CC BY
58
УДК 661.12.01/.09
И. С. Макарова, М. Г. Гордиенко*
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 * e-mail: mariya.gordienko@gmail.com
ПОЛУЧЕНИЕ ПОРИСТЫХ МИКРОСФЕР НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРА ПОЛИМОЛОЧНОЙ И ПОЛИГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТ
Аннотация
Были проведены исследования возможности формирования пористых сферических частиц из сополимера полимолочной и полигликолевой кислот методом двойного эмульгирования с последующим испарением органического растворителя. Условия наработки и последующей обработки образцов, тип порообразователя, использованные составы были выбраны на основании анализа литературных источников за последние года. По результатам исследований сделаны выводы о влиянии скорости вращения ротора гомогенизатора при формировании первичной эмульсии типа «вода-в-масле» на формирование системы открытых пор. Даны выводы о снижении скорости вращения лопастной мешалки при формировании вторичной эмульсии с целью получения частиц большего размера.
Ключевые слова: сополимер полимолочной и полигликолевой кислот, пористые микросферы для регенеративной медицины, двойная эмульсия.
Получение микросфер из биодеградируемых природных и синтетических полимеров является актуальной задачей для химико-фармацевтической отрасли и регенеративной медицины. Наибольший интерес при получении микрочастиц для применения в области регенеративной медицины представляют такие полимеры как коллаген, фибрин, хитозан, желатин, полимолочная, полигликолевая и гиалоурановая кислоты и др. [1].
В работе [2] описана методика получения микрочастиц из желатина и альгината. Сферической формы частиц авторы работы добивались в результате формирования обратной эмульсии «вода-в-масле». Осаждение альгината на поверхности желатиновых капель (образование
полиэлектролитного комплекса) происходило при снижении рН за счет введения в эмульсию уксусной кислоты. Снижение температуры и введение гепарина в эмульсию вызывало отвердевание сформированных капель, как за свет физической сшивки полимера, так и в результате образования химических связей. Авторами работы были сделаны выводы о влиянии таких факторов, как концентрация ПАВ, соотношение полимеров к сшивающему агенту, рН среды на стадии комплексообразования и соотношение полимеров на размер формируемых частиц и их пористость.
В работе [3] для получения биоразлагаемых микросфер был использован поликапролактон. Для формирования микросфер использовали метод двойного эмульгирования (эмульсия типа «вода-в-масле-в-воде») с последующим испарением органического растворителя для отвердевания капель. В данной работе на первой стадии получали первичную эмульсию водного раствора поливинилового спирта (ПВП) в органической фазе (раствор поликапролактона в дихлористом метилене). Капли раствора ПВП в данном случае выполняли роль порообразователя. На второй стадии первичную эмульсию смешивали с водным раствором ПВП при условиях гомогенизации, обеспечивающих
формирование капель первичной эмульсии в диапазоне от 20 до 150 мкм. Двойную эмульсию оставляли при непрерывном перемешивании на сутки для испарения 0^02, в результате которого происходило отвердевание капель эмульсии. Для модификации поверхности полученные микросферы погружали в фосфатный буфер, содержащий липазу. На этой стадии происходило «вскрытие» пористой структуры. Авторы также исследовали возможность прикрепления и пролиферации клеток МО-63 на поверхности полученных микросфер.
В работе [4] авторы приводят методику получения микросфер из сополимера полимолочной и полигликолевой кислот (ПМГК) с внедренными микросферами хитозана. Микросферы хитозана получали предварительно методом ионной сшивки цепей хитозана в эмульсии. Частицы сополимера ПМГК получали, как и в работе [3] методом испарения органического растворителя из капель двойной эмульсии. Отличием является то, что в качестве порообразователя применялся
бикарбонатный буфер, а в качестве эмульгатора -кроме ПВС использовался полиэтиленгликоль (ПЭГ). В данной работе выдерживание готовых микросфер в буфере для «вскрытия» пористой структуры не проводилось. Исследования показали возможность прикрепления и роста клеточной культуры МО-63 на поверхности полученных микросфер. Было экспериментально показано, что введение в состав микрочастиц хитозана способствует данным процессам.
В работе [5] авторы исследовали возможность прикрепления и роста другой клеточной культуры -остеобластов мышей - на микросферах, полученных из сополимера ПМГК, содержащих частицы гидроксиапатита. Частицы получали так же удалением растворителя, только из одинарной эмульсии. Гидроксиапатит вводился в органическую фазу на стадии эмульгирования в пропорции 50 % по отношению к массе сополимера. Микросферы
В данной работе были проведены исследования возможности получения пористых микросфер ПМГК методом двойной эмульсии с последующим испарением органического растворителя. Для приготовления 20 % мас. раствора навеску полимера массой 1 г растворяли в 5 мл дихлорметана (ДХМ). В качестве порообразователя использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ, рН=7.4). Для получения первичной эмульсии к раствору ПМК в ДХМ добавляли 250 мл ФСБ и диспергировали полученную смесь при помощи гомогенизатора типа «ротор-статор» IKA T25 digital ULTRA-TURRAX. Для наработки 4-х партий образцов диспергирование проводили при 6000/9000/12000/15000 об/мин в течение 2 минут. Первичную эмульсию «вода-в-масле» (в/м) далее диспергировали в 0,3 % мас. поливинилового спирта при 1300 об/мин в течение 30 с, после чего полученную эмульсию «вода-в-масле-в-воде» (в/м/в) оставляли под тягой при непрерывном перемешивании на 12 часов для полного испарения ДХМ и отвердевания капель первичной эмульсии, содержащих ПМГК. Отвердевшие микросферы затем отделяли центрифугированием и промывали несколько раз дистиллированной водой. На рисунке 1 в качестве примера приведены фотографии образцов, полученные сканирующей электронной
микроскопией в ЦКП РХТУ.
обрабатывали спиртоводным раствором для частичного «вскрытия» включений гидроксиапатита. Исследования показали возможность прикрепления и пролиферации клеточной культуры на полученных микросферах.
В работе [6] авторы исследовали возможность получения пористых микросфер из сополимера ПМГК методом испарения растворителя из капель двойной эмульсии и возможности формирования из полученных пористых сферических частиц высокопористых подложек, путём их сцепления при тепловой обработке. Методика получения частиц и «вскрытие» их пористой структуры аналогично методике, описанной в работе [3]. В качестве порообразователя использовался фосфатный буфер. Обработку проводили в спиртоводном растворе КаОИ. Для формирования высокопористого каркаса микросферы помещали в форму и сутки выдерживали при 37 °С, что соответствует температуре человеческого тела. Исследователями была показана возможность прикрепления и роста клеток на полученных каркасах.
Рассмотренные работы позволяют сделать вывод, что эмульсионный метод является простым и позволяет получать частицы правильной сферической формы определенного размера. Для получения пористой структуры необходимо вводить в состав так называемые порообразователи, которые фиксируют пространство в полимерной матрице до её перехода в твёрдое или сшитое состояние.
Рис. 1. Изображения микрочастиц (до обработки), полученных при скорости вращения ротора 9 000 об/мин,
снятые при увеличениях 200х (а) и 2 500х (б)
Приведённые изображения показывают, что метод двойного эмульгирования позволяет получать сферические частицы, которые, однако, не имеют выраженной пористой структуры. При большем увеличении (рис. 1б) можно увидеть затемненные участки на поверхности микросфер - это места близкого расположения к поверхности капель фосфатного буфера (порообразователь).
Для «вскрытия» пор полученные частицы были обработаны раствором гидроксида натрия КаОИ в этаноле (30 % мас. 0,25М КаОИ : 70 % мас. чистого этанола). Как отмечается в работе [6] этанол в смеси с водой частично растворяет ПМГК, а КаОИ повышает смачиваемость поверхности за счет взаимодействия с карбоксильными группами полимера. Обработку частиц проводили следующим образом. Частицы ПМГК суспендировали в 10 мл раствора КаОИ-
этанол и выдерживали при постоянном встряхивании в течение 2 минут. Далее частицы отделяли на фильтре и промывали дистиллированной водой. Операцию повторяли 4 раза, отделяя каждый раз от жидкости центрифугированием при 9000 об/мин в течение 5 минут. Полученные образцы высушивали лиофильно.
На рисунке 2 приведены примеры поверхности полученных частиц после обработки (при тех же условиях формирования первичной эмульсии, что и частицы, изображенные на рисунке 1). Наглядно видно, что после обработки частицы стали пористыми. Поры по форме представляют собой отдельные или соединенные усеченные сферические пустоты - места включений капель первичной эмульсии.
Анализ изображений, полученных четырех образцов позволил сделать вывод, что более высокие скорости вращения ротора (12 000 и 15 000 об/мин) при формировании первичной эмульсии, обеспечивают формирование системы открытых, соединенных между собой пор, в то время, как при более низких скоростях вращения ротора (6 000 и 9 000 об/мин) поры располагаются относительно
далеко друг от друга и связаны между собой лишь частично. Кроме того, было отмечено, что относительно высокие скорости вращения лопастной мешалки при формировании вторичной эмульсии (1 300 об/мин), выбранные на основании методики, изложенной в работе [6], приводят к образованию частиц, размер которых не превышает 80 мкм.
Рис. 2. Изображение поверхности микросфер после их обработки, снятые при увеличениях 10 000х (а) и 30 000х (б)
Использования таких пористых частиц в качестве либо формировать объемные каркасы из полученных
подложек для культур клеток не представляется частиц, либо снижать скорость вращения лопастной
возможным, поскольку частицы соизмеримы по мешалки при формировании вторичной эмульсии с
размерам с клетками. Следовательно, необходимо целью увеличения размера формируемых капель.
Макарова Ирина Сергеевна, студентка факультета Информационных технологий и управления РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Гордиенко Мария Геннадьевна, к.т.н., в.н.с. НИЧ РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Литература
1. Дорожная карта регенеративной медицины 1.2 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.scienceagainstaging.org/Books/Poster-REG-MED_new_RUS_5.pdf (дата обращения: 06.05.15).
2. Devi N. Smart porous microparticles based on gelatin/sodium alginate polyelectrolyte complex / N. Devi, D. K. Kakati // Journal of Food Engineering. - 2013. № 117. - P. 193-204.
3. Biodegradation-induced surface change of polymer microspheres and its influence on cell growth / Zhang Y. [et al.]. Polymer Degradation and Stability. - 2010. № 95. - P. 1356-1364.
4. Development and characterization of GRGDSPC-modified poly(lactide-co-glycolide acid) porous microspheres incorporated with protein-loaded chitosan microspheres for bone tissue engineering / Tao C. [et al.]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2014. № 112. - P. 439-446.
5. An injectable scaffold: rhBMP-2-loaded poly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite microspheres / Shen H. [et al.]. Acta Biomaterialia. - 2010. № 6. - P. 455-465.
6. Injectable and porous PLGA microspheres that form highly porous scaffolds at body temperature / Qutachi O. [et al.]. Acta Biomaterialia. - 2014. № 10. - P. 5090-5098.
Makarova Irina Sergeevna, Gordienko Mariia Gennadievna*
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: mariya.gordienko@gmail.com
PRODUCTION OF POROUS MICROSPHERES BASED ON COPOLYMER OF POLY LACTIC AND POLYGLYCOLIC ACID
Abstract
The investigation concerning of preparation of the porous spherical particles of co-polymer of polylactic and polyglycolic acids by a double emulsion method followed by evaporation of the organic solvent were carried out. The process conditions, type of pore-agent, used compositions were selected based on the analysis of the literature in recent years. The influence of rotor speed of homogenizer during the preparation of the primary emulsion ("water-in-oil") on the formation of a open pores system were estimated. It was proposed to reduce a speed of paddle during secondary emulsion forming to obtain larger particles.
Key words: co-polymer of polylactic and polyglycolic acids, porous spherical particles, double emulsion.
