DE3(+) с помощью хлористого кальция. Наличие встройки целевых генов подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием по
Таблица 1 / Table 1
Праймеры, использованные для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки GP, VP40 и NP MARV Primers used to amplify nucleotide sequences encoding proteins GP, VP40 and NP MARV
Ген Gene Название олигонуклеотида Oligonucleotide Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence
GP GPM-pET-F 5-'aaaaaacatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtctccctattttagagatagctagtaacaatca-3'
GPM-pET-R 5'-aaaaaagtcgacttagtggtggtggtggtggtggtcggatgtccaccatttacca-3'
VP40 VP40M-pET-F 5'-aaaaaacatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtgccagttccagcaattacaa-3'
VP40M-pET-R 5'-aaaaaactcgagttagtggtggtggtggtggtgaacggcactgagcgttg-3'
NP NPM-pET-F 5'-aaaaaacatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtgatttacatagcttgttagagttgggt-3'
NPM-pET-R 5'-aaaaaactcgagttagtggtggtggtggtggtgcaagttcatagcaacatgtctcct-3'
методу Сэнгера.
Культуру трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду с встроенным геном, культивировали в 100 мл жидкой питательной среды LB (Lysogeny broth) с добавлением натриевой соли ампициллина в рабочей концентрации 20 мкг/мл. Синтез целевых рекомбинантных белков индуцировали 0,5 мМ IPTG (изопропил-ß-D-тиогалактозидом). Отбор клонов E. coli - продуцентов проводили по наличию синтезируемых целевых белков по результатам электрофореза ли-затов клеток в 10%-м полиакриламидном геле с до-децилсульфатом натрия (SDS-PAAG). В качестве отрицательного контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток E. coli штамма BL21/DE3(+), содержащий плазмиду pET-21a. очистку рекомбинантных белков, содержащих по-лигистидиновый блок, проводили аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле, согласно протоколу фирмы-производителя Qiagen (набор Ni-NTA Fast Start). Полученные клеточные лизаты штамма E. coli - продуцента и очищенный реком-бинантный белок анализировали методом белкового электрофореза по методу Лэммли в SDS-PAAG. в качестве контроля использовали полученный аналогичным способом лизат клеток E. coli штамма BL21/DE3(+), содержавший векторную плазмиду pET-21a. Концентрацию рекомбинантных белков измеряли при помощи набора «Bio-Rad Protein Assay Kit» в соответствии с рекомендациями производителя на спектрофотометре при длине волны 495 нм и оценивали путем калибровки по овальбумину в 4 М растворе мочевины (pH 8,0).
Препараты рекомбинантных белков NP, VP40 и GPAMLD MARV после электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) на аппарате Transpor (LKB, Швеция) в течение 1,5 часов при напряжении 80 В в 0,025 М трис-HCl буферном растворе, содержащем 0,192 М глицина (рН 8,3) и 20 % этанола. Места неспецифического связывания насыщали 1%-м раствором казеина при 37 °С в течение 2 часов в ТСБ-Т буферном растворе (состав: Трис-солевой буферный раствор с твином, содержащий 0,15 М NaCl; 0,02 М трис-HCl рН 7,4; 0,05 % Твин-20). Затем мембрану, содержащую ре-комбинантный и вирусные белки, инкубировали со специфическими антителами 4 часа при 20-22 °С в буферном растворе тСБ-т, содержащем 0,5 % казеина. После отмывки в ТСБ-Т мембраны обрабатывали антивидовыми антителами, меченными пероксида-зой хрена (Sigma), - антимышиные и античеловеческие или белок G, меченный пероксидазой для козьих антител, в рабочих разведениях в 0,5%-м растворе казеина в ТСБ-Т в течение 2 часов при 37 °С. Затем мембраны промывали ТСБ-Т буферным раствором и проявляли в растворе хромагена (1 мг/мл 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорида в 50 мМ трис-HCl буферном растворе (pH 7,4), содержащем 0,145 М NaCl, 20 % этанола и 0,03 % перекиси водо-
рода). Реакцию останавливали отмыванием мембран в дистиллированной воде. Специфическое взаимодействие антител с белками проявлялось в виде ярких коричневых полос (рис. 1, В).
Для исследования иммуногенности полученных белков проведена иммунизация мышей линии Balb/с. Внутримышечную иммунизацию мышей массой 15-18 г проводили трехкратно с интервалом 10 дней. Доза рекомбинантных белков VP40, NP, GPAMLD и инактивированного MARV составила 100 мкг на мышь. Забор крови для анализа гуморального иммунного ответа проводили на 35-е сутки.
Для исследования антигенности полученных белков проведены иммунизации морских свинок экспериментальной ДНК-вакциной против MARV по схеме, описанной ранее [7]. А также иммунизировали кур препаратом псевдовирусных частиц VSV-GPAMLDpopp, очищенным при помощи центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Концентрация препарата составила 1,4 107 RLU (relative light units) (показатель количества вирионов в 1 мл - 109). Иммунизацию проводили 4 раза с интервалом в 3 недели [8].
сыворотку крови морских свинок и мышей получали инкубированием препарата крови при 37 °С в течение 1 часа, далее при 4 °С 20 часов, с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 5000 g. Препараты сывороток крови хранили при -20 °с.
Выделение из яиц иммунизированных птиц желточных антител IgY проведено с помощью метода изоэлектрического осаждения [9].
Для проведения непрямого твердофазного им-муноферментного анализа использовали полистироловые планшеты (Nunk). Сенсибилизацию ячеек рекомбинантными белками вируса Марбург (в концентрации 6 мкг/мл) выполняли в объеме 100 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН 8,0) с 4 М мочевины. Сорбцию проводили при 22 °C в течение 18 часов. Дополнительную блокировку сорбционной активности осуществляли 1%-м раствором казеина в ТСБ-Т (трис-солевой буферный раствор с твином, содержащий 0,15 M NaCl; 0,02 M трис-HCl рН 7,4; 0,05 % Твин-20) в течение 30 минут при 37 °С. затем раствор казеина удаляли и инкубировали антиген со специфическими антителами (мышиными, человеческими или козьими) в течение 1 часа при 37 °С или 18 часов при 4 °С в 0,5%-м растворе казеина в ТСБ-Т. После трехкратной отмывки ТСБ-Т в лунки добавляли по 100 мкл пероксидазного конъюгата антивидовых антител (Sigma) - антимышиных, античеловеческих или белок G, меченный пероксидазой для козьих антител, в рабочих разведениях в 0,5%-м растворе казеина в ТСБ-Т. Инкубировали 1 час при 37 °С. Отмывку лунок осуществляли трехкратно с ТСБ-Т. Проявление проводили в течение 30 минут при 37 °С с использованием жидкого субстрата на основе ТМБ (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine). Блокировали реакцию добавле-
нием 100 мкл 1 N HCl на каждую лунку и измеряли ОП субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре Uniscan при длине волны 450 нм.
Результаты и обсуждение
В геноме филовирусов выявлено 7 открытых рамок трансляции, однако не все белки вируса обладают диагностической значимостью. Основными антигенными детерминантами являются белки NP, VP40 и GP [10]. Получение индивидуальных белков филовирусов на основе вирусного материала ограничено условиями биобезопасности, а также значительными материальными затратами. Использование технологии рекомбинантной ДНК позволяет решить многие из этих проблем, однако использование в системе E. coli природной нуклеотидной последовательности вирусных генов для получения экспресси-рующих плазмид зачастую приводит к низкому выходу целевых рекомбинантных белков. Поэтому для повышения выхода белка используют оптимизацию кодонного состава и структуру экспрессируемых генов. Получение рекомбинантных белков VP40, NP и GPAMLD MARv в системе E. coli для диагностических микрочипов описано в работе T. Kamata et al. [11], однако авторы не описали процесс получения рекомбинантных белков, что не позволяет воспроизвести методику и оценить ее эффективность.
в нашей работе для повышения выхода реком-бинантных белков использованы последовательности генов, кодирующих белки MARV, с оптимизированным кодонным составом. Оптимизацию кодонного состава генов проводили с помощью онлайн-сервиса GeneOptimizer [12]. Клонирование целевых генов про-
А В
водили в составе экспрессионного вектора pET21a. Встройку проводили таким образом, чтобы целевой белок был в единой рамке считывания с лидерным пептидом гена 10 бактериофага T7 на N-конце и по-лигистидиновым трактом (6*His) на С-конце.
При создании рекомбинантных аналогов NP и VP40 MARV использованы полные последовательности. Из последовательности GP MARV удалена нуклеотидная последовательность, соответствующая муциноподобному домену (с 290 лейцин по 422 аспа-рагин), наличие которой значительно снижало выход целевого белка (неопубликованные данные). из-за удаления муциноподобного домена, трансмембранного региона, а также отсутствия гликозилирования в прокариотической системе молекулярная масса полученного рекомбинантного белка GP отличается от нативной (рис. 1, А).
Антигенные свойства полученных рекомбинант-ных белков подтверждали методом иммуноблоттин-га (рис. 1, B). После обработки мембраны антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена (Sigma) - античеловеческими (на рис. 1, B - дорожки 1-3) и антимышиными (на рис. 1, B - дорожки 5-7), специфическое взаимодействие рекомби-нантных белков с антителами проявлялось в виде ярко окрашенных бэндов. Молекулярная масса выявленных бэндов совпадает с теоретической молекулярной массой.
Для оценки иммуногенности рекомбинантных белков проводили иммунизацию мышей Balb/с. Как видно из рис. 2, после двух иммунизаций титры антител сывороток крови мышей, иммунизированных рекомбинантными белками NP MARV и VP40 MARV, выявленных при помощи инактивированного
85кДа-85kDa бОкДа. 60kDa
40кДа-40kDa
Взаимодействие с сывороткой переболевшего человека Interaction with serum of a sick person
Взаимодействие с сывороткой иммунизированной мыши Interaction with immunized mouse serum
Рис. 1. A. Электрофореграмма очищенных препаратов рекомбинантных белков GPAMLD, VP40 и NP MARV в 6 %-м ПААГ-SDS. B. Иммуноблоттинг: проверка антигенных свойств полученных рекомбинантных белков:
A: 1 - белковый маркер молекулярной массы (кДа); 2—4 - очищенные рекомбинантные белки NP, VP40 и GPAMLD по 10 мкл/дорожка соответственно; B: 1 и 7 - рекомбинантный аналог GPAMLD MARV; 2 и 6 - рекомбинантный аналог NP MARV; 3 и 5 - рекомбинантный аналог матриксного белка VP40 MARV; 4 - инактивированный препарат MARV
Fig. 1. A. Electropherogram of purified preparations of recombinant proteins GPAMLD, VP40 and NP MARV in 6 % SDS-PAGE. B. Immunoblotting: testing the antigenic properties of the resulting recombinant proteins:
A: 1 - protein molecular weight marker (kDa); 2—4 - purified recombinant proteins NP, VP40 and GPAMLD at 10 ^l/lane respectively; B: 1 and 7 - recombinant analogue of GPAMLD MARV; 2 and 6 - recombinant analogue of NP MARV; 3 and 5 - recombinant analogue of the VP40 MARV matrix protein; 4 - inactivated MARV preparation
МАКУ, достигали значений более 409600. В случае рекомбинантного GPДMLD МАКУ значения были значительно ниже и составили 12800. Основываясь на этих результатах, можно констатировать, что ре-комбинантные белки, полученные в системе Е. еоИ, обладают иммуногенными свойствами.
Оценку реактивности полученных белков проводили с использованием сыворотки крови переболевшего человека, сыворотки крови мышей, иммуни-
Рис. 2. Титрование сывороток крови мышей, иммунизированых реком-бинатными белками MARV. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки крови не-иммунизированных мышей. В качестве положительного контроля использовали сыворотки крови мышей, иммунизированных инактиви-рованным MARV
Fig. 2. Titration ofblood sera from mice immunized with MARV recombinant proteins. Serum of non-immunized mice was used as a negative control. The blood serum of mice immunized with inactivated MARV was used as a positive control
зированных инактивированным препаратом МАКУ, домашних кур, иммунизированных вирусоподобными частицами (ВПЧ), экспонирующими на своей поверхности белок GP МАКУ [8], и морских свинок, иммунизированных экспериментальной ДНК-вакциной, кодирующей ген GP МАКУ без муцинопо-добного домена [7]. Как видно из данных, представленных в табл. 2, мышиные антитела, специфичные к рекомбинантным белкам, взаимодействуют в ИФА с
Таблица 2 / Table 2
Исследование антигенности рекомбинантных белков GP, NP и VP40 MARV методом твердофазного ИФА Investigation of the antigenicity of the recombinant proteins GP, NP and VP40 MARV by solid-phase ELISA
Источник антител Source of antibodies Обратные титры антител Reverse antibody titers
антиген инакт. MARV antigen inact. MARV антиген рек. GP antigen recomb. GP антиген рек. NP antigen recomb. NP антиген рек. VP40 antigen recomb. VP40 антиген ВПЧ (полнораз. GP-MARV) antigen VLP (full size GP-MARV) антиген впч (GP AMLD-MARV) antigen VLP (GP AMLD-MARV)
Мышь** Mouse** <100 <100 <100 <100 <100 <100
Человек* Human* 25600 12800 12800 25600 32000 32000
Человек** Human** <100 <100 <100 <100 <100 <100
Мышь-инакт. Marv Mouse-inact. Marv >1018200 25600 25600 51200 800 800
Курица* Chicken* 51200 32000 - - >1018200 >1018200
Курица** Chicken** <100 <100 <100 <100 <100 <100
Морская свинка* Guinea pig* 3200 12800 - - 12800 12800
Морская свинка** Guinea pig** <100 <100 <100 <100 <100 <100
Примечания: антиген инакт. MARV - сконцентрированный и очищенный из суспензии инфицированной культуры клеток Vero, инакти-вированный кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5 % p-меркаптоэтанола и 1 % додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60 °С в течение 1 часа; рек. - рекомбинантный белок; ВПЧ - вирусоподобные частицы на основе вируса везикулярного стоматита, экспонирующие белок GP MARV [7]; GP AMLD — белок GP без муциноподобного домена; антигены (инакт. MARV и рек. белки) использованы в концентрации 1 мкг/мл (100 нг/лунка), ВПЧ (с в разведении 1/100 из очищенного препарата с физическим титром (общее количество вирусоподобных частиц, определяемых при электронной микроскопии) 106; мышь** - сыворотка крови неиммунных мышей (отриц. контроль); человек* - переболевший в результате лабораторной аварии; человек** — неиммунный к MARV (отриц. контроль); курица* - иммунизирована ВПЧ (GPAMLD-MARV); курица** — неиммунная (отриц. контроль); морская свинка* — смесь сывороток крови морских свинок, иммунизированных экспериментальной ДНК-вакциной (GPAMLD-MARV); «-» — нет специфического взаимодействия.
Notes: antigen inact. MARV - concentrated and purified from a suspension of an infected Vero cell culture, inactivated by boiling for 2 minutes in a solution containing 5 % b-mercaptoethanol and 1 % sodium dodecyl sulfate (SDS) with further heating at 60 °C for 1 hour; rivers. - recombinant protein; HPV - virus-like particles based on the vesicular stomatitis virus, exhibiting the GP MARV protein [7]; GP AMLD-GP protein without mucin-like domain; antigens (inact. MARV and rec. proteins) were used at a concentration of 1 jig/ml (100 ng/well), HPV (with a dilution of 1/100 from a purified preparation with a physical titer (total number of virus-like particles determined by electron microscopy) 106; mouse** - blood serum of non-immune mice (negative control); human* - recovered from a laboratory accident; human** - non-immune to MARV (negative control); chicken* - immunized with HPV (GPAMLD-MARV); chicken** - non-immune (negative control); guinea pig* - a mixture of blood sera from guinea pigs immunized with an experimental DNA vaccine (GPAMLD-MARV); "-" - no specific interaction.
антигеном инактивированного MARV. Антитела кур и морских свинок, иммунизированных ВПЧ, содержащим на своей поверхности гликопротеин MARV, и экспериментальной ДНК-вакциной, кодирующей ген GPAMLD MARV, соответственно, взаимодействуют с рекомбинантным белком GPAMLD и полноразмерным GP в составе инактивированного MARV. Полученные результаты могут свидетельствовать о сохранении антигенных свойств у вирусных белков, полученных при помощи E. coli.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что рекомбинантные белки MARV обладают антигенностью/иммуногенностью и могут быть использованы:
- для тестирования иммунного ответа животных и добровольцев на введение экспериментальных вакцин, содержащих белки NP, VP40 и GP MARV;
- для иммунизации мышей при получении препаратов моноклональных антител, используемых при разработке иммуноферментных тест-систем в формате «сэндвич» для выявления вирусного антигена;
- как положительный контроль в иммунофер-ментных тест-системах по выявлению аналогичных вирусных белков-антигенов MARV.
Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
Авторы выражают благодарность доктору биологических наук А.А. Чепурнову за предоставление материалов.
Список литературы
1. Телесманич Н.Р., Микашинович З.И., Ломаковский Н.С., Лосева Т.Д., Чайка С.О. Биохимия вируса Эбола и молекулярные аспекты биологической защиты. Журнал фундаментальной медицины и биологии. 2015; 3:28-34.
2. Qiu X., Wong G., Audet J., Cutts T., Niu Y., Booth S., Kobinger G.P. Establishment and characterization of a lethal mouse model for the Angola strain of Marburg virus. J. Virol. 2014; 88(21):12703-14. DOI: 10.1128/JVI.01643-14.
3. Vetter P., Fischer W.A. 2nd, Schibler M., Jacobs M., Bausch D.G., Kaiser L. Ebola Virus shedding and transmission: review of current evidence. J. Infect. Dis. 2016; 214(suppl 3):S177-S184. DOI: 10.1093/infdis/jiw254.
4. Paw^ska J.T., Jansen van Vuren P., Kemp A., Storm N., Grobbelaar A.A., Wiley M.R., Palacios G., Markotter W. Marburg virus infection in Egyptian rousette bats, South Africa, 20132014. Emerg. Infect. Dis. 2018; 24(6):1134-7. DOI: 10.3201/ eid2406.172165.
5. Brangel P., Sobarzo A., Parolo C., Miller B.S., Howes P.D., Gelkop S., Lutwama J.J., Dye J.M., McKendry R.A., Lobel L., Stevens M.M. A serological point-of-care test for the detection of IgG antibodies against Ebola virus in human survivors. ACS Nano. 2018; 12?1):63-73. DOI: 10.1021/acsnano.7b07021.
6. Программное обеспечение Snapgene. [Электронный ресурс]. URL: https://www.snapgene.com (дата обращения 17.05.2020).
7. Волкова Н.В., Пьянков О.В., Иванова А.В., Исаева А.А., Зыбкина А.В., Казачинская Е.И., Щербаков Д.Н. Прототип ДНК-вакцины против вируса Марбург. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020; 170(10):487-91. DOI: 10.47056/03659615-2020-170-10-487-491.
8. Полежаева О.А., Щербаков Д.Н. Разработка панели псевдовирусных частиц, экспонирующих гликопротеин вируса Марбург. Международный научно-исследовательский журнал. 2017; 8-2:27-30. DOI: 10.23670/IRJ.2017.62.018.
9. Hodek P., Trefil P., Simunek J., Hudecek J., Stiborova M. Optimized protocol of chicken antibody (IgY) purification providing electrophoretically homogenous preparations. Int. J. Electrochem. Sci. 2013; 8:113-124.
10. Sobarzo A., Perelman E., Groseth A., Dolnik O., Becker S., Lutwama J.J., Dye J.M., Yavelsky V., Lobel L., Marks R.S. Profiling the native specific human humoral immune response to Sudan Ebola virus strain Gulu by chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay. Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19(11):1844-52. DOI: 10.1128/CVI.00363-12.
11. Kamata T., Natesan M., Warfield K., Aman M.J., Ulrich R.G. Determination of specific antibody responses to the six species of Ebola and Marburg viruses by multiplexed protein microar-rays. Clin. Vaccine Immunol. 2014; 21(12):1605-12. DOI: 10.1128/ cVl.00484-14.
12. Thermo Fisher Scientific. [Электронный ресурс]. URL: https://www.thermofisher.com/ru/en/home/life-science/cloning/ gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html (дата обращения 22.06.2020).
References
1. Telesmanich N.R., Mikashinovich Z.I., Lomakovsky N.S., Loseva T.D., Chaika S.O. [Biochemistry of the Ebola virus and molecular aspects of biological defense]. Zhurnal Fundamental'noj Meditsiny i Biologii [Journal ofFundamental Medicine and Biology]. 2015; 3:28-34.
2. Qiu X., Wong G., Audet J., Cutts T., Niu Y., Booth S., Kobinger G.P. Establishment and characterization of a lethal mouse model for the Angola strain of Marburg virus. J. Virol. 2014; 88(21):12703-14. DOI: 10.1128/JVI.01643-14.
3. Vetter P., Fischer W.A. 2nd, Schibler M., Jacobs M., Bausch D.G., Kaiser L. Ebola Virus shedding and transmission: review of current evidence. J. Infect. Dis. 2016; 214(suppl 3):S177-S184. DOI: 10.1093/infdis/jiw254.
4. Paw^ska J.T., Jansen van Vuren P., Kemp A., Storm N., Grobbelaar A.A., Wiley M.R., Palacios G., Markotter W. Marburg virus infection in Egyptian rousette bats, South Africa, 20132014. Emerg. Infect. Dis. 2018; 24(6):1134-7. DOI: 10.3201/ eid2406.172165.
5. Brangel P., Sobarzo A., Parolo C., Miller B.S., Howes P.D., Gelkop S., Lutwama J.J., Dye J.M., McKendry R.A., Lobel L., Stevens M.M. A serological point-of-care test for the detection of IgG antibodies against Ebola virus in human survivors. ACS Nano. 2018; 12(1):63-73. DOI: 10.1021/acsnano.7b07021.
6. Snapgene software. (Cited 17 May 2020). [Internet]. Available from: https://www.snapgene.com/.
7. Volkova N.V., Pyan kov O.V., Ivanova A.V., Isaeva A.A., Zybkina A.V., Kazachinskaya E.I., Shcherbakov D.N. [A prototype of a DNA vaccine against Marburg virus]. Bulleten' Eksperimental'noj Biologii iMeditsiny [Bulletin ofExperimentalBiology and Medicine]. 2020; 170(10):487-91. DOI: 10.47056/0365-9615-2020-170-10487-491.
8. Polezhaeva O.A., Shcherbakov D.N. [Development of a panel of pseudovirus particles exhibiting the glycoprotein of the Marburg virus]. Mezhdunarodny Nauchno-Issledovatel'sky Zhurnal [InternationalResearch Journal]. 2017; 8-2:27-30. DOI: 10.23670/ IRJ.2017.62.018.
9. Hodek P., Trefil P., Simunek J., Hudecek J., Stiborova M. Optimized protocol of chicken antibody (IgY) purification providing electrophoretically homogenous preparations. Int. J. Electrochem. Sci. 2013; 8:113-124.
10. Sobarzo A., Perelman E., Groseth A., Dolnik O., Becker S., Lutwama J.J., Dye J.M., Yavelsky V., Lobel L., Marks R.S. Profiling the native specific human humoral immune response to Sudan Ebola virus strain Gulu by chemiluminescence enzyme-linked immuno-sorbent assay. Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19(11):1844-52. DOI: 10.1128/CVI.00363-12.
11. Kamata T., Natesan M., Warfield K., Aman M.J., Ulrich R.G. Determination of specific antibody responses to the six species of Ebola and Marburg viruses by multiplexed protein microar-rays. Clin. Vaccine Immunol. 2014; 21(12):1605-12. DOI: 10.1128/ CVI.00484-14.
12. Thermo Fisher Scientific. (Cited 22 June 2020). [Internet]. Available from: https://www.thermofisher.com/ru/en/home/life-science/ cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html/.
Authors:
Volkova N.V., Ivanova A.V., Isaeva A.A., Polezhaeva O.A., Zaykovskaya A.V., Shcherbakov D.N., Kazachinskaya E.I. State Scientific Centre of Virology and Biotechnology "Vector". Kol'tsovo, Novosibirsk Region, 630559, Russian Federation. E-mail: vector@vector.nsc.ru.
Об авторах:
Волкова Н.В., Иванова А.В., Исаева А.А., Полежаева О.А., Зайковская А.В., Щербаков Д.Н., Казачинская Е.И. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор». Российская Федерация, 630559, Новосибирская обл., п. Кольцово. E-mail: vector@vector.nsc.ru.
