CC BY
30
рин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - JL, 1962. - 179 с. - 3. Бень-кович Б.И. Психофармакологические препараты и нервная система. - Ростов н/Д, 2000. - 509 с. - 4. Вальдман А.В., Александровский Ю.А. Психофармакотерапия невротических расстройств. - М.: Медицина, 1987,- 286 с. -5. Владимирский Б.М. Математические методы в биологии. - Ростов н/Д, 1983. - 302 с. - 6. Воронина Т. А., Моло-давкин Г.М., Борликова Г.Г. и др. //Эксп. и клин, фарма-кол. - 2000. - Т. 63. - № 2. - С. 9-11. - 7. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. - Ростов н/Д, 1990. - 224 с. -8. Завалишин И.А., Захарова М.Н. // Журн. неврол. и психиатр. - 1996. -№ 2. - С. 111-114. -9. Крупенина В.И. // Докл. Иркут, противочумн. ин-та. - Улан-Удэ, 1961. - Вьт.1. -
С. 44—45. - 10. Лысенко А., Альперович Д., Мендже-рицкий А. // Hypoxia Medical J. - 1998. - № 1. - С. 2-7. -
11. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. Меньшикова В.В. - М., 1987. - 368 с. -
12.Мирзоян Р.С., Ганьшина Т.С., Волобуева Т.И., Романычева Н.А. Нейромедиаторы в механизме действия цереброваскулярных средств.-М., 1991.-Вып. 26.-С. 5—19. —
13. Нисс А.И., Уманский'К.Г. и др. // Журн. невропатол. и психиатр, - 1985.- №2. - С. 189-195. - 14. Биохимические методы исследования в клинике / Под ред. Покровского А.А. - М., 1969. - 652 с. - 15. Самецкий Е. А. Пластичность нейрональных структур при действии пирацетама и дельта-сон индуцирующего пептида в условиях гипероксии. - Автореф. дис. . .. канд.биол.наук. - Ростов н/Д, 1996. - 24 с. -16. Современные методы в биохимии. - М., 1977. - 390 с. - 17. Шалы-
гина Н.Б., Шепелева Г.К., Титов В.В. и др. // Про-филакт. особо опасных инф. - Саратов, 1988. - С. 33-39. -18. Giurgea С. // Act. Pharmacol. - 1972. - Vol. 25. - P. 115-156. - 19. Qian Z-N., Gu Z-L., Jin L-Q., Xie M-L., Chen B-Q. // Acta Pharmacol. Sin. - 1992. - Vol. 13, N 1. -P. 48-50.
S.V.Demyanenko, M.B.Mishan'kin, B.N.Mishan'kin, N.S.Yeremenko, N.I.Pasiukova
Pyracetamum for the Prevention of Intoxication Caused by the Plague Agent
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Analysis of observations on pyracetamum effects upon the' processes of free radicals (PFR) in the brain and blood sera of rats, stability of erythrocytic membrane (EM), and on the activity of acidic and neutral proteinases as well kallikrein-kinin system in the animals prior to their infection with Y. pestis strain EV/209, brought us to conclusion that the drug might be used for the prophylaxis of intoxication induced by Yersinia pestis infection. Preventive inoculation of pyracetamum facilitated decreased POL levels in the brain and blood of rats, higher activity of AOS in their blood, thus promoting stabilization of the erythrocytic membranes. It also reduced the activity of acidic proteinases and raised that of the neutral proteinases, and prevented excessive activation of the kallikrein-kinin system. Moreover, inoculation of pyracetamum 3 days before the injection of the murine toxin to white mice significanty increased the LD50dose.
Поступила 24.11.03
УДК 576.8:576.809.7
М.В.Ломтатидзе, Н.П.Храпова, В.В.Свиридов, Т.П.Крючкова
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ АНТИГЕНОВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Получены 12 стабильных клонов антителопродуцирующих гибридом к антигенам синегнойной палочки, являющейся одной из наиболее частых этиологических причин возникновения нозокомиальных инфекций. При проведении электрофореза антигенных препаратов P. aeruginosa и постановки иммуноблотта установлено, что МКА 1В7 взаимодействуют с эпитопами полисахаридного компонента ЛПС с молекулярной массой от 10 до 20 кДа, а остальные 11 МКА реагируют с эпитопами в составе биополимеров с молекулярной массой от 35 до 70 кДа белковой природы. Сконструированы и успению испытаны в лабораторных условиях иммуноферментная тест-система и флуоресцирующий препарат на основе полученных МКА. Обсуждается перспектива использования сконструированных препаратов для экспресс-обнаружения госпитальных штаммов P. aeruginosa.
В последнее десятилетие за рубежом широкое распространение получили моноклональные антитела (МКА) против различных антигенов Pseudomonas aeruginosa, в том числе и как ингредиенты им-мунодиагностических тестов [3, 4, 5, 6]. В нашей стране исследования по получению и применению МКА к антигенам синегнойной палочки не проводились, несмотря на очевидную актуальность проблемы конструирования высокоактивных диагностических средств на основе антител заданной специфичности.
В настоящее время коммерческие средства экспресс-обнаружения госпитальных штаммов синегнойной палочки в арсенале отечественных диагностических лабораторий отсутствуют. Это относится как к препаратам, приготовленным на основе МКА, так и поликлональным иммуноглобулинам против антигенов P. aeruginosa. Исследования по получению МКА к диагностически значимым антигенам
данного микроорганизма и оценке их свойств с точки зрения перспектив создания современных образцов препаратов бесспорно способствуют совершенствованию надзора за патогенами - возбудителями нозокомиальных инфекций.
Данное исследование выполнено на модели синегнойной палочки. Воспроизведение гибридом-ной технологии осуществлено согласно общепринятому протоколу. До начала опытов по гибридизации мышиных клеточных линий проведен ряд предварительных экспериментов по оптимизации условий стимуляции мышиных спленоцитов - одного из партнеров при гибридизации клеточных линий антигенами P. aeruginosa и подбору метода скрининга МКА.
Апробированы 9 схем иммунизации мышей линии BALB/c УЗ-дезинтегратами микробных клеток (м.к.) и ЛПС P. aeruginosa. Последующий анализ эффективности гибридизации мышиных В-лимфо-
цитов, стимулированных этими антигенами, с клетками одной из традиционных линий мышиной мие-ломы и оценка эффективности получения АТ-проду-центов позволили установить, что при воспроизведении гибридомной технологии на модели P. aeruginosa следует применять не очень длительные по времени циклы иммунизации мышей-доноров спле-ноцитов. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 1,6-10 м.к., а для препаратов ЛПС - не более 0,1-0,2 мг; число инъекций - 3-4, бустерную инъекцию предпочтительнее делать внутриселезеночно. Установлена также целесообразность сочетанного применения м.к. и растворимых антигенов при стимуляции В-лимфоцитов мышей.
Наибольшие трудности возникли при получении МКА к ЛПС. Были подобраны достаточно эффективные схемы иммунизации мышей, проведены 5 опытов по гибридизации клеточных линий. Несмотря на высокие показатели эффективности гибридизации и эффективности получения АТ-проду-центов, зарегистрированные в течение первого месяца культивирования гибридных клонов, последние оказались чрезвычайно нестабильными по параметру продукции иммуноглобулинов.
I После проведения двух серий опытов была создана первая отечественная коллекция перевиваемых гибридных клеток-продуцентов МКА против эпитопов препаратов водно-солевого экстраюга (ВСЭ) и ЛПС P. aeruginosa, состоящая из 12 клонов гибридом.
Вторым важным этапом подготовки к воспроизведению гибридомной технологии являлся этап подбора метода скрининга МКА. В качестве такого метода был использован непрямой вариант твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ): АГ + испытуемые иммуноглобулины + иммуноперокси-дазный конъюгат (ИПК) против Ig мыши. Этот метод - один из наиболее чувствительных тестов обнаружения минимальных концентраций специфических антител и, что очень важно, позволяет одномоментно исследовать большое число проб. До начала экспериментов по гибридизации клеточных линий были оптимизированы условия постановки ТИФМ в части подбора серий антигенных препаратов (ВСЭ и ЛПС), которые применяли для адсорбции на твердой фазе образцов поликлональных мышиных сы-
вороток (заведомо положительный контроль). В остальном методика постановки ТИФМ отвечала общепринятым требованиям.
После завершения опытов по гибридизации мышиных клеточных линий и создания коллекции стабильных гибридом-продуцентов МКА была проведена оценка спектра специфической активности псевдомонадных моноклональных иммуноглобулинов, выделенных из культуральной среды. Результаты опытов представлены в таблице. Для накопления препаративных количеств МКА клетки 12 стабильных перевиваемых линий гибридом, продуцирующих специфические иммуноглобулины против антигенов P. aeruginosa, тиражировали in vitro и in vivo.
Для определения специфичности МКА по отношению к эпитопам антигенов синегнойной палочки проводили western-blott.
Электрофоретическому разделению подвергали антигенные препараты различных сероваров P. aeruginosa (ВСЭ Н-2, ВСЭ Н-3, ЛПС Н-2, ЛПС Н-4, ЛПС Н-5, ЛПС Н-6, ЛПС Н-11, ЛПС РАО-1).
В случае применения при электрофоретическом разделении ВСЭ Н-3 Р. aeruginosa удалось достичь визуализации линий всеми 12 вариантами МКА. Из них 5 вариантов МКА (4G4/F5 , 4Ец/Аю, 4G5/E9, 4Gg/F|2, 4Gn/Hii) больше не взаимодействовали ни с одним из использованных антигенных препаратов P. aeruginosa в иммуноблоттинге.
Напротив, МКА 2A2/Fu и H-2/G3 проявляли специфичность в отношении всех использованных антигенных препаратов P. aeruginosa за исключением ЛПС Н-5 P. aeruginosa, с которым специфическое связывание происходило только у МКА, полученных к ЛПС P. aeruginosa.
Для идентификации компонентов АГ препаратов, используемых при электрофорезе в полиакриламидном геле, проводили его окрашивание различными видами красителей: Кумаси R-250 (окрашивание белков), азотно-кислое серебро (окрашивание липополисахаридов), Stains all (окрашивание всех ингредиентов в различные цвета).
Оказалось, что МКА 1В7 взаимодействуют с эпитопами, расположенными на полисахаридном компоненте ЛПС с молекулярной массой от 10 до 20 кДа. Остальные 11 вариантов МКА направлены против эпитопов в составе биополимеров с молеку-
Изотмпы МКА и характер их взаимодействия с различными антигенами P. aeruginosa в ТИФМ
Наименование МКА Результаты ТИФМ (обратные титры антител) при адсорбции на твердой фазе
Изотип МКА УЗд УЗд УЗд ВСЭ ВСЭ ЛПС ЛПС ЛПС
РА Н-1 РАН-2 РА Н-6 РА Н-2 РА Н-3 РА Н-2 РА Н-6 РА Н-11
1 В,/С5 IgGa - - 1280 16 000 5 000 - - -
2A2/F, 1 IgG2b 640 - 20 2 000 10 000 - . -
H-2/G3 IgG, - - 1280 64 000 20 000 - ■ -
4G4/F5 IgG, - 1280 8 000 20 000 - . -
4Сц/Е|2 IgC3 - 40 16 000 20 000 - - -
4Ец/Аю IgG2b 80 10 80 8 000 20 000 - - .
4G5/E9 IgG2b - - - 16 000 20 000 - - -
4Gg/F|2 IgG2b - - - 16 000 20 000 - - -
4GM/H, [gG2b - - ’ - 16 000 20 000 - - -
5D,/Ai2 IgG2b - ■ - 80 160 40 8 000 8 000 -
5D|o/E5 IgG2b - - - 80 - 2 000 2 000 -
7G4/C7 lgG2b - - - 640 - 40 40 32 000
Примечание. «-» - отрицательный результат ТИФМ.
лярной массой от 35 до 70 кДа белковой природы.
Изотипирование 12 типов МКА позволило установить, что все они являлись иммуноглобулинами класса IgG, при этом 2 варианта МКА принадлежат к классу IgG3 (1В7 и 4Сц), 2 варианта - к классу IgGi (H-2/G3, 4G4) и 8 вариантов МКА - к классу IgG2b (2А2, 4Е„, 4G5, 4G8, 4G,„ 5DS) 5D10, 7G4).
Одной из задач настоящей работы являлось приготовление экспериментальных образцов имму-нодиагностических препаратов на основе МКА. Для ее реализации МКА метили флуорохромом и ферментом.
В качестве препаратов сравнения использовали поликлональные аналоги. Изготовление последних осуществляли на основе поликлональных иммуноглобулинов, выделенных из кроличьих сывороток, полученных согласно разработанным схемам иммунизации животных антигенами синегнойной палочки. Необходимо отметить, что при. изготовлении образцов поликлональных препаратов на основе индивидуальных сывороток проявились известные ограничения работы с поликлональным сырьем: вариабельность состава индивидуальных сывороток и, как следствие этого, колебания показателей специфической активности антител, что осложняет процесс приготовления стандартных образцов препаратов.
Сравнительный анализ специфической активности поли- и моноклонального препаратов иммуноглобулинов флуоресцирующих выявил более широкий спектр активности первого из них в отношении типовых штаммов P. aeruginosa, но в то же время и способность перекрестно реагировать с 25 % штаммов гетерологичных псевдомонад. В отличие от поликлонального препарата моноклональные иммуноглобулины флуоресцирующие, приготовленные на основе МКА 1B7/G5, наиболее перспективного типа Ig с точки зрения потенциального сырья для создания иммунодиагностического средства для метода флуоресцирующих антител (МФА), не окрашивали клетки гетерологичных видов псевдомонад, использованных в данной работе. В отношении типовых штаммов P. aeruginosa этот препарат обладал более узким спектром специфической активности. Однако при исследовании клинических изолятов синегнойной палочки он проявил активность, сопоставимую с активностью поликлонального аналога: оба типа препаратов окрашивали 68 % штаммов, идентифицированных при бактериологическом исследовании как P. aeruginosa.
Что касается оценки пригодности МКА различных типов для создания на их основе иммунофер-ментных тест-систем, способных с высокой степенью чувствительности выявлять синегнойную палочку и ее антигены в ТИФМ, то после проведения серии экспериментов установлено, что на сегодняшний день наиболее перспективным следует признать комбинированный вариант тест-системы: поликлональные АТ для приготовления твердой фазы («подложка») в сочетании с последующим применением моноклонального ИПК для детекции синегнойной палочки и ее антигенов. Наибольшей чувствительностью обладают тест-системы имму-ноферментные с моноклональными ИПК 1B7/G5, 2A2/Fn и H-2/G3, позволяющие выявлять ~ 50 нг/мл
белка ВСЭ и более 1-104м.к./мл в формалинизиро-ванных взвесях P. aeruginosa. В то же время мы считаем возможным и перспективным создание высокочувствительной тест-системы только на основе МКА при подборе такой смеси нескольких типов МКА (имитация поликлональности), которая позволит максимально эффективно связывать антигенные компоненты исследуемых проб [1, 2].
Таким образом, получены доказательства пригодности ряда МКА против антигенов P. aeruginosa для использования в качестве основы иммунодиаг-ностических препаратов для МФА и ТИФМ. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики синегнойной инфекции мы связываем с широкой апробацией экспериментальных образцов моноклональных препаратов при экспресс-обнаружении и идентификации P. aeruginosa в различных объектах исследования.
Наличие коллекции стабильных гибридом-про-дуцентов МКА против антигенов P. aeruginosa, постоянно сохраняемых в условиях глубокого холода, делает возможным в условиях экспериментального производства МИБП тиражирование того или иного гибридного клона, секретирующего антитела к диагностически значимому антигену, и накопление необходимого количества биологического сырья. Это, безусловно, открывает новые возможности в области конструирования стандартных по параметрам качества средств, обнаружения патогенных псевдомонад. Изготовленные на основе МКА иммунодиагно-стические препараты, как правило, обладают более высокими показателями удельной активности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Крючкова Т.П., Савченко С.Т., Гавенский
C.Д. и др. // Карантинные и зоонозные инф. в Казахстане. -Алматы, 2002. - Вып. 6. - С. 109-111. - 2. Храпова Н.П., Ломтатидзе М.В., Крючкова Т.П. и др. VI Российский съезд врачей-инфекционистов (29-31 октября 2003 г.). - СПб, 2003. - С. 419-420. - 3. Chia J.K.S., Pollack М., Avigan
D., Steinbach S. // Inf. Immun. - 1986. - Vol. 52, N 3. - P. 756-762. - 4.GalIoway D.R., Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R. // Inf. Immun. - 1984. - Vol. 44, N 2. - P. 262-267. - 5. Lam J.S., Mutharia L.M., Hancock R.E.W. Monoclonal antibodies against bacteria / Ed by A.J.L.Macario, E.C.Macario. - New York: Acad. Press, 1985. - P. 143-157. - 6. Lam J.S., MacDonald L. A., Lam M. Y. et al. /I Inf. Immun. - 1987. - Vol. 55, N5.-P. 1051-1057.
M.V.Lomtatidze, N.P.Khrapova, V.V.Sviridov, T.P.Kruchkova
Obtaining of Monoclonal Antibodies against the Antigens of the Blue Pus Bacillus and Prospects of their Use for the Diagnostic Purposes
Volgograd Anti-Plague Research Institute
Twelve stable clones of antibody producing hybridomas were obtained against the blue pus bacillus which is a most common etiologic agent of nosocomial infections. Electrophoretic and immunoblotting studies of Pseudomonos aeruginosa showed the monoclonal antibodies (MCA) 1B7 to interact with the epitopes of the LPS polysaccharide component (molecular weight of 10 to 20 kDa), the other eleven MCA manifesting the reaction with the epitopes of albuminous biopolymers whose mol. weight ranged from 35 to 70 kDa. Based on these MCA, an immuno-enzyme test system and a fluorescent preparation were constructed and used in a trial under laboratory conditions. The preparations thus developed are considered as very promising reagents to be used in express-detection of hospital P. aeruginosa strains.
Поступила 27.02.04
