Особенности получения молочной кислоты из частично депротеинизированной сыворотки Текст научной статьи по специальности «Прочие сельскохозяйственные науки»

Особенности получения молочной кислоты из частично депротеинизированной сыворотки

И. И. Вуткарева, М. К. Болога

Институт прикладной физики АН Молдовы, ул. Академическая, 5, г. Кишинев, МD-2028, Республика Молдова, e-mail: irinavutkareva@yahoo. com

Обосновывается целесообразность совмещения ферментации молочной сыворотки и электролизного выделения молочной кислоты, что обеспечивает высокую степень утилизации лактозы. Разработана схема ферментирования лактозы обработанной сыворотки штаммами термоустойчивых молочнокислых бактерий L. acidophilus и дрожжевым экстрактом с последующим получением молочной кислоты в диафрагменном электролизере. При малых токах, позволяющих поддерживать необходимую температуру и продолжительность электролиза, создаются благоприятные условия для получения молочной кислоты. Ферментативный гидролиз и электрофизическое выделение молочной кислоты перспективны для утилизации лактозы и экологической безопасности.

Ключевые слова: молочная кислота, ферментация, электролизер.

УДК 579.663

ВВЕДЕНИЕ

Молочная кислота используется в качестве регулятора кислотности в производстве продуктов переработки плодов и овощей, пива, безалкогольных напитков, хлебобулочных изделий, кожевенной, парфюмерной промышленности благодаря высоким диффузионным свойствам, сильному антимикробному действию. Мировой рынок молочной кислоты характеризуется ежегодными значительными объемами и неизменным увеличением спроса [1], необходимостью решения проблемы полной переработки молочной сыворотки, обусловленной также ужесточением требований к охране окружающей среды [2]. Молочная сыворотка - универсальная среда для культивирования молочнокислых микроорганизмов при получении молочной кислоты.

Молочнокислое брожение во многом сходно со спиртовым, отличие заключается в том, что при нем пировиноградная кислота не декар-боксилируется, как при гликолизе в животных тканях, а восстанавливается с участием лактатде-гидрогеназы за счет водорода НАДН2 [3]. Таким образом, при молочнокислом брожении пирови-ноградная кислота (пируват) под действием фермента лактатдегидрогеназы восстанавливается в молочную кислоту (рис. 1). Оптимум рН реакции зависит от температуры, концентрации субстрата. Кроме того, для протекания реакции необходимо наличие в среде ионов магния, с которыми комплексно связывается молекула аденозинтрифосфорной кислоты в качестве кофермента.

Пировиноградная кислота образует комплекс фермент-субстрат, который в дальнейшем легко распадается с образованием уксусного альдегида, тиаминпирофосфата и углекислоты.

Скорость всей ферментативной реакции зависит непосредственно от кислотности среды и способности СС-оксигруппы отдавать свой протон. Большое значение имеет состав раствора, особенно рН и температура.

Гликолиз —— Спиртовое брожение

Рис. 1. Схема процесса молочнокислого (гомоферментатив-ного) и спиртового брожения НАД, НАДН2 - кофермент никотинамидадениндинуклеотид.

Важными в части оптимизации выделения молочной кислоты из сыворотки являются процесс молочнокислого брожения, применение оптимальных условий для роста культур микроорганизмов - продуцентов молочной кислоты и эффективность кислотообразования. В настоящее время применяются современные технические средства и способы разделения фаз при выделении, очистке и концентрировании растворов, что определяет получение целевого продукта более высокого качества [4].

Представляется целесообразным обоснование электрохимического способа получения молочной кислоты из вторичного сырья молочной промышленности - сыворотки, совмещающего

© Вуткарева И.И., Болога М.К., Электронная обработка материалов, 2015, 51(5), 107-111.

ее ферментацию молочнокислыми микроорганизмами и электролизное выделение образующейся кислоты, молекулы которой приобретают отрицательный заряд вследствие отщепления атома водорода.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Посредством таких факторов, как источники азота и углерода, рН, температура, способом предварительной обработки сыворотки с целью частичной депротеинизации можно влиять на жизнедеятельность культуры - продуцента молочной кислоты. В работе использованы штаммы L. acidophilus, среда культивирования - частично депротеинизированная, пастеризованная молочная сыворотка. Источник углерода в среде - лактоза сыворотки, источник азота - дрожжевой экстракт. Для приготовления дрожжевого экстракта дрожжи Sacchoromuces cerevisiae смешивали с дистиллированной водой в соотношении 3:1 и полученную суспензию с содержанием 600 г дрожжевых клеток в 1 литре воды разогревали при помешивании до 45 °С и выдерживали 18-24 часа. Для остановки процесса суспензию пастеризовали 5 минут при 93 °С, охлаждали, затем смешивали с закваской молочнокислых бактерий L. acidophilus. Закваска готовилась на пастеризованной, частично депротеинизирован-ной сыворотке ферментированием ее суспензией в соотношении 1:5 и культивированием более суток в термостате при 37°С без аэрации. Посевная доза - 5% 18-24-часовой культуры.

Тепловая обработка молочной сыворотки меняет биологическую ценность среды, делая ее более благоприятной для роста микроорганизмов, так как происходит частичный гидролиз лактозы и сывороточных белков с высвобождением более легкоусвояемых продуктов полураспада. Через 24, 48 и 72 часа измеряли количество ферментированной молочной кислоты.

Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) определяли методом 10-кратных разведений пробы и высевом на агаризованную среду MRS.

Количество кислоты (титруемую кислотность) определяли титрованием 0,1N гидрокси-дом натрия (количество молочной кислоты рассчитано в °Т - градусах Тернера). Идентификацию органических кислот проводили ядерно-магнитно-резонансной спектроскопией, определялось содержание молочной, уксусной, янтарной кислот, этанола [5]. Для дальнейшего получения молочной кислоты применяли обработку в электролизном устройстве. Предварительно для частичного осаждения белковых фракций сыворотки и предотвращения закупорки мембран применяли тепловую обработку: нагрев до 93°С

и выдержка 15 минут, центрифугирование.

Процесс электрообработки осуществляли в диафрагменном электролизере, разделенном ионоселективной мембраной, со стальным катодом и графитовым анодом. Электролиз проводили при начальных рН от 3,6 до 4,3. Величину тока контролировали в процессе эксперимента при постоянном напряжении 29 В. Отбор проб осуществляли из катодной камеры электролизера в процессе электрообработки. Так как расстояние между катодом и анодом составляет около 3 см, а катодное и анодное пространства разделяются диафрагмой, перемешивание и отбор электролита из отдаленных от катода зон исключаются. Отбор электролита из прилегающего к катоду слоя, исходя из толщины диффузионного слоя (около 0,1 см), проводился через равные промежутки времени после начала электролиза. Продолжительность опыта - 50 минут. Анодную камеру, камеру концентрирования заполняли слабым раствором электролита - 0,1% раствором КаНС03. Кроме того, проводились эксперименты по влиянию электрообработки на осветленную с добавлением гидрофосфатов кальция ферментируемую сыворотку с целью дальнейшей ферментации в катодной камере. Для этого сыворотку обрабатывали кислой солью фосфата Са - СаНР04:2Н20 и СаС12, увеличивая исходную концентрацию гидрофосфатов кальция на 10-15 ммоль/л [6].

Параллельно использовались предварительное термическое осаждение белка и ферментация сбраживаемой сыворотки в катодной камере электролизера с последующим получением молочной кислоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе обработки сыворотки и исследования влияния рН при разных видах брожения в первые 10 минут можно отметить резкое увеличение активной кислотности, обусловленное прежде всего миграцией ионов (рис. 2, 3). Затем рост активной кислотности замедляется, что связано с высокой титруемой кислотностью среды в катодной камере.

Исходя из полученных результатов можно сделать вывод о преимуществе образцов с более ферментированной (кислой) сывороткой, при которой происходит полная диффузия молочной кислоты из катодной камеры в камеру концентрирования. Кривые кислотосодержания нефер-ментированной и слабоферментированной сыворотки схожи и указывают на индентичность процессов кислотонакопления в сыворотке при рН 3,9-4,75.

Оптимальные результаты по концентрированию молочной кислоты получены в случае, когда

Рис. 2. Кислотонакопление в камере концентрирования электролизера: сыворотка неферментирована, рН исходной сыворотки 4,7 - 1; сыворотка ферментирована до: рН 3,6 -2; рН 3,7 - 3.

сыворотка сброжена до рН 3,7. Основной объем молочной кислоты, имеющейся в сыворотке, мигрирует в камеру концентрирования в первые 10 минут. Но сыворотка в катодной камере остается кислой, что указывает на возможность совмещения ферментации и электролизного получения молочной кислоты в ее чистом виде, а не лактата кальция с последующей обработкой серной кислотой, как принято в современном производстве.

Следует указать на максимально допустимую температуру процесса. Сильное нагревание сыворотки в течение длительного времени может привести к термической денатурации белковых фракций, нарушению структурных свойств среды и разрушению кислот. Исключение необратимых изменений составных частей сыворотки при температурном воздействии в процессе электрообработки обеспечивается подбором температурного режима и продолжительности концентрирования. В зависимости от условий - силы тока, кислотности среды - температура при электрообработке колеблется от 20 до 45°С. Такие факторы, как вязкость продукта, структура белковых фракций, кристаллизация лактозы, определяют целесообразный предел - около 45°С. Этим обеспечивается наиболее полное сохранение исходных свойств сыворотки.

При постоянном напряжении 29 В наблюдается рост температуры до 45 °С в случае сыворотки, сброженной до рН 3,7 (рис. 4).

Поскольку температура предопределяется силой тока в системе, сбраживание сыворотки в электролизере возможно при I ниже 1-1,2 А (рис. 5).

Параллельно, вместо предварительного теплового осаждения белка, для интенсификации коагуляции белковых соединений проводили опыты по выделению Р-лактоглобулина, увеличивая исходную концентрацию гидрофосфатов кальция на 10-15 ммоль/л. Сыворотку обрабаты-

Рис. 3. Зависимость кислотосодержания от продолжительности электрообработки. Катодная камера: сыворотка ферментирована до: рН 3,9 - 1; рН 4,3 (спиртовое брожение) -2; рН 3,7 - 3; сыворотка неферментирована, рН 4,7 и 4,75 - 4 и 5.

вали кислой солью фосфата Са - СаНР04:2Н20 и СаС12. Выделение белка с использованием гидрофосфатов кальция достигает насыщения при рН 6,6-7 [6]. Далее в осветленную таким методом сыворотку вносили лактосбраживающую культуру микроорганизмов и после 16-часовой ферментации при 37°С сыворотку подвергали электрообработке при малой силе тока (1-0,2 А) в течение 7 часов. Результаты представлены в табл. 1.

Токи малой величины (табл. 1) действуют несколько угнетающе на развитие молочнокислых бактерий, но стимулируют развитие дрожжевой микрофлоры. В ходе опыта (контроля) наблюдается пониженное количество микроорганизмов по сравнению с пробой, прошедшей электрообработку. То есть микроорганизмы в камере продолжали сбраживание сыворотки (титруемая кислотность в камере довольно высока), несмотря на то, что основной объем молочной кислоты мигрировал в камеру концентрирования.

Буферные свойства фосфатов проявляются во взаимном переходе гидрофосфатов в дигидро-фосфаты и обратно. При образовании кислоты часть гидрофосфатов переходит в более кислые дигидрофосфаты:

НР02"+ н+ ^ н2РО; .

Так как анион Н2РО4 слабо диссоциирует на Н+ и НРО42, то рН сыворотки почти не изменяется, а титруемая кислотность возрастает. Это объясняется тем, что при определении активной кислотности учитывают только ионы водорода, находящиеся в растворе. При определении титруемой кислотности в реакцию со щелочью вступают не только свободные, но и связанные Н-ионы.

Несовпадение активной и титруемой кислотности объясняется буферностъю сыворотки, которая обусловлена содержанием белков и смеси фосфа-

О 3 10 15 20 25 30 35 40 I. мин Рис. 4. Изменение температуры сыворотки при электрообработке: сыворотка ферментирована до: рН 3,7 - 1; рН 4,3 - 2; неферментированная сыворотка - 3.

1.Л

1,2

0,8

0,6

0.4

0,2

0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 I, мин Рис. 5. Изменение силы тока при электрообработке: сыворотка сброжена до: рН 3,7 - 1; рН 4,3 - 2; сыворотка неферментирована - 3.

Таблица 1. Показатели исходной, осветленной сыворотки до и после ферментации и электрообработки. Сбраживание в катодной камере

Опыт х, час рН °т КОЕ

ИМС 4,80 48

ОС 7,05

Культура 24 3,62 118 106

ОС+К до ферментации 5,08

ОС+К после ферментации 40 3,60 118 5000

КК после опыта 47 4,18 84 3200

ОС+К контроль 3,60 120 320

Условные обозначения: ИМС - исходная молочная сыворотка; ОС - осветленная сыворотка; К - культура молочнокислых бактерий; КОЕ - количество колоний микроорганизмов в 1 мл раствора, °Т - градусы Тернера.

Таблица 2. Сбраживание в катодной камере при I = 0,2 А

Т, мин рН, катодная камера Vтитр, катодная камера, оТ рН, анодная камера Vтитр, анодная камера, оТ

3,60 7,7

3,62 118

60 3,90 98 3,45 26

150 4,15 90 3,15 42

210 3,75 84 2,65 54

420 4,18 74 2,25 104

тов. Буферные свойства белков сыворотки объясняются наличием аминных и карбоксильных групп. Карбоксильные группы вступают в реакцию с образующейся молочной кислотой:

к/ + н+ \оо-

/

Соон

Кислотная диссоциация белков незначительна, поэтому активная кислотность остается почти прежней, а титруемая повышается.

При добавлении к сыворотке щелочи белки и соли реагируют следующим образом:

к

/ \

КН3

+ он-

к

соо-

н2ро- + он ^

/ \

ж2

+ Н2о

соо-

нро2 - +н2о,

н2гй - + он - ^ ж^2- + н2о.

При добавлении кислоты или щелочи рН сыворотки изменится, если будет превышена бу-

ферная емкость. Следовательно, чем больше в сыворотке содержится буферных веществ, тем больше потребуется кислоты для изменения рН.

Результаты применения только термического осаждения белка представлены в табл. 2.

Буферность биологических жидкостей имеет большое значение для живого организма, это своего рода защита от возможного резкого изменения рН, влияющего неблагоприятно (или губительно). Буферные свойства составных частей молока и сыворотки играют большую роль и при изготовлении кисломолочных продуктов и сыра. Так, рН кефира при титруемой кислотности 80°Т равен 4,76, что характерно для спиртового брожения. Аналогично в сыре при высокой титруемой кислотности рН составляет лишь 5,3-5,5, что объясняется буферными свойствами белков сырной массы.

При такой активной кислотности в продуктах и ферментируемых растворах возможно развитие

+

молочнокислых микроорганизмов, что и используется при сбраживании в катодной камере электролизера при малых токах. Лучший результат получен при предварительной ферментации сыворотки до pH 3,7 (рис. 6). Последние три пика на спектрограмме соответствуют содержанию уксусной, молочной кислот и этанола. Из данных спектроскопии видно, что культура L. acidophilus и дрожжи Sacchoromuces cereviae являются возбудителями гомоферментативного молочнокислого брожения, так как более 90% всех выделяемых органических кислот составляет молочная кислота.

OOf** fl — —t-VjTl- ■—СТ* ЧО вог-- i/V^V—

РО О*ч*itJ- -—.— "С*©

V>Vl Tf T?*? f| r'-fiT'-, r^n —— * * ' ' '

V V \\ II V I V V

5.0 4.5 4.0 3,5 3,0 2,5 2,0 1.5 1.(1

шмш—(г—' тпггш

Рис. 6. Спектроскопия сыворотки из катодной камеры, сброженной до рН 3,7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ферментация и последующая электрообработка с целью выделения молочной кислоты обусловлены высокой титруемой кислотностью раствора. Сдвиг рН среды в щелочную сторону сопровождается уменьшением биосинтеза лак-татдегидрогеназы.

Применение предварительного термического осаждения белковых фракций сыворотки, без внесения дополнительных фосфатов, обеспечивает чистоту полученной молочной кислоты.

Основной объем молочной кислоты переходит в анодную камеру в первые 10-15 минут (в опытах с предварительной ферментацией), далее молочная кислота частично окисляется до уксусной, и для получения молочной кислоты в чистом виде необходим электролизер с дополнительной мембраной в прианодной зоне.

Данный способ получения молочной кислоты позволяет сократить продолжительность обработки ферментированной сыворотки без перегрева и выделить молочную кислоту в чистом виде, а не лактаты, получать Ь(+)-форму молочной кислоты при оптимальных режимах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Свириденко Ю.Я., Волкова Т.А. Эффективный подход к переработке молочной сыворотки.

Молочная промышленность. 2012, (7), 44-46.

2. Евелева В.В. Технологические инновации в производстве пищевой молочной кислоты. Пищевая промышленность. 2014, (4), 26-28.

3. Илушка И.В., Доценко С.П. Влияние основных факторов процесса культивирования на кислотообразующую способность продуцента молочной кислоты Lactococcus lactis CH5. Научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2012, 82(8), 1-10.

4. Патент РФ №2469548 С1 Легарт Еис Хеффнер (ДК). Гомоферментатированные продукты. Опубликовано: 2010.08.27.

5. William A. Bubb. NMP Spectroscopy in the Study of Carbohydrates: Characterizing the Structural Complexity. ConceptMagn Reson A. 2003, 19A(1), 1-19.

6. Патент РФ № 2065703 С1 Болога М.К., Пыргару Ю.М., Наконечная Л.А. Способ изоэлектрической коагуляции белков молочной сыворотки и электролизер для его осуществления. Опубликовано: 1996.08.27.

Поступила 14.07.15

Summary

The expediency of combining fermentation of whey and electrophoretic isolation of the formed lactic acid, which ensuring a high degree of lactose utilization, is substantiated. The scheme of the treated whey lactose fermentation by L. acidophilus thermo-resistant lactic acid bacteria and the yeast extract was worked out. Further production of lactic acid takes place in the diaphragm electro-lyzer chamber. So, at a low current density, which allows maintaining the necessary temperature and duration of electrolysis, favorable conditions are created for the formation of lactic acid. The fermentative hydrolysis and electro-physical isolation of lactic acid are promising in solving the problems of utilization of lactose in an ecologically friendly way.

Keywords: lactic acid, fermentation, electrolyzer.