CC BY
219
УДК 678.01+544.03,23
Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2013. Вып. 2
В. А. Коржиков, Е. Н. Литвинчук, Н. Н. Шевченко, Т. Б. Тенникова
ПОЛИМЕРНЫЕ «КОНТЕЙНЕРЫ» ДЛЯ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ НА ОСНОВЕ ПОЛИ(МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ) И ПОЛИ(МОЛОЧНОЙ-СО-ГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ): СИНТЕЗ ПОЛИМЕРОВ И ПОЛУЧЕНИЕ ЧАСТИЦ*
Введение. В настоящее время получение «контейнеров» на основе биодеградируе-мых полимерных частиц для инкапсулирования лекарственных веществ (ЛВ) является одной из перспективных областей, привлекающей большое внимание исследователей во всем мире [1], так как пролонгированное высвобождение лекарственного вещества в организме пациента позволяет снизить отрицательное влияние побочных явлений с сохранением желаемого терапевтического эффекта, что особенно важно при использовании ряда сильнодействующих препаратов, таких как стероиды, гормоны, противораковые препараты, антибиотики [2]. Процесс выделения препарата в органе/ткани мишени обеспечивается диффузией вещества из полимерной оболочки и биодеградацией полимерной капсулы [3]. При этом адресная доставка «контейнера» в больной орган или ткань должна достигаться за счёт наличия на его поверхности специальных биологических молекул, называемых «векторами».
В качестве основы для создания подобных «контейнеров» перспективно использование поли(молочной кислоты) (ПМК) и поли(молочной-со-гликолевой кислоты) (ПМГК), которые широко используются в медицине и биотехнологии, являясь биоде-градируемыми, нетоксичными и биосовместимыми полимерами [4, 5]. Конечными продуктами гидролитической деградации этих полимеров in vivo или in vitro являются молочная и гликолевая кислоты — естественные метаболиты, образующиеся в человеческом организме [5]. Использование сополимеров молочной кислоты с различными сомономерами, например, с гликолевой кислотой (ГК), позволяет контролировать скорость биодеградации материалов [4, 5-7].
В представленной работе нами были синтезированы и исследованы ПМК и ПМГК. Для получения полимерных «контейнеров» в форме частиц на основе полученных полимеров использован метод одинарной эмульсии. Изучено влияние параметров данного процесса на размер частиц. Кроме того, показана возможность инкапсулирования модельного гидрофобного ЛВ — антрацена, и введения в состав поверхности частиц биомолекул различного размера.
Результаты и обсуждение.
Синтез ПМК и ПМГК. Синтез полимеров на основе молочной и гликолевой кислот осуществляли методом полимеризации с раскрытием цикла лактидов данных кислот в присутствии октоата олова в массе мономера. Реакции проводили в пробирках
Виктор Александрович Коржиков — кандидат химических наук, Институт высокомолекулярных соединений РАН; e-mail: v_korzhikov@mail.ru
Евгения Николаевна Литвинчук — аспирантка, Институт высокомолекулярных соединений РАН.
Наталья Николаевна Шевченко — кандидат химических наук, Институт высокомолекулярных соединений РАН.
Татьяна Борисовна Тенникова — доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет.
* Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации (МК-5826) и РФФИ (№ 11-03-00829-а).
© В. А. Коржиков, Е. Н. Литвинчук, Н.Н.Шевченко, Т. Б. Тенникова, 2013
Шленка с использованием вакуумной линии. Данные, полученные при гомополимери-зации молочной кислоты, представлены в табл. 1. Видно, что с уменьшением концентрации октоата олова увеличиваются выход, характеристическая вязкость и молекулярная масса полученных полимеров, а также время реакции (определялось как время затвердевания смеси). Можно сказать, что чем меньше количество октоата олова в реакционной смеси, тем меньше образуется макромолекулярных цепей, обладающих более высокой молекулярной массой. При этом исчерпание мономера занимает большее время.
Таблица 1
Полимеризация Ь-лактида в массе и характеристики ПМК
№ образца Условия реакции Характеристики полимера
[М]/[8П(0^)2] мол. соотн. Т, °с Время, ч Выход, % И, дл/г М\¥ х 10~л (ГПХ)* М\¥/Мп*
1 100 120 2,5 37 0,05 2,1 1,5
2 550 120 2,5 45 0,11 7,0 1,8
3 1000 120 3,0 59 0,19 13,0 1,9
4 10 000 120 6,5 88 0,68 58,0 2,1
5 10 000 140 6,0 92 1,30 78,0 1,9
* Здесь и далее приведены данные для пика на кривой элюирования, соответствующие наиболее высоким молекулярным массам.
Увеличение температуры на 20 С (см. образцы № 4 и 5) приводит к увеличению характеристической вязкости и молекулярной массы ПМК. Так, использование [М]/|Вп(Ос1)2] = 10 000 при температуре 140 С позволило получить ПМК с максимальной молекулярной массой. Тем не менее, из литературы известно [6], что для образования частиц нет необходимости использования полимеров с высокой молекулярной массой.
Результаты исследования сополимеризации L-лактида с гликолидом показали, что состав мономерной смеси практически полностью воспроизводится составом сополимера (табл. 2). При этом полимеры образуются с высоким выходом. Это свидетельствует о схожей реакционной способности сомономеров. Тем не менее, полученные результаты указывают на более высокую реакционную способность гликолида.
Таблица 2
Сополимеризация Ь-лактида и гликолида в массе и характеристики ПМГК
Условия реакции Характеристики полимера
№ образца [М]/[8п(Ос1;)2] мол. соотн. Мономеры [ЛД]/[ГД], мол. % Г, °С Выход, % Полимеры [МК]/[ГК], мол. % и, дл/г М\¥ (ГПХ) М\¥/Мп
6 2 000 60 : 40 130 97 55 : 45 0,27 12 000 1,8
7 1000 80 : 20 120 92 70 : 30 0,13 6100 1,8
8 1000 95 : 5 140 94 90 : 10 0,10 5 400 1,9
Состав сополимеров определяли методом 13С ЯМР DEPT135 (рис. 1). Интегрирование сигналов метильных и метиленовых протонов позволило произвести количественную оценку содержания звеньев, соответственно МК и ГК.
Исследование ПМК и ПМГК методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) показало, что для высокомолекулярных образцов (рис. 2, а и в) характерно наличие двух пиков на кривой элюирования и, соответственно, бимодального распределения.
CH
CH
100
80
60
м.д.
40
CH
20
Рис. 1. 13C ЯМР DEPT135 спектр образца сополимера молочной и гликолевой кислот
0
1250 -
750-
500-
25001
2000-
g 1500 я
g 1000
и
¿3 500
25 30 35
Время элюции (мин)
40
3000
И 2500 S
n 1JUU
U
g 1000
н я
S 500-1
24 26 28 30 32 34 36 38 40 Время элюции (мин)
25 30 35
Время элюции (мин)
40
Рис. 2. Кривые элюирования образцов: а — для образца № 5; б — № 1 (ПМК); в — № 6 (ПМГК):
условия элюирования 0,3 мл/мин; петля 10 мкл
ТГФ,
н 1000
£ 2000
0
s
Это согласуется с литературными данными [8], свидетельствующими об образовании наряду с длинными линейными цепями циклических макромолекул. В случае образцов с низкой ММ характерно унимодальное распределение (рис. 2, б), что можно объяснить образованием лишь олигомерной фракции циклических макромолекул, которые не осаждаются в метанол при выделении полимера.
Получение частиц на основе ПМК и ПМГК. Получение сферических частиц на основе синтезированных полимеров (образцы № 4 и 7) проводили с использованием метода одинарной эмульсии (рис. 3). В основе метода лежит эмульгирование раствора полимера в органическом растворителе (масляная фаза) и в водном растворе ПАВ (водная фаза) с последующим испарением масляной фазы и образованием суспензии сферических частиц.
Эмульгирование
(диспергатор, 20 тыс. об/мин, 2 мин) (соотношение м/в = 1/10, 1/15)
Раствор полимера в CHQ3 (масло = м)
• V •• ••
Формирование частиц
* в Л
Вода + стабилизатор (водная фаза = в)
Испарение CHQ3 8 ч при Т
Рис. 3. Схема получения частиц методом одинарной эмульсии «масло—вода»
Было изучено влияние на размер частиц таких параметров, как природа и концентрация стабилизатора, концентрация полимера, а также соотношение водной и масляной фаз. При выборе оптимальных условий получения полимерных частиц конечный размер, форму получаемых образцов и распределение частиц по размеру оценивали с помощью оптической микроскопии.
Влияние концентрации и природы стабилизатора на размер частиц. Стабилизатор играет важнейшую роль в механизме формирования частиц, определяя их конечный размер. Его основная функция заключается в стабилизации капель эмульсии, тем самым препятствуя их коалесценции.
Изучение влияния природы стабилизатора на свойства частиц (рис. 4) показало перспективность использования натрия додецилсульфата (НДС) и поливинилового спирта (ПВС). В случае НДС высокая стабильность обеспечивается за счёт отрицательно заряженных групп на поверхности образующихся полимерных частиц, что препятствует их агрегации и слипанию за счёт электростатических сил отталкивания. В случае же ПВС стабилизация частиц обеспечивается благодаря увеличению вязкости дисперсионной среды, что препятствует коалесценции капель эмульсии [9].
Уменьшению размера частиц способствует увеличение концентрации стабилизатора в системе, а также увеличение скорости и времени диспергирования. Зависимость размера частиц от концентрации стабилизатора в дисперсионной среде показана на рис. 5.
В случае натрия додецилсульфата наиболее оптимальной является концентрация 0,4 мас. % в водной фазе, дальнейшее увеличение концентрации не приводит к значительному уменьшению размера частиц. Для ПВС наиболее оптимальной оказалась концентрация 5,0 мас. %, дальнейшее увеличение концентрации ПВС в водной фазе оказалось невозможным в силу его ограниченной растворимости и высокой вязкости получаемых растворов.
Влияние концентрации полимера и соотношения масло:вода на размер частиц. На рис. 6, а показана зависимость влияния концентрации полимера на размер получаемых полимерных частиц. Увеличение концентрации в системе приводит к получению частиц большего размера. Это объясняется тем, что с увеличением концентрации полимера в органической фазе возрастает вязкостное сопротивление, которое препятствует уменьшению размера капель путём высокоскоростного перемешивания [9].
Подбор объёмного соотношения дисперсной фазы и дисперсионной среды (рис. 6, б) зачастую носит эмпирический характер для каждого типа стабилизатора. Общие
80 хо 60
т 40 20 0
^ ^
х ^
# о? ч§
Рис. 4. Влияние природы стабилизатора на размер частиц: данные о размере частиц получены методом оптической микроскопии
3 -2,5 -
^ 1,5 -1 -0,5 -0
0,2 % НДС 0,4 % НДС 0,8 % НДС 1 % пВС 2 % пВС 5 % пВС
Рис. 5. Влияние концентрации натрия додецилсульфата и поливинилового спирта в водной фазе на размер частиц на основе ПМГК: данные о размере частиц получены методом оптической микроскопии
принципы сводятся к тому, чтобы испарение органического растворителя происходило не слишком быстро, но и не слишком медленно во избежание агрегации капель эмульсии. В нашем случае наилучший результат наблюдался для соотношения органической и водной фаз, равного 1 : 10.
Исследование полученных частиц методами сканирующей электронной микроскопии и динамического светорассеяния. Микрофотографии, полученные методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), демонстрируют наличие частиц сферической формы диаметром от 200 нм до 1,5 мкм (рис. 7). Наблюдается также выраженная склонность частиц к агрегации.
2 % ПМК
1 % ПМК
0,5 % ПМК
1:15
1:10
1:5
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Б, мкм
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Б, мкм
Рис. 6. Влияние концентрации полимера при соотношении масло : вода = 1 : 10 (а) и соотношения органической и водной фаз при концентрации ПМК 0,5 мас. % (б)
на размер полимерных частиц: данные получены при 0,4 мас. % содержании НДС в водной фазе
Рис. 7. СЭМ микрофотографии частиц на основе ПМК (а) и ПМГК (б), полученных в оптимальных условиях: 0,4 мас. % НДС, концентрация полимера в органической фазе 0,5 мас. %
б
а
Исследование надосадочного раствора после центрифугирования при 500 об/мин методом динамического рассеяния света (рис. 8, а) показало наличие частиц со средним диаметром 800 нм, обладающих достаточно узким распределением по размерам. Изучение частиц, полученных при большем содержании НДС и соотношении масло : вода = 1 : 30, также показало наличие частиц диаметром около 1 мкм. Тем не менее, после обработки ультразвуком был зафиксирован динамический процесс образования и разрушения агрегатов. Зарегистрированный диаметр частиц равен 132 нм.
Результат находится в согласии с данными, полученными методом крио-СЭМ (рис. 9). Видно, что размер капель эмульсии, определяющий размер частиц, равен примерно 100 нм. Таким образом, создаваемые частицы, при дальнейшей оптимизации процесса получения, могут быть использованы не только для подкожного, но и для внутривенного введения, так как их диаметр меньше диаметра сосудов кровеносной системы.
Инкапсулирование антрацена и модификация поверхности частиц. Добавление в раствор полимера (см. рис. 3) модельного гидрофобного вещества — антрацена, привело к его инкапсулированию внутрь получаемых частиц. Эффективность
30
I 20
1С °10
40
30
20
10
0,1
d, нм б
10000
1
10
d, нм
100
1000
10000
Рис. 8. Распределение частиц по размерам, определённое методом динамического рассеяния света при 0,4 мас. % НДС, концентрации полимера в органической фазе 0,5 мас. %, соотношении масло : вода = 1 : 10 — а; при 1,5 мас. % НДС, концентрации полимера в органической фазе 0,5 мас. %, соотношении масло : вода = 1 : 30 — б: редиспергирование и обработка в ультразвуковой ванне (20 мин)
а
Рис. 9. Микрофотографии эмульсии, полученные методом крио-СЭМ: ПМК, масло : вода = 1 : 30, 1,5 мас. % НДС, концентрация полимера в органической фазе 0,5 мас. %
инкапсулирования составила 70-90 %. Количество антрацена в составе частиц было определено методом спектрофотометрии и равно 0,03-0,10 мг на 1 мг полимерных частиц. Имея в виду нерастворимость антрацена в воде, можно объяснить его потерю солюбилизацией в мицеллах НДС.
Логично предположить, что использование ПВС в качестве стабилизатора приводит к его включению в состав поверхности получаемых частиц. Это, в свою очередь, должно приводить к наличию гидроксильных групп, которые можно использовать для связывания биологических молекул-векторов, направляющих «контейнеры» именно в больной орган или ткань.
С целью проверки данного предположения частицы были обработаны 1,1-карбо-нилдиимидазолом (КДИ) и добавлены к раствору бычьего сывороточного альбумина (БСА) в боратном буферном растворе рН = 10,0. Далее частицы были отделены центрифугированием и промыты фосфатно-солевым буферным раствором pH = 7,0. Методом спектрофотометрии (метод Лоури—Фолина) [10] была зафиксирована убыль концентрации белка с 1,0 до 0,7 мг/мл (суммарно в надосадочной жидкости и промывочных растворах). Данный факт свидетельствует о принципиальной возможности модификации поверхности частиц биологически активными молекулами, содержащими аминогруппы.
Выводы. Методом полимеризации с раскрытием цикла синтезированы образцы ПМК и ПМГК с различными составом и молекулярно-массовыми характеристиками. На основе синтезированных полимеров получены сферические частицы с размерами от нескольких микрометров до нескольких сотен нанометров. Показана возможность инкапсулирования гидрофобных веществ внутрь полимерной матрицы создаваемых «контейнеров», а также ковалентной иммобилизации на их поверхности аминосодержащих биологически активных молекул.
Экспериментальная часть. Все реактивы и растворители были приобретены в Sigma-Aldrich Merck и использованы без дополнительной очистки. Для создания вакуума, применяли вакуумный пластинчато-роторный насос 2В-1,1 (Гидромех). Перемешивание и нагрев реакционной смеси осуществляли при помощи магнитной мешалки с нагревом MSH-basic (IKA®). Для концентрирования растворов использовали ротационный испаритель ИР-1 (ОАО «Химлаборприбор», Россия). Характеристическую вязкость определяли с использованием капиллярного вискозиметра Оствальда ВПЖ-4 (ЗАО «Нева-Реактив», Россия) с диаметром капилляра 0,37 мм. Для анализа молекулярно-массового распределения полимеров использовали жидкостный хроматограф фирмы Shimadzu (Япония). Для получения ЯМР спектров — спектрометр AVANCE-400 (Bruker, Германия). Для эмульгирования применяли диспергатор T18 basic (IKA, Германия). Для изучения размера и морфологии получаемых частиц использовали электронный микроскоп ZeissSupra 55VP, в том числе с использованием криоприставки, а также оптический микроскоп NIKON Eclipse E2000 с приставкой для получения фотографий DS-Fi1. Полученные изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения Image J. Для определения диаметра частиц методом светорассеяния использовали ZetasizerNano-ZS (Malvern, Великобритания). Количество инкапсулированного антрацена и количество связанного белка определяли на спектрофотометре Cary 50 (Varian, США).
Синтез полимеров. В вакуумированную пробирку Шленка шприцем в токе аргона последовательно вводили: растворы мономера(ов) и октоата олова в толуоле. Пробирку вакуумировали и помещали в глицериновую баню, предварительно нагретую до необходимой температуры. По окончании реакции пробирку остужали, продукт растворяли в хлороформе, концентрировали и высаживали в холодный метанол.
Получение полимерных частиц (см. рис. 3). 60 мг соответствующего полимера растворяли в 2 мл хлороформа (масляная фаза). Отдельно готовили водный раствор стабилизатора (водная фаза). С помощью диспергатора проводили эмульгирование водной и органической фазы со скоростью 24 000 об/мин в течение 2 мин. Испарение органического растворителя осуществляли путём перемешивания полученной эмульсии на магнитной мешалке со скоростью 2 500 об/мин при комнатной температуре в течение 12 ч.
Литература
1. Lassalle V., Ferreira M. L. PLA nano- and microparticles for drug delivery: an overview of the methods of preparation // Macromol. Biosci. 2007. N 7. P. 767-783.
2. Praetorius N. P., Mandal T. K. Engineered nanoparticles in cancer therapy // Recent patents on drug delivery & formulations. 2007. N 1. P. 37-51.
3. KumariA., Yadav S. K., Yadav S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems // Colloids and surfaces (B). 2010. N 75. P. 1-18.
4. Hakkarainen M. Aliphatic polyesters: abiotic and biotic degradation and degradation products // Advances in polymer science. 2002. N 157. P. 113-134.
5. Makadia H. K., SiegelS. J. Poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) as biodegradable controlled drug delivery carrier // Polymers. 2011. N 3. P. 1377-1397.
6. JainR. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices // J. Biomaterials. 2000. N 21. P. 2475-2490.
7. Park J. H., YeM., Park K. Biodegradable polymers for microencapsulation of drugs //J. Molecules. 2005. N 10. P. 146-161.
8. PamulaE., Dobrzynski P., BeroM., Paluszkiewicz C. Hydrolytic degradation of porous scaffolds for tissue engineering from terpolymer of l-lactide, e-caprolactone and glycolide // J. of Molecular Structure. 2005. N 744-747. P. 557-562.
9. Manchanda R., Fernandez-Fernandez A., Nagesetti A., McGoronA. J. Preparation and characterization of a polymeric (PLGA) nanoparticulate drug delivery system with simultaneous incorporation of chemotherapeutic and thermo-optical agents //J. Colloids. Surf. (B). 2010. N 75. P. 260-267.
10. ДосонР., Эллиот Д., ЭллиотУ., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 556 с.
Статья поступила в редакцию 24 декабря 2012 г.
