CC BY
14
УДК 602.44
Пономарева А.М., Романова М.В., Белодед А.В.
ПОЛУЧЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ХЛЕБНЫХ ОТХОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ СИНТЕЗОМ
Пономарева Анна Михайловна, студентка 4 курса бакалавриата факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Романова Мария Васильевна, аспирантка 1 года обучения кафедры биотехнологии; Белодед Андрей Васильевич, к.б.н., доцент кафедры биотехнологии, email: avbeloded@mail.ru; Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
В работе рассмотрена возможность получения молочной кислоты с помощью культивирования молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei на гидролизатах хлебных отходов. Предварительная обработка хлебных отходов проводилась путем кислотного или ферментативного гидролиза. В ходе исследования варьировались физико-химические условия и режимы предобработки модельного субстрата с целью максимально полного гидролиза полисахаридов и последующего (или одновременного) культивирования молочнокислых бактерий. Установлено, что ферментативный гидролиз является более эффективным способом предварительной обработки хлебных отходов, при котором достигается максимальный выход редуцирующих веществ, а концентрация молочной кислоты в ходе процесса «осахаривание-брожение» достигает 53,7 г/л. Ключевые слова: молочная кислота, хлебные отходы, Lactobacillus paracasei, ферментативный гидролиз, кислотный гидролиз.
LACTIC ACID PRODUCTION FROM BREAD WASTE BY MICROBIOLOGICAL SYNTESIS
Ponomareva A.M., Romanova M.V., Beloded A.V.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
In current study the possibility of lactic acid production by cultivating lactic acid bacteria on bread waste hydrolysates is considered. The pre-treatment of bread waste was performed by acid or enzymatic hydrolysis. The conditions and modes of pre-treatment of model substrate were varied in order to maximize polysaccharide hydrolysis and subsequent (or simultaneous) cultivation of lactic acid bacteria. It had been established that enzymatic hydrolysis is more efficient method of bread waste pre-treatment. In this way the maximum yield of reducing carbohydrates had achieved and concentration of lactic acid during simultaneous saccharification is 53,7 g/l. Key words: lactic acid, bread waste, Lactobacillus paracasei, enzymatic hydrolysis, acid hydrolysis.
Молочная кислота (МК) является значимым соединением, которое находит применение во многих отраслях промышленности: от производства пищевых продуктов до синтеза современных экологичных полилактидных волокон [1]. Полилактидные пластики, полученные на основе молочной кислоты, являются экологически безопасной альтернативой традиционным пластмассам. Микробиологический синтез молочной кислоты имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими методами: оптическая чистота продукта, нетоксичность процессов производства, возможность использования отходов пищевых производств и сельского хозяйства в качестве субстратов и т. д. Молочнокислые бактерии вида Lactobacillus paracasei являются продуцентами оптически чистой L-молочной кислоты в высоких концентрациях [2].
В настоящее время использование хлебных отходов в качестве субстрата для культивирования микроорганизмов является экономически и технически эффективным решением ввиду высокого содержания углеводов в хлебобулочных продуктах. Также такой субстрат является дешевым и доступным. Предварительная обработка хлебных отходов требует намного меньше усилий и затрат по сравнению с альтернативными органическими
отходами, сточными водами или
целлюлозосодержащим вторичным сырьем [3].
Целью настоящего исследования являлось изучение биосинтеза молочной кислоты бактериями Lactobacillus paracasei на субстратах, моделирующих хлебные отходы.
В качестве хлебных отходов использовался белый хлеб «Красная цена» с истекшим сроком годности. Образцы хлеба подвергались механическому измельчению и высушиванию при комнатной температуре от 7 до 10 дней.
Для приготовления посевного материала использовалась питательная среда следующего состава (г/л): глюкоза - 10, триптон - 10, дрожжевой экстракт - 15, K2HPO4 - 2, MgSO4 - 0,1, MnSO4 - 0,05. Инокулят выращивался в термостате при 37°С в течение 24 часов.
Для того чтобы бактерии Lactobacillus paracasei были способны усваивать содержащиеся в хлебе углеводы, необходимо перевести полисахариды в простые сахара. Для этого образцы модельных хлебных отходов подвергались предварительной обработке: кислотному или ферментативному гидролизу. Известно, что гидролиз является эффективным методом для обработки вторичного
сырья и его дальнейшего использования в микробиологическом синтезе [4].
Эффективность стадии гидролиза и последующей ферментации определялась по конечной концентрации молочной кислоты с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для разделения использовался хроматограф Agilent 1220 Infinity LC с колонкой Hi-Plex H (250x4,6 мм).
Кислотный гидролиз проводился с использованием серной кислоты. Измельченные и высушенные образцы помещались в колбы объемом 250 мл, содержащие H2SO4 (конечная концентрация хлеба составляла 50 г/л) различной концентрации. Процесс гидролиза осуществлялся в автоклаве при избыточном давлении. Время, температура и концентрация кислоты варьировались в ходе эксперимента. После автоклавирования pH раствора доводился до 7,0 раствором NaOH (20% масс), затем в колбы вносился дрожжевой экстракт (5 г/л). Засев бактериальной культуры проводился в стерильных условиях, после чего колбы инкубировали в термостате при 37°С. Общая продолжительность ферментации составила около 3 суток. Значение pH среды в колбах поддерживался периодической подтитровкой раствором NaOH до нейтральной реакции среды.
Было изучено влияние температуры, концентрации кислоты и продолжительности автоклавирования при прочих равных условиях на эффективность предобработки хлебных отходов. Результаты исследования представлены на рис. 1. Изменение избыточного давления при автоклавировании незначительно влияет на эффективность кислотного гидролиза (рис. 1а). При повышении концентрации серной кислоты выход молочной кислоты существенно снижается (рис. 1б). Это может быть вызвано накоплением в среде токсичных для бактерий продуктов гидролиза и ингибированием роста микроорганизмов. Также показано, что эффективность гидролиза зависит от продолжительности автоклавирования (рис. 1в). Очевидно, что более длительный гидролиз приводит к повышению содержания олигосахаридов и моносахаридов, утилизируемых Lactobacillus paracasei.
С кон (МК) = f (Др)
0 20
1 13
5 16
i 14
I 12
Е 10
3- 8
I 6
S 4
? 2
С кон (МК) = f (С H2S04)
о
I I
0,5
Др, атм
Рис. 1а. Конечная концентрация молочной кислоты при различном избыточном давлении при автоклавировании (0,5 атм и 1 атм)
с 22 - 20 | 18 | 16 л 14 £12 % 10 S 8 5 6
CD
i 4
i 2 О
* о
I
0,5 1
С Н2Б04, моль/л
Рис. 1б. Конечная концентрация молочной кислоты при различных концентрациях Н2$04 (0,5 моль/л и 1 моль/л)
С кон (МК) =f (t)
.5 20 ^ 18 5 16 I 14
I 12
i 10
^ «
= 8 § 6 S 4
¥ 2
<D
£ 0
I I
20 40 60
Iавтоклавирования, мин
Рис. 1в. Конечная концентрация молочной кислоты при различном времени автоклавирования (20 мин, 40 мин, 60 мин)
Для проведения ферментативного гидролиза (ферментолиза) были выбраны ферментные препараты компании «Сиббиофарм» Амилосубтилин ГХ3 и Глюкаваморин ГХ3. Данные ферменты широко распространены в сельском хозяйстве и используются при обработке различного крахмалосодержащего сырья. Первая стадия - разжижение суспензий -протекает при действии амилосубтилина, а вторую стадию - непосредственное осахаривание -катализирует глюкаваморин [5].
Ферментативный гидролиз, как и кислотный, осуществлялся в колбах объемом 250 мл. Сухие измельченные образцы хлеба помещались в водный раствор и стерилизовались в автоклаве при избыточном давлении 1 атм в течении 40 минут. Далее в суспензию вносились порции ферментов, и колбы помещались в термостат для протекания гидролиза. Дрожжевой экстракт добавлялся перед засевом культуры. Засев инокулята проводился в стерильных условиях. Подтитровка колб также, как и при изучении культивирования на кислотных гидролизатах, осуществлялась с помощью раствора КаОИ. Общая продолжительность ферментации составляла около 3 суток.
В ходе исследования варьировались следующие показатели: температура и продолжительность гидролиза, количество ферментов и посевного
материала, количество внесений ферментов, наличие дрожжевого экстракта. Результаты представлены на рис. 2. Оптимальная температура действия ферментов в процессе эксперимента составила 55-70°С (рис. 2а). С увеличением длительности процесса гидролиза при прочих равных условиях концентрация МК растет, но незначительно (рис. 2б). Дробное внесение ферментов не требуется, так как приводит к снижению концентрации МК (рис.2в). Повышение общего количества ферментов и объема посевного материала также повышает выход МК (рис. 2г, 2д). Значительное положительное влияние на выход МК оказывает внесение в реакционную среду 5 г/л дрожжевого экстракта (рис. 2е).
С мк = f (m ферментов)
С мк = f (Т)
^-35 1 30 5 25
аз
Í20 |15 ° 10
I
37 55 70
Температура ферментолиза, °С
Рис. 2а. Конечная концентрация молочной кислоты при различной температуре ферментолиза (37°С, 55°С, 70°С)
„-35
s зо
к
§25
га
£ 20 | 15 ¡ 10 Е г
? 5
* 0,15 ОД
Общая масса ферментов, г
Рис. 2г. Конечная концентрация молочной кислоты при различном количестве ферментов (1%, 2% от массы
сухого хлеба)
С мк = f (V инокулята)
30
ГзС
5 25
п:
|20 EL
I15
|Ю
га Э i
I о
^ 5
V инокулята, мл
Рис. 2д. Конечная концентрация молочной кислоты при
различном объеме посевного материала (5 мл, 10 мл)
С мк = f (С дэ)
30 25 20 15 10
I 60 90 180
Общее время ферментолиза, мин
Рис. 2б. Конечная концентрация молочной кислоты при различной длительности ферментолиза (60 мин, 90 мин, 180 мин)
С мк = f (N)
^ 35
| 30
| 25
& 20 X
Ф
1 15
о
* 10
1 2 Количество дробных внесений фермента
Рис. 2в. Конечная концентрация молочной кислоты при одновременном и дробном внесении ферментов
tr 45
Щ 40 § 35
I 30
I"25
^ 20
о 15
к 10
х
о а:
Концентрация ДЭ, г/л
Рис. 2е. Конечная концентрация молочной кислоты без внесения дрожжевого экстракта и с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта
Многие ферменты и ферментные препараты сохраняют активность в течение относительно долгого времени. Поэтому зачастую внесение ферментов производят одновременно с посевным материалом, не разделяя процессы гидролиза и культивирования микроорганизмов - процесс носит название «одновременное осахаривание» [4, 6].
В данной работе была исследована возможность проведения ферментолиза одновременно с культивированием молочнокислых бактерий. В колбы объемом 250 мл помещались сухие измельченные образцы хлеба из расчета 100 г на 1 л среды. После стерилизации и остывания суспензии производился засев молочнокислых бактерий и
внесение навески ферментов. Колбы инкубировали в термостате при 37°С. Подтитровка проводилась аналогичным образом с помощью раствора NaOH. Общая продолжительность ферментации составляла 3 суток.
Хроматографически было определено содержание молочной кислоты в каждом из трех экспериментов: кислотный гидролиз,
ферментативный гидролиз, одновременное осахаривание (с последующим/одновременным культивированием). Максимальные полученные значения конечной концентрации МК представлены в таблице 1.
Таблица 1. Максимальные значения конечной
концентрации МК
Способ обработки хлеба Конечная концентрация МК, г/л
Кислотный гидролиз 20,2
Ферментативный гидролиз 45,5
Одновременное осахаривание 53,7
Из таблицы 1 видно, что ферментативная обработка является предпочтительной. Кислотные гидролизаты содержат токсичные для молочнокислых бактерий вещества, которые ингибируют их рост и снижают выход молочной кислоты. Одновременное осахаривание является наиболее рациональным способом получения молочной кислоты из хлебных отходов, максимальные значения концентрации МК по окончании процесса подтверждают предположение о пролонгированном действии выбранных ферментов и возможности использования их в синхронном процессе «осахаривание-брожение».
Полученные результаты свидетельствуют, что хлебные отходы могут быть использованы в качестве субстрата для культивирования бактерий Lactobacillus paracasei и, таким образом, являются перспективным дешевым сырьем для микробиологического синтеза молочной кислоты. Их утилизация частично решает проблему избытка пищевых отходов, а получаемая молочная кислота может быть использована в качестве сырья для производства биодеградируемых пластиков на основе полилактида.
Список литературы
1. Rajeshkumar G. et al. Environment friendly, renewable and sustainable poly lactic acid (PLA) based natural fiber reinforced composites - A comprehensive review // Journal of Cleaner Production. - 2021. - V. 310. - P. 127483.
2. Tian X. et al. Metabolic engineering coupled with adaptive evolution strategies for the efficient production of high-quality L-lactic acid by Lactobacillus paracasei // Bioresource Technology. -2021. - V. 323. - P. 124549.
3. Thygesen A. et al. Valorization of municipal organic waste into purified lactic acid // Bioresource Technology. - 2021. - V. 342. - P. 125933.
4. Sadaf A. et al. Bread waste to lactic acid: Applicability of simultaneous saccharification and solid state fermentation // Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. - 2021. - V. 32. - P. 101934.
5. Науменко И. В. и др. Новый вид комбикорма повышенной кормовой ценности // Ползуновский вестник. - 2021. - №. 2. - С. 95-101.
6. Sharma S. et al. High solid loading and multiple-fed simultaneous saccharification and co-fermentation (mf-SSCF) of rice straw for high titer ethanol production at low cost // Renewable Energy. - 2021. - V. 179. - P. 1915-1924.
