CC BY
69
№ 1 (56)
А, UNIVERSUM:
/YV\ МЕДИЦИНА И ФАРГ
ФАРМАКОЛОГИЯ
март, 2019 г.
ОНКОЛОГИЯ
ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ
ПРЕПАРАТАМ
Черёмин Андрей Михайлович
канд. биол. наук, Казанский (Приволжский) федеральный университет /Институт фундаментальной медицины и биологии /Виртуальная OpenLab, «Генные и клеточные технологии»,
РФ, Казань E-mail: andrey4eremin@mail.ru
OBTAINING CELL LINES RESISTANT TO CYTOTOXIC DRUGS
Andrey Cheremin
Candidate of Biological Sciences, Kazan (Volga region) federal university / Institute offundamental medicine and biology / Virtual OpenLab "Gene and cell technologies",
Russia, Kazan
АННОТАЦИЯ
Онкологические заболевания характеризуются высоким уровнем заболеваемости и смертности во всем мире. Химиотерапия является одной из распространенных форм лечения, но резистентность раковых клеток представляет собой критическую проблему при проведении терапии. В настоящей работе мы получили новые клеточные линии рака лёгких (A549), предстательной железы (PC3) и шейки матки (HeLa) с различными индексами резистентности к цитостатическим препаратам (Цисплатин, Доцетаксел (Таксотер®)). Индекс резистентности клеточных линий A549/Docetaxel, PC3/Docetaxel и HeLa/Cis-Pt составил соответственно 18, 17 и 4,6. Время удвоения резистентных клеток было пролонгированным по сравнению с исходными линиями. С помощью микроскопии был показан мезенхимальный тип строения резистентных клеточных линий. Данные наблюдения позволяют предположить о проявлении эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП).
ABSTRACT
Cancer is characterized by a high incidence and mortality rate worldwide. Chemotherapy is one of the most common forms of treatment, but the resistance of cancer cells represents a critical problem during therapy. In the present study we obtained new cell lines of lung cancer (A549), prostate (PC3) and cervix (HeLa) with different indices of resistance to cytostatic drugs (Cisplatin, Docetaxel (Taxotere®)). The A549/Docetaxel, PC3/Docetaxel and HeLa/Cis-Pt cell lines had a resistance index 18, 17 and 4,6 respectively. The doubling time of resistant cells was prolonged compared to baselines. Using microscopy, the mesenchymal type of structure of resistant cells was shown. These observations suggest a manifestation of the epithelial-mesenchymal transition (EMT).
Ключевые слова: Резистентные клеточные линии, рак лёгкого, рак простаты, рак шейки матки, Доцетаксел, Цисплатин
Keywords: Resistant cell lines, lung cancer, prostate cancer, cervical cancer, Docetaxel, Cis-Pt
Вступление
Частота возникновения онкологических заболеваний неуклонно растет по всему миру. К сожалению, лечение, во многих случаях, является малоэффективным. Химиотерапия - одна из разновидностей воздействия на опухолевые клетки, основанная на применении химических препаратов. При проведении первичной химиотерапии, может происходить ремиссия заболевания. Однако, по истечении некоторого времени, клетки могут начать делиться вновь, образуя новые опухоли. Это связано с тем, что опухолевые клетки приобретают устойчивость к вводимому ве-
ществу. В связи с этим, проводят вторичную химиотерапию (и, если необходимо, последующие) с использованием комбинаций других препаратов.
По данным GLOBOCAN 2018, IARC (Международного Агентства по Исследованию Рака) Российская Федерация в 2018 году занимает 5-е место в мире по числу смертей онкологических больных [GLOBOCAN, 2018]. В Российской Федерации в 2017 году около 40% пациентов с онкологическими заболеваниями диагностировались на 3-4 стадиях развития патологии [Ка-прин, Старинский, 2018]. Эти стадии характеризуются метастатическим процессом. Метастазы в отдельных органах, в первую очередь костном мозге, тяжелее поддаются химиотерапевтическому воздействию, и, как
Библиографическое описание: Черёмин А.М. Получение клеточных линий, резистентных к цитостатическим препаратам // Universum: Медицина и фармакология: электрон. научн. журн. 2019. № 1(56). URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/6988
№ 1 (56)
А, UNIVERSUM:
/YV\ МЕДИЦИНА И ФАРГ
ФАРМАКОЛОГИЯ
следствие, могут явиться очагом зарождения резистентных клеток. Следовательно, для нашей страны, в условиях низкой эффективности ранней диагностики онкологических заболеваний, проблема резистентности стоит острее, чем для стран с активно действующими государственными программами по диагностике рака. На наш взгляд, проблема может быть решена несколькими подходами: а) введение ежегодных обязательных программ по диагностике заболевания у населения; б) создание платформы для поиска противоопухолевых препаратов, учитывающих генетические и функциональные характеристики опухолей у пациентов РФ. Если на осуществление первого подхода у нас уйдет десятилетие, то получение тщательно охарактеризованных резистентных клеточных линий и тестирование кандидатов в препараты на таких линиях, возможно уже в ближайшее время. Создание и изучение новых резистентных клеточных линий позволит глубже понимать механизмы устойчивости к химиотерапевтиче-ским препаратам.
Образование резистентности клеточных линий сопряжено с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП) [Shen et al., 2014]. Эпителиально-мезенхималь-ный переход - это процесс, при котором эпителиальные клетки претерпевают морфологические изменения, связанные с переходом клеток к мезенхимальному типу строения. ЭМП, помимо участия в онтогенезе, также известен как патологический механизм, сопутствующий различным заболеваниям, включая воспаление, фиброзы и рак. Процесс ЭМП широко известен при образовании первичных и метастазирующих опухолей. Также ЭМП связан с образованием механизмов резистентности опухолевых клеток [Di Meo et al., 2009; Shen et.al, 2014].
В данной работе мы получили клеточные линии рака лёгких (A549), предстательной железы (PC3) и шейки матки (HeLa), резистентных к наиболее часто используемым цитостатическим препаратам (Цисплатин, Доцетаксел (Таксотер®). Морфологически было показано наличие мезенхимального типа строения клеток, что позволило предположить о проявлении эпители-ально-мезенхимального перехода при обретении клетками состояния резистентности.
Материалы и методы
1. МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ
Клеточные линии A549, PC3 и HeLa были приобретены в компании «ATCC» (Роквилл, МД, США). Препарат «Цисплатин» приобретен в компании «Тева» (Петах-Тиква, Израиль), «Доцетаксел» в «Авентис Фарма» (Дагенхэм, Великобритания). Реагент МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолиум бромид) был приобретён в компании «Sigma-Aldrich» (Сент-Луис, США). FBS (Эмбриональная бычья сыворотка) была приобретена в компании «Life Technologies Corporation» (Гранд Айлэнд, Нью-Йорк, США). Среда RPMI-1640 и антибиотики «Пенициллин/стрептомицин» 100х, были приобретены в компании «Панэко» (Москва, Россия).
2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ
ЛИНИЙ И ПОЛУЧЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
март, 2019 г.
Клеточные линии A549, PC3 и HeLa культивировались в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и 1х антибиотиков Пенициллин/Стрептомицин. Клеточные линии культивировались в СО2-инкубаторе при температуре 370С с 5% содержанием CO2.
Клеточные линии обрабатывали соответствующими препаратами с увеличением концентрации: A549/Docetaxel (от 0,25 нмоль/л до 20 нмоль/л), PC3/Docetaxel (от 0,25 нмоль/л до 20 нмоль/л), Hela/CisPt (от 0,65 мкмоль/л до 26 мкмоль/л). Препараты добавлялись по достижении культурой 70% кон-флюэнтности. Клеточные линии культивировались от 2 до 4 дней на каждой концентрации, с последующим пересевом. Для поддержания резистентного фенотипа добавляли концентрации препаратов: A549/Docetaxel -20 нмоль/л, PC3/Docetaxel - 20 нмоль/л, Hela/CisPt - 26 мкмоль/л.
3. Оценка цитотоксичности препаратов
Для оценки чувствительности клеточных линий A549/Docetaxel (20 нмоль/л), PC3/Docetaxel (20 нмоль/л) и Hela/CisPt (26 мкмоль/л) к соответствующим препаратам, применяли МТТ-тест. Клеточные линии инкубировали, по достижении клетками 80-90% конфлюэнтности, их количество считали в камере Го-ряева. Клеточную суспензию разводили красителем Трипановым синим («Sigma Aldrich», США) в соотношении 1:1. Далее, клетки засевали в 96-луночные планшеты в количестве 2*104 клеток на 1 лунку. Далее клеточные линии инкубировали в течение 24 часов перед добавлением соответствующего препарата в линейно-возрастающих концентрациях. Клеточные линии без добавления препарата служили в качестве контроля. На 72 час культивирования аспиратором убирали среду и к клеткам добавляли 10 мкл (5 мг/1 мл PBS) реагента МТТ и 90 мкл свежей среды. Клетки инкубировали 3 часа при 370С. Содержимое лунок аспирировали, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл DMSO. Светопоглощение измеряли на планшетном спектрофотометре Infinite M200 Pro («Tecan», Швейцария) при Х=555 нм, используя длину волны А=650 нм в качестве референсной [Mossman, 1983]. Далее оценивали IC50 обработанных и необработанных препаратом клеток. Индекс резистентности (RI) считали, как отношение IC50 клеточной линии, обработанной препаратом, к IC50 необработанной клеточной линии.
4. Отслеживание кривых роста исходных и резистентных клеточных линий
Исходные и резистентные клеточные линии собирали, считали в камере Горяева и рассевали в 96-луноч-ные планшеты в количестве 1х103 клеток на лунку. Каждый день, начиная со второго до пятого дня, для оценки пролиферации с помощью МТТ-теста, использовали отдельный 96-лучночный планшет.
5. Статистическая обработка данных
Статистический анализ проводили в программе
Microsoft Excel, пакета программ Microsoft Office 2013. Данные представляли в виде средних значений ± стандартное отклонение. Статистическую значимость оценивали используя t-критерий Стьюдента; значения p<0,05 считали статистически значимыми.
Результаты исследования
№ 1 (56)
АиМ1УЕВ5иМ:
/уу\ МЕДИЦИНА И ФАРГ
ФАРМАКОЛОГИЯ
Цисплатин- и Доцетаксел-резистентные клеточные линии были получены пошаговым добавлением концентраций препаратов в течение 4 месяцев. Начальная концентрация составляла 5% от ГС50. Последующие концентрации подбирались произвольно
март, 2019 г.
(первые 5 концентраций не превышали 10% от 1С50). Таким образом, мы получили клеточные линии A549/Docetaxel, РС3Юосегахе1 и HeLa/Cis-Pt, с индексом резистентности 18, 17 и 4,6 соответственно (таблица 1).
Таблица 1.
Значения 1С50 исходных и резистентных клеточных линий
Клеточная линия 1С50 М Р
А549 1,9 ±0,06 18 <0,05
А549/Оосе1ахе1 35,6 ±2,28
РС3 2,0±0,12 17 <0,05
РС3/Оосе1ахе1 33,8 ±6,6
Не1а 13,2±0,57 4,6 <0,05
HeLa/Cis-Pt 60,3± 8,6
Мы провели эксперименты по определению пролиферации клеточных линий. Проводили сравнительный анализ кривых роста исходной и соответствующей резистентной клеточной линии.
2
1,8 1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
гч о
О
-А549/Оос/20пМ -А549
3
Дни
Рисунок 1. Кривые роста исходной клеточной линии A549 и линии A549/Doc/20nM, обладающей
резистентностью к Доцетакселу
Как видно из Рисунка 1, клеточная линия А549/Оос/20пМ, обладающая резистентностью к До-цетакселу, на 4-5 день роста имеет меньшее время
удвоения, что свидетельствует о замедленных проли-феративных свойствах данной резистентной клеточной линии.
1,6
1,4
м 1,2
н 1
2
9 4 0,8
Д 0,6
О 0,4
0,2
0
3
Дни
■РС3
РС3/Бос/20пМ
2
4
5
1
2
4
5
Рисунок 2. Кривые роста исходной клеточной линии PC3 и линии PC3/Doc/20nM, обладающей
резистентностью к Доцетакселу
№ 1 (56)
Jk UNIVERSUM:
/W\ МЕДИЦИНА И ФАРГ
ФАРМАКОЛОГИЯ
март, 2019 г.
Как видно из Рисунка 2, клеточная линия РС3/Оос/20пМ, обладающая резистентностью к До-цетакселу, на 4-5 день роста имеет меньшее время
удвоения, что также свидетельствует о замедленных пролиферативных свойствах данной резистентной клеточной линии.
2,5 2
S
* 1,5
Ov
П 1 О
0,5 0
3
Дни
■Hela
■HeLa/CisPt/26uM
Рисунок 3. Кривые роста исходной клеточной линии НеЬа и линии НеЬа/С18РР^26иМ, обладающей
резистентностью к Цисплатину
Как видно из Рисунка 3, клеточная линия ИеЬа обладает большей пролиферацией, чем линии А549 и РС3. Клетки ИеЬа, обладающие резистентностью к химиотерапевтическому препарату Цисплатину, также имеют меньшее время удвоения, что свидетельствует о замедленных пролиферативных свойствах, данных резистентных клеточных линий.
Таким образом, мы показали, что полученные нами резистентные клеточные линии имеют меньшую скорость пролиферации по сравнению с исходными раковыми клетками, что подтверждает наличие
резистентности у новых клеточных линий [МсБегшой еГ а1., 2014].
Мы провели анализ клеток с помощью световой микроскопии. Во всех резистентных клеточных линиях наблюдалось изменение морфологии: от эпителиальных клеток с одинаковой формой и пограничным расположением друг к другу, клетки перешли к «мезенхимальному» типу строения - появилась разрозненность форм и образовалось расстояние между клетками (рисунок 4).
1
2
4
5
Hela HeLa/Cis-Pt/26uM
Рисунок 4. Образование мезенхимального типа морфологии клеток на примере НеЬа/С18-Р/26иМ
клеточной линии
Данные наблюдения позволяют предположить о проявлении эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). По данным литературы, ЭМП ассоциирован с образованием механизмов резистентности [Б1Мео еГ а/., 2009].
Обсуждение
На сегодняшний день одной из важнейших проблем неблагоприятного исхода терапии онкологиче-
ских заболеваний является хеморезистентность раковых клеток. Ранее было показано, что клеточный фенотип имеет взаимосвязь с феноменом резистентности [МаБек! е( а1., 2012]. Клетки с мезенхимальным типом строения являются более устойчивыми к химиотерапии, чем клетки с эпителиальным типом.
В Российской Федерации отсутствует платформа тщательно охарактеризованных резистентных клеточных линий, с помощью которой возможно будет
№ 1 (56)
UNIVERSUM
МЕДИЦИНА И
ФАРМАКОЛОГИЯ
март, 2019 г.
искать новые противоопухолевые препараты, учитывая генетические особенности опухолей каждого конкретного пациента. В данной работе мы получили резистентные клеточные линии рака лёгких (А549), предстательной железы (РС3) и шейки матки (HeLa) с различными индексами резистентности к цитоста-тическим препаратам (Цисплатин, Доцетаксел (Таксотер®)). Мы показали основные характеристики клеток, такие как скорость пролиферации и анализ морфологии, указывающий на изменение
типа строения клеток с эпителиального на мезенхи-мальный, что соответствует образованию устойчивости к препаратам.
Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Благодарности
Список литературы:
1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность) // М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. - илл. - 250 с. ISBN 978-5-85502-243-8.
2. DiMeo T.A.; Anderson, K.; Phadke, P.; Fan, C.; Perou, C.M.; Naber, S.; Kuperwasser, C. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Res. 69:5364-73; 2009.
3. Kudo-Saito C.; Shirako, H.; Takeuchi, T.; Kawakami, Y. Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells. Cancer Cell 15:195-206; 2009.
4. Tsuji, T.; Ibaragi, S.; Hu, G. F. Epithelial-mesenchymal transition and cell cooperativity in metastasis. Cancer Res.69:7135-9; 2009.
5. Fuchs B.C.; Fujii, T.; Dorfman, J.D.; Goodwin, J. M.; Zhu, A.X.; Lanuti, M.; Tanabe, K.K. Epithelial-to mesenchy-mal transition and integrin-linked kinase mediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells. Cancer Res. 68:2391-9; 2008.
6. Christiansen J.J.; Rajasekaran, A.K. Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis. Cancer Res. 66:8319-26; 2006.
7. Cheng G.Z.; Chan, J.; Wang, Q.; Zhang, W.; Sun, C.D.; Wang, L.H. Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration, invasion, and resistance to paclitaxel. Cancer Res. 67:1979-87; 2007.
8. GLOBOCAN 2018. http://gco.iarc.fr/
9. Shen W., Pang H., Liu J., Zhou J., Zhang F., Liu L., Ma N., Zhang N., Zhang H., and Lili Liu. Epithelial-Mesenchy-mal Transition Contributes to Docetaxel Resistance in Human Non-Small Cell Lung Cancer. Oncology Research, Vol. 22, pp. 47-55.
10. Maseki, S.; Ijichi, K.; Tanaka, H.; Fujii, M.; Hasegawa, Y.; Ogawa, T.; Murakami, S.; Kondo, E.; Nakanishi, H.Ac-quisition of EMT phenotype in the gefitinib-resistant cells of a head and neck squamous cell carcinoma cell line through Akt/GSK-3beta/snail signalling pathway. Br. J. Cancer 106:1196-204; 2012.
11. Mossmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16;65(1-2):55-63.
