CC BY
11
УДК 577.2
Получение мышиной клеточной линии FDC-P1 со сверхэкспрессией гена KIT N822K человека
Э. Р. Вагапова*, Т. Д. Лебедев, В. И. Попенко, О. Г. Леонова, П. В. Спирин, В. С. Прасолов
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 119991 Россия
*E-mail: vr.elmira@gmail.com
Поступила в редакцию 26.07.2019
Принята к печати 09.12.2019
DOI: 10.32607/actanaturae.10938
РЕФЕРАТ Для изучения процессов злокачественного перерождения кроветворных клеток и механизмов развития резистентности лейкозных клеток к химиотерапевтическим препаратам необходимы новые модельные системы. На основе цитокинзависимой мышиной клеточной линии FDC-P1 острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) нами получены перевиваемые клетки с эффективной эктопической экспрессией мутантного гена KIT N822K человека. Изучена роль повышенной экспрессии мутантного KIT в выживаемости и чувствительности этих клеток к терапевтическим препаратам. Также создана и охарактеризована смешанная культура, состоящая из линии FDC-P1 лейкозных клеток мыши и линии HS-5 стромальных клеток человека. Полученные результаты могут быть использованы для изучения роли мутаций N822K в гене KIT в ответе клеток на противолейкозные препараты, факторы роста и цитокины. Эти данные представляют интерес для разработки эффективных подходов к терапии лейкозов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), рецепторная тирозинкиназа KIT, FDC-P1, KIT N822K, стромальные клетки.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ SCF - фактор стволовых клеток (stem cell factor); ОМЛ - острый миелоидный лейкоз; FAB M2 - острый миелобластный лейкоз с созреванием (подтип ОМЛ по Франко-Американо-Британской классификации); CD34 - дифференцировочный кластер 34.
ВВЕДЕНИЕ
Экспрессия гена KIT, кодирующего рецепторную ти-розинкиназу, характерна для различных злокачественных заболеваний: лейкозов, нейробластом, га-строинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО), мастоцитом и меланом [1—3]. В ходе нормального ге-мопоэза KIT экспрессируется в субпопуляции незрелых гемопоэтических клеток-предшественников, позитивных по CD34 (маркер стволовых клеток и ранних клеток-предшественников) [4].
В клетках острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и мастоцитоза встречаются мутации в гене кина-зы KIT, причем наиболее часто это мутации D816V и N822K, локализованные в тирозинкиназном домене и приводящие к ее конститутивной активации. Активирующие мутации D816V и D814V вызывают существенное уменьшение чувствительности клеток, несущих эти мутации, к ингибитору KIT - иматинибу (Gleevec; Novartis Pharma AG, Basel, Швейцария) in vitro и in vivo [5, 6]. Мутации в киназном домене KIT ассоциированы с повышенной частотой рецидивов
FAB М2 ОМЛ после химиотерапии [7]. Иматиниб -высокоселективный ингибитор киназ Abl, BCR-ABL, PDGFRa/P и KIT, применяется при BCR-ABL-позитивных лейкозах и ГИСО с мутациями в генах KIT и PDGFR. В комбинации с другими антилейкоз-ными препаратами иматиниб используют при ОМЛ. Показано, что иматиниб эффективно воздействует на клетки ОМЛ у пациентов высоких групп риска. Однако монотерапия иматинибом в высокой концентрации нередко приводит к развитию тяжелой цито-пении и поэтому не рекомендуется [8].
На основе цитокинзависимой клеточной линии FDC-P1 лейкоза мышей с невысоким уровнем экспрессии гена KIT дикого типа мы получили новую перевиваемую линию клеток со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека и изучили роль этой мутации, локализованной в тирозинкиназном домене, в поддержании злокачественного статуса лейкозных клеток - выживаемости, чувствительности к препаратам и росте в контакте со стромальны-ми клетками.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культуры клеток
Перевиваемые клетки FDC-P1 культивировали в среде IMDM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пи-рувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 7% кондиционированной среды клеток WEHI-3B, содержащей ин-терлейкин-3 (IL3) мыши, при 37°C и 5% CO2. Линию стромальных клеток HS-5 человека культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пиру-вата натрия, 2 мМ L-глутамина. Все реагенты производства Gibco, ThermoFisher Scientific (США). Линии клеток получены из Heinrich-Pette Institute-Leibniz Institute for Experimental Virology (HPI, Гамбург, Германия) и протестированы на отсутствие контаминации микоплазмой.
Иммуноцитохимический анализ клеток
Для проведения качественного анализа клетки FDC-P1 фиксировали 4% параформальдегидом на 0.1 М фосфатном буфере (ФСБ) в течение 15 мин, далее промывали ФСБ, обрабатывали ФСБ с 0.2% Triton X-100 и антителами, специфичными к белку KIT человека, конъюгированными с красителем PerCP/Cy5.5 (PerCP/Cy5.5, Abcam, ab157320, 1 : 50). После промывки ФСБ клетки заключали в заливочную среду Slowfade gold (Invitrogen, США, s36936), содержащую 1 мкг/мл DAPI (Sigma-Aldrich, США), препараты герметизировали лаком для ногтей. Препараты анализировали c использованием конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия) и объектива HCX PLAPO CS. Для количественного определения интенсивности окраски клетки FDC-P1 обрабатывали антителами, специфичными к белку KIT человека, конъюгиро-ванными с красителем PerCP/Cy5.5 (PerCP/Cy5.5, Abcam, ab157320, 1 : 50) и анализировали на проточном цитофлуориметре LSRFortessa (BD Biosciences). Результаты анализировали при помощи программного обеспечения FlowJo.
Количественная ПЦР в реальном времени и дизайн праймеров
РНК выделяли с использованием Trizol (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию препарата РНК и его чистоту определяли на спектрофотометре (NanoDrop). кДНК синтезировали с помощью набора для обратной транскрипции ThermoFisher (Random-праймеры). ПЦР в реальном времени проводили с флуоресцентным красителем Maxima SYBR Green Supermix (Thermo
Scientific) на амплификаторе CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США). Экспрессию целевых генов нормировали на экспрессию гена ß-актина (b-actin) в каждой пробе. Подсчет Ct и относительного уровня экспрессии производили в программном обеспечении CFX Manager 3.1. В каждом эксперименте использовали не менее трех повторов. Праймеры подбирали с помощью Primer Blast (NCBI, США) по следующим параметрам: размер продукта амплификации 50-200 п.н., температура отжига праймеров 57°С. Энергетические характеристики пар праймеров проверяли с использованием Oligo Analyzer (idtdna) для исключения образования высокоэнергетических шпилечных конструкций и димеров (более 10 кДж). Последовательности праймеров: B-actin forward 5'-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3'; B-actin reverse 5'-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3'; musKIT forward 5'-CCATAGACTCCAGCGTCTTCC-3'; musKIT reverse 5'-GCCTGGATTTGCTCTTTGTT-GTT-3'; humKIT forward 5'-CCACCCTGGTCAT-TACAGAA-3'; humKIT reverse 5'-CTCCAGGTT-TCATGTCCATG-3'.
Статистический анализ
Все тесты и подсчеты отклонений анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad prism.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение перевиваемых клеток мышиного лейкоза со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека
С целью анализа онкогенного потенциала рецеп-торной тирозинкиназы KIT с мутацией N822K в ки-назном домене, в частности, ее способности влиять на пролиферацию лейкозных клеток миелоидного происхождения, получена клеточная линия FDC-P1 N822K. Для этого ^3-зависимые клетки FDC-P1 мыши трансдуцировали ретровирусным вектором, направляющим экспрессию гена, кодирующего ре-цепторную тирозинкиназу KIT человека с мутацией N822K. Этот вектор также направляет синтез маркерного зеленого флуоресцентного белка GFP (рис. 1А). Вектор любезно предоставлен Carol Stocking (HPI, Гамбург, Германия). Контрольную линию клеток трансдуцировали исходным ретровирус-ным вектором, не содержащим KIT N822K.
Популяция клеток с наибольшей интенсивностью флуоресценции в канале FITC, что соответствует высокой экспрессии GFP, была отобрана на клеточном сортере (S3e Cell Sorter, Bio-Rad) (рис. 1Б). В отобранных клетках методом количественной ПЦР в реальном времени определена экспрессия гена KIT
и
0
1 m s и
I
<U н I
X
ш
X H
0 £ и
1
ф
и
и <и а
о ^
с
-fr
и X
m о; га
I I
га m О m s с га
а
0
1
0 200K400K600K800K 1.0M
Контроль
KIT N822K
Размер, отн. ед.
Г 225 -
220
215 210 25
150 100 50 0
200 150 100 50 0
100 101 102 103 104 105
I'M ■ "1ПЦ
100 101 102 103 104 105
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
ш - . - Фш. Ü
в
mus
hum
Контроль
KIT N822K
Б
В
Рис. 1. Сверхэкспрессия гена KIT человека в клетках мышиного лейкоза FDC-P1. А - схема вектора, направляющего экспрессию гена KIT N822K человека. Б - сортировка популяции клеток с высокой интенсивностью флуоресценции в канале FITC (FL1) (выделено контуром), серым показаны нетрансдуцированные клетки FDC-P1, зеленым - трансдуцированные вектором KIT N822K. Экспонирование рецептора KIT на поверхности контрольных клеток и клеток со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека. В — клетки обработаны моноклональ-ными антителами к KIT человека, конъюгированными с PerCP/Cy5.5 и проанализированы на проточном цитоф-луориметре. Интенсивность не обработанных антителами клеток показана серым цветом, обработанных антителами к KIT - розовым. Г - уровень экспрессии мРНК гена KIT мыши (mus) и KIT человека (hum) в клетках FDC-P1 со сверхэкспрессией KIT N822K по данным ПЦР. Д - микрофотография клеток FDC-P1, инкубированных с антителами к рецептору KIT человека (розовый цвет) и красителем ДНК DAPI (зеленый)
(рис. 1Г). Клетки FDC-P1 N822K экспонируют белок KIT (рис. 1В). Присутствие белка KIT человека в клетках FDC-P1 KIT N822K подтверждено с помощью конфокальной микроскопии, тогда как в клетках FDC-P1, трансдуцированных контрольным вектором, экспрессия KIT человека не обнаружена -ни на уровне мРНК, ни на уровне белка (рис. 1В,Д).
Введение KIT N822K приводит к IL3-независимому росту клеток FDC-P1
Контрольные клетки и клетки FDC-P1 N822K были посеяны с одинаковой плотностью. Подсчет клеток
проводили в течение 6 дней. Введение мутантного KIT N822K не влияло на скорость роста клеток FDC-P1 в присутствии IL3 (рис. 2А).
Сверхэкспрессия мутантного гена KIT в клетках FDC-P1 приводит к их фактор-независимому росту (рис. 2А). Скорость роста контрольных клеток FDC-P1 существенно снижается в среде с пониженным содержанием кондиционированной среды с IL3 (0.25%).
Мы не зарегистрировали существенного изменения скорости роста клеток под действием лиганда KIT - SCF (Abcam) (рис. 2Б). Контрольные и FDC-P1
Л
Скорость роста
SCF
2000 —
с
<и
т у
с
о
1500
1000
500
*
о т
(U С
к о
m
т
с
<U
т у
С
о
100
50
K (IL3+) K (IL3 low) N822K (IL3+) N822K (IL3 low)
Дни Иматиниб
*
о т
(U С
к о
m
т
с
<U т
и
С
о
100
□ Ima 0 мкМ Hlma 7.5 мкМ Ima 10 мкМ
50
Контроль
100
*
о т
(U
л к
с
(U т
и л о К
50
□ SCF-
□ SCF (50 нг/мл)
KIT N822K
Цитарабин
□ AraC 0 нМ AraC 75 нМ
□ AraC 100 нМ
Контроль
KIT N822K
Контроль
KIT N822K
Рис. 2. Скорость роста клеток FDC-P1 в присутствии О (сплошная линия) и при пониженном содержании О (пунктирная) (А). Количество клеток FDC-P1, обработанных рекомбинантным SCF, в 1 мл среды (Б). Количество клеток FDC-P1 (в %) относительно необработанных клеток на 3 день после добавления иматиниба (б) и цитараби-на (Г). * - р < 0.05
^22К-клетки были обработаны противоопухолевыми препаратами: иматинибом (7.5 и 10 мкМ) и ци-тарабином (75 и 100 нМ). Количество клеток подсчитывали на 3 день после добавления препаратов. Концентрация иматиниба, ингибирующая рост контрольных клеток FDC-P1 на 50% (IC), составила 10 мкМ. Клетки FDC-P1 со сверхэкспрессией KIT N822K были более чувствительными к этой концентрации препарата (рис. 2В). Чувствительность клеток к цитарабину осталась такой же, как в контроле (рис. 2Г).
Полученные нами данные соответствуют результатам, согласно которым мутация в тирозинкиназном домене KIT, в частности D816V, усиливает чувствительность к иматинибу [9].
Получение смешанной культуры лейкозных и стромальных клеток
Факторы, которые продуцируют стромальные клетки, участвуют в стимуляции пролиферации кроветворных клеток, регуляции клеточного цикла, а также
контролируют апоптоз. В то же время процессы, происходящие при контакте стромальных клеток с лей-козными, плохо изучены.
Перевиваемые стромальные клетки человека HS-5 были посеяны в количестве 5000 клеток на лунку. На следующий день культуральную среду клеток HS-5 сменили на среду IMDM, содержащую клетки FDC-P1 (500 клеток на лунку). Через 3 и 5 дней после посева подсчитали количество клеток в суспензионной фракции. Прямой контакт лейкозных и стромальных клеток приводит к снижению скорости роста контрольных клеток FDC-P1 (рис. 3А, Б), но не клеток FDC-P1, сверхэкспрессирующих KIT N822K.
Известно, что цитокины и факторы роста, продуцируемые клетками стромы (в том числе HS-5), могут модулировать экспрессию гена KIT в кокульти-вируемых с ними лейкозных клетках [10]. Вероятно, скорость роста клеток FDC-P1 с эктопической экспрессией KIT N822Kне меняется при сверхэкспрессии данной киназы. Кроме того, скорость роста может
Б
0
0
В
0
0
А 150
2 х 100
50-
День 3
Б 800 600 400 200 0
K
N822K
День 5
K
N822K
Рис. 3. Количество клеток FDC-P1, культивируемых в отсутствие (зеленый цвет) и в присутствии стромальных клеток ^-5 (розовый цвет) на 3-й (А) и 5-й (Б) день; фотографии культуры клеток FDC-P1, смешанных с ^-5: контрольные (б), N822K (Г). Продольные клетки стромы адгезируют ко дну планшета, круглые клетки FDC-P1 находятся в суспензии
В
0
отличаться из-за различий в адгезии контрольных клеток FDC-P1 и клеток FDC-P1 N822K.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
^3-зависимая мышиная клеточная линия FDC-P1 широко используется для исследования онкогенного действия киназ, транскрипционных факторов, а также эффективности противолейкозных препаратов [11, 12]. Нами получена и охарактеризована линия клеток FDC-P1 со сверхэкспрессией мутантного гена KIT N822K человека. Показано, что мутация N822K в гене KIT приводит к увеличению чувствительности клеток FDC-P1 к иматинибу. Мутация D419A во внеклеточном домене рецептора KIT также повышает чувствительность клеток к иматинибу [9]. Показано снижение скорости роста контрольных клеток при контакте со стромой, что не характерно
для клеток FDC-P1, экспрессирующих мутантный ген KIT N822K. Исследование механизмов взаимодействия лейкозных клеток со стромальными требует более пристального внимания для установления возможного вклада стромальных клеток в ответ лейкозных клеток на химиотерапевтические агенты. Полученная нами модель может использоваться для тестирования различных противолейкозных препаратов, в том числе при совместном культивировании лейкозных и стромальных клеток. •
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ: эксперименты по получению генетических конструкций выполнены в рамках проекта № 18-29-09151, работа с культурами клеток проведена в рамках проекта № 17-04-01555.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hassan H.T. // Leuk. Res. 2009. V. 33. № 1. P. 5-10.
2. Tabone S., Theou N., Wozniak A., Saffroy R., Deville L., Julie C., Callard P., Lavergne-Slove A., Debiec-Rychter M., Lem-oine A., et al. // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 2005. V. 1741. № 1-2. P. 165-172.
3. Krams M., Parwaresch R., Sipos B., Heidorn K., Harms D., Rudolph P. // Oncogene. 2004. V. 23. № 2. P. 588-595.
4. Thoren L.A., Liuba K., Bryder D., Nygren J.M., Jensen C.T., Qian H., Antonchuk J., Jacobsen, S.-E.W. // J. Immunol. Am. Ass. Immunol. 2008. V. 180. № 4. P. 2045-2053.
5. Growney J.D., Clark J. J., Adelsperger J., Stone R., Fabbro D., Griffin J.D., Gilliland D.G. // Blood. Am. Soc. Hematol. 2005. V. 106. № 2. P. 721-724.
6. Ustun C., DeRemer D.L., Akin C. // Leuk. Res. Pergamon. 2011. V. 35. № 9. P. 1143-1152.
7. Wang Y.-Y., Zhao L.-J., Wu C.-F., Liu P., Shi L., Liang Y., Xiong S.-M., Mi J.-Q., Chen Z., Ren R., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 4. P. 1104-1109.
8. Kindler T., Breitenbuecher F., Marx A., Beck J., Hess G., Weinkauf B., Duyster J., Peschel C., Kirkpatrick C.J., Theobald M., et al. // Blood. Am. Soc. Hematol. 2004. V. 103. № 10. P. 3644-3654.
9. Cammenga J., Horn S., Bergholz U., Sommer G., Besmer P., Fiedler W., Stocking C. // Blood. 2005. V. 106. № 12. P. 39583961.
10. Gordon P.M., Dias S., Williams D.A. // Leukemia. 2014. V. 28. № 11. P. 2257-2260.
11. Gaikwad A., Prchal J.T. // Exp. Hematol. 2007. V. 35. № 11. P. 1647-1656.
12. McCallum L., Price S., Planque N., Perbal B., Pierce A., Whet-ton A.D., Irvine A.E. // Blood. 2006. V. 108. № 5. P. 1716-1723.
