CC BY
100
Трансформирующий фактор роста бета-1 в онкогенезе аденокарциномы легкого человека
CV
В.Е. Шевченко1, И.С. Брюховецкий2, 3, З.Н. Никифорова1, С.В. Ковалев4, И.А. Кудрявцев1, Н.Е. Арноцкая1 о
1НИИ канцерогенеза ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» о
Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2 2Школа биомедицины ФГАОУВПО «Дальневосточный федеральный университет»; Россия, 690091 Владивосток, ул. Суханова, 8;
3ФГБУН «Национальный научный центр морской биологии» Дальневосточного отделения РАН; в*
Россия, 690059 Владивосток, ул. Пальчевского, 17; g
4химический факультет ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; ш
Россия, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3, ГСП-1 в
Контакты: Валерий Евгеньевич Шевченко [email protected]
Введение. Трансформирующий фактор роста бета-1 (transforming growth factor beta 1, TOF-fil) является одним из наиболее важных тканевых факторов, секретируемых при развитии эпителиальных опухолей. Повышенная экспрессия TOF-fil в злокачественных опухолях легких способствует ангиогенезу, супрессии иммунной системы, а также выживанию раковых клеток, увеличивая их рост, миграцию, инвазию.
Цель работы — изучение молекулярных механизмов действия TOF-fil на клетки A549 аденокарциномы легкого человека методом протеомной масс-спектрометрии высокого разрешения.
Результаты. Идентифицированы некоторые внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за участие TOF-fil в онкогенезе немелкоклеточногорака легкого и включающие, в том числе, дифференциально экспрессированные белки семейств куллинов, онкогенов ETS, диацелаз гистонов, циклинзависимых киназ, сигнального пути фосфатидилинозитол-3-киназы (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K).
Заключение. Установлены важные закономерности, которые могут быть использованы при разработке новых подходов для обнаружения кандидатных маркеров метастазирования рака легкого и потенциальных мишеней для терапии этого заболевания.
Ключевые слова: трансформирующий фактор роста бета-1, аденокарцинома легкого, протеом, масс-спектрометрия, эпителиально-мезенхимальный переход
DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-3-67-74
The transforming growth factor beta-1 in the oncogenesis of human lung adenocarcinoma
V.E. Shevchenko1, I.S. Bryukhovetskiy2,3, Z.N. Nikiforova1, S.V. Kovalev4, I.A. Kudryavtsev1, N.E. Arnotskaya1
Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia;
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia;
2Biomedicine School, Far Eastern Federal University; 8 Sukhanova St., Vladivostok 690091, Russia;
3National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Brach, Russian Academy of Sciences; 17Pal'chevskogo St., Vladivostok 690059, Russia;
4Department of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University; OSP-1, Build. 3, 1 Leninskie Oory, Moscow 119991, Russia
Background. The transforming growth factor beta 1 (TOF-^1) is one of the most important tissue factors secreted by the development of epithelial tumors. Increased expression of TOF-fi1 in lung tumors promotes cancer cells survival enhancing their growth, migration, invasion, angiogenesis, immune system suppression.
Objective: to study molecular mechanisms of TOF-^1 action on A549 human lung adenocarcinoma cells by means of proteomic high-resolution mass spectrometry.
Results. Intracellular signaling pathways responsible for the involvement of TOF-^1 in the oncogenesis of non-small cell lung cancer have been found, which include the differential expressed proteins of the families of cullin, ETS oncogenes, histone diacelases, cyclin-dependent kinases, and the signaling pathway phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K).
Conclusions. Important patterns are determined that could be used for the development of new approaches for detection of lung cancer metastasis candidate markers and potential therapy targets of this decease.
Key words: transforming growth factor beta 1, lung adenocarcinoma, proteome, mass-spectrometry, epithelial-mesenchymal transition
и
Ш
u
CV
со
ев
и ш u
ж ш
и
Введение
Рак легкого (РЛ) занимает одно из первых мест в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей во всем мире [1,2]. Немелкоклеточ-ный РЛ (НМРЛ) является основным гистологическим подтипом (~80 %) этого заболевания и часто коррелирует с метастазированием опухоли. При НМРЛ метастазы в лимфатические узлы и инвазия опухолевых клеток в соседние органы считаются наиболее важными показателями неблагоприятного прогноза [3]. Поэтому в последнее время уделяется повышенное внимание изучению сигнальных путей, вовлеченных в процесс метастазирования РЛ. Лучшее понимание молекулярных механизмов онкогенеза РЛ, идентификация молекулярных детерминант и маркеров метастатической активности раковых клеток в конечном счете обеспечат новые и эффективные методы лечения этого заболевания.
Несмотря на то что многие исследователи изучали генетические и молекулярные особенности РЛ для разработки более совершенных методов лечения, терапия РЛ по-прежнему остается сложной проблемой из-за взаимодействия между раковыми клетками и окружающей микросредой. Клетки РЛ, как и некоторые другие трансформированные клетки, часто подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП), иногда при участии фибробластов [4]. При ЭМП эпителиальные клетки теряют свои межклеточные контакты и апикальную базальную полярность, реорганизуют свой цитоскелет, секретируют протеины внеклеточного матрикса, и, таким образом, трансдифференцируются в мезенхимальные подвижные клетки [5].
Индукция ЭМП приводит к изменению пластичности в архитектуре эпителиальных тканей и метастатической инвазивности многих карцином, однако до конца его роль остается неясной. Недавние исследования связывают ЭМП с генерацией опухолевых стволовых клеток [6]. Стромальные клетки РЛ секретируют такие молекулы, как трансформирующий фактор роста бета 1 (transforming growth factor beta 1, TGF-pi), которые вызывают ЭМП в опухолевых клетках, облегчая их инвазию, стволовость и метастазиро-вание. TGF-pi — один из наиболее важных тканевых факторов, секретируемых при развитии эпителиальных опухолей. Он может вызывать прогрессию и метаста-зирование опухоли по аутокринному механизму, подавляя иммунитет, усиливая ангиогенез и деградацию внеклеточного матрикса [7, 8]. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что активация TGF-pi-пути является одной из основных причин неблагоприятного прогноза [9]. Показано, что у больных РЛ повышены уровни TGF-pi в плазме крови как исходные, так и после лучевой терапии [10].
Свои различные эффекты TGF-P1 осуществляет через сложную сеть лиганд-рецепторных взаимодействий, проводящих соответствующие сигналы. В кан-
церогенезе TGF-pi может выполнять двоякую роль: в зависимости от стадии и типа опухоли он действует как супрессор опухоли или как канцерогенный фактор. Такое переключение от опухолевой супрессии к онко-генной активности также известно как «парадокс TGF-P» [11]. Несмотря на заметный прогресс в изучении TGF-p-сигнального пути, его роль в онкогенезе РЛ недостаточно ясна. Существующие в настоящее время данные указывают на важную роль TGF-p-сигнального пути на поздних этапах развития опухолевого процесса при РЛ, включая метастазирование, и делают его потенциальным кандидатом для таргетной терапии.
Цель работы — изучение молекулярных механизмов действия TGF-pi на линию клеток А549 аденокарци-номы легкого человека методом протеомной масс-спектрометрии высокого разрешения. Впервые идентифицирован ряд внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за участие TGF-pi в онкогенезе НМРЛ, что позволило обнаружить новые потенциальные маркеры метастазирования, мишени для таргетной терапии РЛ, часть из которых в перспективе может быть провалидирована и использована в практической медицине при разработке новых подходов для диагностики и терапии НМРЛ — одного из наиболее тяжелых онкологических заболеваний.
Экспериментальная часть
Клеточные культуры. Клетки линии А549 адено-карциномы легкого человека (American Type Culture Collection, США) культивировали в пластиковых флаконах 75 см2 (Corning Costar, США) при температуре 37 °С в увлажненной атмосфере с 5 % СО2 в среде RPMI-1640 с глутамином, с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). При достижении 70 % монослоя при смене среды в контрольные флаконы с клетками добавляли 75 мкл фосфатного буферного раствора (ФБР), в опытные флаконы вносили в том же объеме TGF-P1 в ФБР в концентрации 5 нг/мл и инкубировали в течение 72 ч. Клетки снимали раствором Версена (1 мл) и дважды отмывали ФБР (1 мл) центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 мин. Все клеточные линии выращивали в 3 экземплярах, независимо обрабатывали и анализировали.
Подготовка образцов для масс-спектрометрическо-го анализа. Трипсинолиз высушенных лизатов про -водили по ранее описанной методике [12]. По 4 мкл растворов полученных пептидов анализировали масс-спектрометрически для контроля проведения трип-синолиза [12]. По окончании реакции содержимое пробирок упаривали досуха при температуре 30 °С на центрифужном испарителе CentriVap (Labconco, США), а затем подвергали лиофильной сушке в течение ночи для полного удаления бикарбоната аммония.
Триптические пептиды растворяли в подвижной фазе А (30 % ацетонитрила (ACN), 70 % воды, 0,1 % муравьиной кислоты, рН 2,7) с таким расчетом, чтобы в 20 мкл раствора содержалось 100 мкг общего белка, и разделяли на хроматографе Dionex Ultimate 3000 (Нидерланды!), снабженном коллектором фракций, на кати-онообменной колонке MIC-10-CP (материал Poros 10S, 1 мм х 10 см, Dionex) [12]. Полученные 24 фракции упаривали досуха при температуре 30 °С на центрифужном испарителе и перерастворяли в 100 мкл 0,1 % водного раствора муравьиной кислоты.
Масс-спектрометрический анализ. Анализ триптиче-ских пептидов проводили на нанопроточном хроматографе Dionex Ultimate 3000 (Нидерланды), соединенном с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo, США) и снабженном электроспрейным источником ионизации. Хроматографирование пептидов осуществляли на колонке Acclaim C18 PepMap100 (75 мкм х 150 мм, размер зерна 3 мкм, Dionex), снабженной предколонкой Acclaim C18 PepMap (300 мкм х 5 мм, размер зерна 5 мкм). Масс-спектры регистрировали в режиме положительных ионов в диапазоне m/z 300—2000 Да [12].
Для идентификации белков использовали программу MaxQuant v1.5.2.8. Количественный расчет проводили методом label-free (без метки) для всех обнаруженных пептидов. Таблицу полученных белков обрабатывали в программе Perseus v1.5.1.6 для аннотирования и удаления белков-контаминантов и ложно-положительных идентификаций, а также для определения статистической значимости различий в уровнях белков, полученных методом label-free. Значимыми считали различия при уровне достоверности p <0,05 для парного /-критерия Стьюдента.
Результаты
Как было сказано, в работе использовали label-free количественный протеомный метод нано-ВЭЖХ-МС/МС для детектирования и сравнения дифференциально экспрессированных белков (ДЭБ) в лизатах линии клеток аденокарциномы легкого человека А549 до и после обработки их TGF-1ß. Анализ триптических пептидов по их МС/МС-спектрам с помощью программного пакета MaxQuant идентифицировал 2402 протеина по 15 597 (13 246 уникальным) пептидам при сравнении с данными базы SwissProt_human и ложным уровнем обнаружения (false discovery rate, FDR) 1 % для тройных повторов 2 видов образцов. Из них 2209 белков идентифицировали по 15 090 (12 764 уникальных) пептидам в контрольных клетках A549, 2135 — по 14 898 (12 582 уникальных) пептидам в клетках А549 после стимуляции TGF-1ß. Для всех линий клеток ~92 % белков идентифицировали по 2 и более пептидам. Коэффициент корреляции Пирсона для данных от образцов клеток А549 до и после стимуляции TGF-ß1 изменялся от 0,894 до 0,960.
Идентифицированные протеины показали высокий процент перекрытия для 2 клеточных популяций.
Во всех клеточных лизатах детектировались 1942 белка (81 % от 2402), 267 протеинов — только в контрольных клетках A549 и 193 протеина были уникальными для клеток A549 после их стимуляции TGF-P1.
Статистически значимые (p <0,05) изменения в экспрессии после обработки клеток TGF-P1 зарегистрировали для 632 белков, из них 537 протеинов изменяли экспрессию более чем в 2 раза, 234 — увеличивали, а 303 — уменьшали. Эти белки рассматривали как дифференциально экспрессированные. Повышение экспрессии более чем на порядок наблюдали у 110 ДЭБ и более чем в 100 раз у 7 ДЭБ с индексами генов TRHDE, ZFR, EVI5, GVINP1, VPS8, MAP7D2, CNTRL. Снижение экспрессии после обработки TGF-P1 клеток A549 более чем в 10 раз зарегистрировали у 30 белков, среди которых BRK1, PC4, CHD4, ASPH, SNRPG.
В табл. 1, построенной с использованием энциклопедии метаболических путей KEGG PATHWAY (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) и GO (Gene Ontology) биологических процессов, представлен список из 24 идентифицированных ДЭБ, участвующих в канцерогенезе. Как видно из табл. 1, при действии TGF-P1 увеличивали экспрессию более чем в 2 раза 8 протеинов и снижали — 16. Обнаружены 11 протеинов, участвующих в онкогенезе НМРЛ, и 10 белков для мелкоклеточного РЛ. Из них 3 белка, кодируемые генами CDK4, CDK6 и PIK3CA, относились к обеим гистологическим формам РЛ. При действии TGF-P1 на клетки А549 экспрессия циклинзависимой киназы 4 и 6 (cyclin-dependent kinases 4, 6, CDK4, 6) снижалась в 5,51 и 4,94 раза соответственно, тогда как экспрессия каталитического альфа полипептида фосфатидилино-зитол-3-киназы увеличивалась в 23,14 раза.
ДЭБ классифицировали в соответствии с их биологической ролью в клетке с помощью протеомно-геномной аналитической программы PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships, www.pantherdb.org). Число протеинов в каждой категории биологического процесса, увеличивающих (Up) или уменьшающих (Down) экспрессию в клетках А549 после их стимуляции TGF-P1, представлена в табл. 2. В среднем отношение Up/Down составляет 0,72, указывая на то, что снижение экспрессии превалирует над ее повышением у идентифицированных белков практически во всех категориях биологических процессов при действии TGF-P1. Только для процессов, связанных с ответом на стимулы и репродукцией, число Up- и Down-протеинов сравнивается.
Обсуждение
Цитокин TGF-P1 играет важную роль в эпителиальном онкогенезе [13—16]. На ранних стадиях онкогене-за TGF-P1, как правило, функционирует как опухолевый супрессор. На более поздних этапах, однако, когда опухоли растут и прогрессируют, TGF-P1 синтезируется как раковыми, так и стромальными клетками в пределах микросреды опухоли как естественный
CV
CS
и ш u
ж ш
и
Таблица 1. Дифференциально экспрессированные белки, участвующие в канцерогенезе
о
N Немелкокле- Мелкокле- Участие A549 + TGF-P1/A549
- Индекс гена Белок точный рак точный рак в канцероге-
СО легкого легкого незе
CS
И
ш u
X ш
и
APPL1 Адапторный протеин взаимодействия фосфотирозина + 0,27
BAX Ассоциированный с BCL-2 протеин Х + 0,12
BIRC2 Бакуловирусный IAP протеин 2, содержащий повтор + + 2,24
CDC42 Белок 42 клеточного цикла деления + 0,24
CUL2 Куллин 2 + 10,37
CDK4 Циклинзависимая киназа 4 + + + 0,18
CDK6 Циклинзависимая киназа 6 + + + 0,20
CRKL Гомолог протеина онкогена v-crk вируса саркомы CT10 + 0,16
CTBP1 С-терминальный связывающий протеин 1 + 2,37
CTNNA1 Катенин альфа 1 + 0,10
ETS1 Гомолог 1 онкогена v-ets вируса эритробластоза E26 + 69,41
HDAC1 Диацетилаза гистонов 1 + 0,08
HDAC2 Диацетилаза гистонов 2 + 0,22
ITGB1 Интегрин бета 1 + + 0,14
MAPK1 Митогенактивируемая протеинкиназа 1 + + 0,54
MAP2K2 Митогенактивируемая протеинкиназа 2 + + 0,41
MSH2 mutS гомолог 2 + 2,62
NRAS Гомолог онкогена RAS нейробластомы + + 0,43
PIK3CA Каталитический альфа-полипептид фосфатидилинозитол-3-киназы + + + 23,14
RHOA Гомолог семейства RAS, член А + 2,10
RAC1 Гуанозинтрифосфатсвязывающий протеин RAC1 + 0,54
TCEB1 Полипептид 1 фактора B элонгации транскрипции + 4,10
TCEB2 Полипептид 2 фактора B элонгации транскрипции + 0,40
TPR Белок транслоцированной промоторной области + 0,54
ответ на гипоксию и воспаление и может выступать в качестве мощного промоутера нескольких этапов метастатического процесса. К ним относятся не только локальная подвижность/инвазия и поступление раковых клеток в кровоток (интравазация), но также их выход из кровеносных сосудов (экстравазация) и выживание в отдаленных органах [ 17—20]. Значение ТОБ-р1 в прогрессировании заболевания особенно велико в опухолях, в которых раковые клетки сохраняют основные компоненты ТОБ-р1-сигналинга (рак молочной железы (РМЖ) и РЛ) [14, 21]. Действительно, при НМРЛ — наиболее распространенном гистологическом подтипе РЛ с высоким уровнем смертности — увеличение экспрессии ТОБ-р1 коррелирует с прогрессией опухоли и плохой выживаемостью пациентов. Различные экспериментальные модельные
системы подтверждают мнение о прометастатической роли ТОБ-р1 в этих опухолях [22—25]. Тем не менее одной из основных нерешенных задач остается идентификация генов-мишеней для ТОБ-р1, которые управляют различными стадиями метастазирования, тем более что ТОБ-р1 модулирует экспрессию генов по-разному в зависимости от типа клеток [26, 27]. Несмотря на определенный прогресс в контексте метастазов РМЖ, гены и механизмы, которые опосредуют прометастатические эффекты ТОБ-р1 при НМРЛ, остаются в значительной степени неизвестными.
Как видно из табл. 1, ТОБ-р1 оказывает существенное влияние на экспрессию ряда белков, связанных с канцерогенезом, которые могут являться потенциальными мишенями для таргетной терапии РЛ. В частности, ТОБ-р1 модулирует экспрессию куллинов
Таблица 2. Число протеинов в каждой категории биологического процесса, увеличивающих или уменьшающих экспрессию в клетках А549 после их стимуляции TGF-pl
Категория биологического процесса Онтология генов (Gene Ontology, GO) Число протеинов Число протеинов, увеличивающих экспрессию Число протеинов, снижающих экспрессию (Down) Up/Down
Метаболический G0:0 008152 ЗЗ7 1З2 205 0,64
Клеточный G0:0 009987 225 92 133 0,69
Биологическая регуляция G0:0 065007 94 42 52 0,81
Локализация G0:0 051 179 86 З4 52 0,65
Организация или биогенез клеточных компонентов G0:0 071 840 80 28 52 0,54
Развитие G0:0 032502 70 28 42 0,67
Отклик на стимулы G0:0 050896 З6 18 18 1,00
Многоклеточные организмы G0:0 032501 З7 15 22 0,68
Иммунные G0:0 002376 27 12 15 0,80
Апоптический G0:0 006915 16 6 10 0,60
Репродуктивный G0:0 000003 8 4 4 1,00
Адгезия G0:0 022610 9 З 6 0,50
CV
ев
и ш u
(сиШпз) — семейство гидрофобных белков, служащих скэффолдом для убиквитинлигаз (Е3). Они в сочетании с ЯШО-белками образуют куллин-ЫКО-убиквитин-лигазы (СЯЬ), которые играют важную роль во многих клеточных процессах. Нами идентифицированы 5 (СИЬ1, СИЬ2, СИЬЗ, СИЬ4, СИЬ5) из 8 членов этого семейства. У человека функциональные изменения этого семейства убиквитинлигаз связаны с заболеваниями мышц, метаболическими нарушениями и раком [28]. Наиболее известным субстратом, распознающим рецептор СЯЬ2, является опухолевый супрессор — белок УЫЬ, который мутирует при синдроме фон Хиппеля— Линдау (УЫЬ) [29]. При действии ТОР-Р1 (см. табл. 1) экспрессия СИЬ2 увеличивалась в 10,37 раза. В последнее время появилось значительное число исследований, проливающих свет на биологические функции СИЬЗ ЕЗ-лигазы, которая регулирует про-грессирование опухолевого процесса и терапевтический ответ. В частности, Кеар1, КЬЫЬ20 и БРОР являются наиболее известными субстратными адаптерами для СИЬЗ при ее воздействии на различные виды рака. Эти 3 белка опосредуют СИЬЗ-зависимое убиквитинирование ряда субстратов при инициации опухолевого процесса, его прогрессировании и терапевтическом ответе [З0]. Нами отмечено увеличение экспрессии СИЬЗ в 5,22 раза.
ЕТБ1 входит в семейство онкогенов ЕТБ, члены которого обладают характерным ДНК-связывающим доменом (домен ЕТБ) из 85 аминокислот [З1]. Белок ЕТБ1 контролирует уровни экспрессии множества генов, включая факторы транскрипции, протеазы, гены
клеточного цикла, гены, регулирующие апоптоз, цито-кины и факторы роста [З2]. Повышенная активность ЕТБ1 наблюдалась при РМЖ, РЛ, раке яичников, обо -дочной и прямой кишки и меланоме [ЗЗ—З7]. ЕТБ1 сверхэкспрессируется при инвазивном РМЖ и коррелирует с его плохим прогнозом [З8]. Высокая экспрессия ЕТБ1 способствует миграции раковых клеток, инвазии и анкернезависимому росту, в то же время низкая экспрессия ЕТБ1 снижала адгезию клеток ЫеЬа [З9]. ТОБ-р1 увеличивал экспрессию ЕТБ1 в клетках А549 в 69,41 раза (см. табл. 1).
Дерегуляция сигналинга фосфатидилинозитол-З-киназы (рИоБрИаИдуНпоБИо! З-ктаБе, Р1ЗК) имеет решающее значение для многих злокачественных опухолей человека, несмотря на то, что для нормальной пролиферации клеток требуется адекватная функциональность этого каскада. Хотя ряд ингибиторов Р1ЗК-пути находятся на клинических испытаниях или одобрены для противоопухолевой терапии, все еще неясна роль функциональной активности членов этого каскада при конкретных злокачественных опухолях. При РЛ Р1ЗК-путь часто аберрантно активируется мутацией генов, кодирующих белки ЕОБЯ, КИЛБ и Р1КЗСЛ [40]. При действии ТОР-Р1 на клетки А549 (см. табл. 1) наблюдалось значительное увеличение (в 2З,14 раза) экспрессии протеина Р1КЗСЛ, что может указывать на тесную взаимосвязь ТОР-Р1 с Р1ЗК-сиг-нальными путями и должно учитываться при выборе мишеней для таргетной терапии НМРЛ.
При многих видах рака положительно регулируются несколько генов, связанных с онкогенезом
х ш
и
CV
со
es
и ш u
X ш
и
и опухолевой прогрессией, а супрессорные гены подавляются. Одним из факторов, регулирующих эти процессы, является экспрессия генов посттрансляционной модификации гистонов. Метилирование и аце-тилирование гистонов — хорошо известные посттрансляционные модификации. В последнее время повышенное внимание уделяется метилированию и ацетилированию гистонов при лечении рака [41, 42]. Диацелазы гистонов (histone deacetylases, HDACs) часто сверхэкспрессированы при онкологических заболеваниях, в последние годы они стали основной терапевтической мишенью [43]. Повышенная экспрессия HDACs может привести к глушению транскрипции генов и аберрантной транскрипции из-за измененной экспрессии/мутации генов, кодирующих гистонаце-тилтрансферазу (HAT), HDAC-ферменты или их связывающих партнеров, и тесно сопряжена с канцерогенезом. Это происходит при многих злокачественных опухолях у человека, указывая на то, что активность аберрантного эпигенетического ацетилирования связана с развитием рака [44—46]. Полагают, что последовательные стадии ЭМП и мезенхимально-эпители-ального перехода, происходящие в процессе опухолевой прогрессии, могут быть обратимыми и связаны с эпигенетическими изменениями.
В нескольких исследованиях отмечен эффект ингибиторов HDAC на SMAD4. A. Kaimori и соавт. показали, что ингибирование гистондеацетилазы подавляет TGF-ß-индуцированный ЭМП в гепатоцитах путем ингибирования транслокации SMAD4 в ядро [47]. C.L. Chung и соавт. показали, что ингибитор HDAC — м-карбоксициннаминовая кислота — ингибирует транслокацию в ядро SMAD4 в плевральных мезоте-лиальных клетках человека [48]. Анализ полученных нами данных неожиданно выявил снижение экспрессии HDAC1 (в 12,87 раза), HDAC2 (в 4,64 раза) и уровня HAT1 (в 3,06 раза) при действии TGF-ß1 на клетки А549. Полученный эффект требует дополнительного исследования.
CDK — группа белков, регулируемых циклином и циклиноподобными молекулами. Большинство CDK участвуют в смене фаз клеточного цикла, регулируют транскрипцию и процессинг матричной (мРНК). CDK — серин/треониновые киназы, фосфорилируют соответствующие аминокислотные остатки в белках. Известны несколько CDK, каждая из которых активируется одним или более циклинами и иными подобными молекулами. Аберрантная регуляция клеточного цикла является отличительной чертой рака [49]. Активность CDK4/6 дерегулирована в результате различных генетических изменений во многих злокачественных опухолях человека. Они включают мутации генов CDK4 и CDK6, амплификацию генов, кодирующих циклины D-типа, делецию или сайленсинг CD-КЫ2А/Б-генов, кодирующих ГКК4-ингибиторы р16 и p15 [50]. Такое дерегулирование имеет решающее значение для различных процессов онкогенной
трансформации, на что указывает высокая активность CDK4/6 во многих раковых клетках [51]. Ранее установлено, что CD^^^^^m^ PD-0332991 увеличивал SMAD-транскрипционную активность, индуцировал ЭМП, усиливал экспрессию метастатических генов [52]. При инициации ЭМП в клетках A549 TGF-P1 наблюдалось снижение активности CDK4 и CDK6 в 5,51 и 4,94 раза соответственно (см. табл. 1). Экспрессия CDK5 и CDK9 также снижалась в 1,50 и 3,43 раза соответственно, тогда как уровни ингибитора CDK1 возрастали в 1,59 раза, а протеина 1, ассоциированного с CDK2, — в 8,53 раза. Эти данные указывают на то, что ингибирование активности CDK4/6 может частично активировать TGF-p-сигнальный каскад и способствовать протеканию процесса ЭМП.
Полипептид 1 фактора B (SIII) элонгации транскрипции (transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 1; TCEB1) выполняет несколько функций в клетке. Он является частью комплекса Elongin (SIII), который работает как активатор транскрипции [53]. В цитоплазме клеток TCEB1 входит в состав белкового комплекса VHL, таргетирующего онкоген HIF-1a [54]. S.E. Jalava и соавт. показали, что уменьшение экспрессии TCEB1 приводило к снижению инвазии и метастазирования клеток рака предстательной железы [55]. При действии TGF-P1 на клетки A549 мы наблюдали увеличение его уровней в 4,1 раза (см. табл. 1). Одновременно отмечали повышение экспрессии в 2,46 раза ADAM9, опосредующего его эффект [55].
Цинк-пальцевые белки, кодируемые с участием протеина, связывающего цинк-пальцевую РНК (ZFR), играют важную роль в связывании ДНК и регулировании процессов роста и развития [56]. Человеческий ZFR, по-видимому, участвует в регулировании альтернативного сплайсинга пре-мРНК [56]. Нокаут ZFR инициирует арест клеточного цикла в фазе G0/G1 и супрессирует миграцию и инвазию клеток PANC-1 рака поджелудочной железы [56]. Действие TGF-P1 вызывает гиперэкспрессию (в 339,82 раза) ZFR в клетках A549. Одновременно зарегистрировано увеличение уровней цинк-пальциевого белка 578 (ZNF578) в 25,11 раза. Оба белка могут рассматриваться как потенциальные мишени для таргетной терапии НМРЛ.
Связь протеина сайта 5 экотропной вирусной интеграцией (Evi5) с регуляцией клеточного цикла и миграцией клеток предполагает его участие в патологии некоторых заболеваний. Однако прямые доказательства роли Evi5 в онкогенезе или подавлении тумороге-неза пока отсутствуют [57]. Инкубация TGF-P1 с клетками А549 приводит к увеличению экспрессии Evi5 в 213,09 раза, что указывает на его тесную связь с TGF-P1-сигналингом и требует дальнейшего изучения.
Заключение
Методом протеомной масс-спектрометрии высокого разрешения изучены молекулярные механизмы действия TGF-P1 на клетки А549 аденокарци-
номы легкого человека. Впервые обнаружены не описанные ранее сигнальные пути, ответственные за участие TGF-ß1 в онкогенезе НМРЛ, которые включают ДЭБ семейств куллинов, онкогенов ETS, диацелаз гистонов, CDK, цинк-пальцевых белков. Особый интерес представляют белки ZFR и Evi5, экспрессия которых в клетках A549 под действием
ТОБ-р1 увеличивается в сотни раз. Требуются дополнительные исследования для понимания их роли в онкогенезе РЛ. Полученные нами данные могут использоваться при разработке новых подходов для обнаружения кандидатных маркеров метастази-рования НМРЛ и потенциальных мишеней для терапии этого заболевания.
CV
CS
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Siegel R., Naishadham D., Jemal A. Cancer statistics. CACancer J Clin 2012;62(1):10-29.
2. Liotta LA, Steeg P.S., Stetler-Stevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis:
an imbalance of positive and negative regulation. Cell 1991;64(2):327-36.
3. Ganti A.K., Huang C.H., Klein M.A. et al. Lung cancer management in 2010. Oncology (Williston Park) 2011;25(1): 64-73.
4. Kojima Y., Acar A., Eaton E.N. et al. Autocrine TGF-beta and stromal cellderived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107(46): 20009-14.
5. Kalluri R., Weinberg R.A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Inves 2009;119(6):1420-8.
6. Morel A.P., Lievre M., Thomas C. et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PLoS One 2008;3(8):e2888.
7. Miyazono K., Ehata S., Koinuma D. Tumor-promoting functions
of transforming growth factor-ß
in progression of cancer. Ups J Med Sci
2012;117(2):143-52.
8. Ikushima H., Todo T., Ino Y. et al. Autocrine TGF-beta signaling maintains tumorigenicity of glioma-initiating cells through Sry-related HMG-box factors. Cell Stem Cell 2009;5(5):504-14.
9. Zhao L., Ji W., Zhang L. et al. Changes of circulating transforming growth factor-beta1 level during radiation therapy are correlated with the prognosis of locally advanced non-small cell lung cancer.
J Thorac Oncol 2010;5(4):521-5.
10. Dancea H.C., Shareef M.M., Ahmed M.M. Role of radiation-induced TGF-beta signaling in cancer therapy. Mol Cell Pharmacol 2009;1(1):44-56.
11. Rahimi R.A., Leof E.B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem 2007;102(3):593-608.
12. Шевченко В.Е., Ковалев С.В., Арноц-кая Н.Е. и др. Молекулярные детерминанты действия трансформирующего фактора роста бета-1 на клетки глио-бластомы человека. Успехи молекулярной онкологии 2016;3(2):50-9.
[Shevchenko V.E., Kovalev S.V., Arnotskaya N.E. et al. Molecular determinants of transforming growth factor beta-1 action on human glioblastoma cells. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2016;3(2):50-9. (In Russ.)].
13. Derynck R., Akhurst R.J., Balmain A. TGF-ß signaling in tumor suppression and cancer progression. Nat Genet 2001;29(2):117-29.
14. Elliott R.L., Blobe G.C. Role
of transforming growth factor b in human cancer. J Clin Oncol 2005;23:2078-93.
15. Padua D., Massague J. Roles of TGF-ß in metastasis. Cell Res 2009;19:89-102.
16. Jakowlew S.B. Transforming growth factor-ß in lung cancer, carcinogenesis, and metastasis. In: The tumor microenvironment. Ed. R.G. Bagley. 2010. Pp. 633-671.
17. Ma C., Rong Y., Radiloff D.R. et al. Extracellular matrix protein big-h3/ TGFBI promotes metastasis of colon cancer by enhancing cell extravasation. Genes Dev 2008;22(3):308-21.
18. Giampieri S., Manning C., Hooper S. et al. Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility. Nat Cell Biol 2009;11(11):1287-96.
19. Labelle M., Begum S., Hynes R.O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymallike transition and promotes metastasis. Cancer Cell 2011;20(5):576-90.
20. Yuan J.H., Yang F., Wang X. et al. A long noncoding RNA activated by TGF-ß promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell 2014;25(5):666-81.
21. Hasegawa Y., Takanashi S., Kanehira Y. et al. Transforming growth factor-ß1 level correlates with angiogenesis, tumor progression, and prognosis in patients with nonsmall cell lung carcinoma. Cancer 2001;91(5):964-71.
22. Toonkel R.L., Borczuk A.C., Powell C.A. TGF-ß signaling pathway in lung adenocarcinoma invasion. J Thorac Oncol 2010;5(2):153-7.
23. Vazquez P.F., Carlini M.J., Daroqui M.C. et al. TGF-ß specifically enhances
the metastatic attributes of murine lung adenocarcinoma: implications for human
non-small cell lung cancer. Clin Exp Metastasis 2013;30(8):993-1007.
24. Massague J. TGF-ß signalling in context. Nat Rev Mol Cell Biol 2012;13(10): 616-30.
25. Michl P., Ramjaun A.R., Pardo O.E. et al. CUTL1 is a target of TGF-ß signaling that enhances cancer cell motility and invasiveness. Cancer Cell 2005;7(6): 521-32.
26. Gregory P.A., Bracken C.P., Smith E. et al. An autocrine TGF-ß/ZEB/miR-200 signaling network regulates establishment and maintenance of epithelial-mesenchymal transition. Mol Biol Cell 2011;22(10):1686-98.
27. Shibue T., Brooks M.W., Weinberg R.A. An integrin-linked machinery
of cytoskeletal regulation that enables experimental tumor initiation and metastatic colonization. Cancer Cell 2013;24(4):481-98.
28. Genschik P., Sumara I., Lechner E.
The emerging family of CULLIN3-RING ubiquitin ligases (CRL3s): cellular functions and disease implications. EMBO J 2013;32(17):2307-20.
29. Linehan W.M., Lerman M.I., Zbar B. Identification of the von Hippel-Lindau (VHL) gene. Its role in renal cancer. JAMA 1995;273:564-70.
30. Chen H.Y., Chen R.H. Cullin 3 ubiquitin ligases in cancer biology: functions and therapeutic implications. Front Oncol 2016;6:113.
31. Laudet V., Hänni C., Stehelin D. Molecular phylogeny of the ETS gene family. Oncogene 1999;18(6):1351-9.
32. Sementchenko V.I., Watson D.K.
Ets target genes: past, present and future. Oncogene 2000;19(55):6533-48.
33. Fujimoto J., Aoki I., Toyoki H. et al. Clinical implications of expression of ETS-1 related to angiogenesis
in metastatic lesions of ovarian cancers. Oncology 2004;66(5):420-8.
34. Yamaguchi E., Nakayama T., Nanashima A. et al. Ets-1 proto-oncogene as a potential predictor for poor prognosis of lung adenocarcinoma. Tohoku J Exp Med 2007;213(1):41-50.
35. Rothhammer T., Hahne J.C., Florin C. et al. The Ets-1 transcription factor
is involved in the development and
И Ш
u
X ш
и
I*" invasion of malignant melanoma. Cell Mol
^ Life Sci 2004;61(1):118-28.
PJ 36. Nakayama T., Ito M., Ohtsuru A. et al.
Expression of the Ets-1 proto-oncogene CO in human colorectal carcinoma. Mod
Pathol 2001;14(5):415-22. g 37. Span P.N., Manders P., Heuvel J.J. et al.
Expression of the transcription factor Ets-i9 1 is an independent prognostic marker for
relapse-free survival in breast cancer. ee Oncogene 2002;21(55):8506-9.
38. Puzovic V., Brcic I., Ranogajec I., Jakic-Razumovic J. Prognostic values of ETS-1, lu MMP-2 and MMP-9 expression and co-
O expression in breast cancer patients.
S Neoplasma 2014;61(4):439-46.
3Ç 39. Hahne J.C., Okuducu A.F., Kaminski A.
et al. Ets-1 expression promotes epithelial {j cell transformation by inducing migration,
invasion and anchoragein-dependent growth. Oncogene 2005;24(34):5384-8. § 40. Stamatkin C., Ratermann K.L., Overley C.W
.____et al. Inhibition of class IA PI3K enzymes
s in non-small cell lung cancer cells
SB uncovers functional compensation among
O isoforms. Cancer Biol Ther
O 2015;16(9):1341—52.
SE 41. Sui X., Zhu J., Zhou J. et al. Epigenetic O modifications as regulatory elements of
'== autophagy in cancer. Cancer Lett
3E 2015;360(2):106-13.
42. Rodrigues M.F., Carvalho É., Pezzuto P. et al. Reciprocal modulation of histone 3C deacetylase inhibitors sodium butyrate
^ and trichostatin a on the energy
metabolism of breast cancer cells. J Cell Biochem 2015;116(5):797-808.
43. Song J., Noh J.H., Lee J.H. et al. Increased expression of histone deacetylase 2 is found in human gastric cancer. APMIS 2005;113(4):264-8.
44. Brock M.V., Hooker C.M., Ota-Machida E. et al. DNA methylation markers and early recurrence in stage I lung cancer.
N Engl J Med 2008;358(11):1118-28.
45. Sterlacci W., Tzankov A., Veits L. et al. A comprehensive analysis of p16 expression, gene status, and promoter hypermethylation in surgically resected non-small cell lung carcinomas. J Thorac Oncol 2011;6(10):1649-57.
46. Ibanez de Caceres I., Cortes-Sempere M., Moratilla C. et al. IGFBP-3 hypermethylation-derived deficiency mediates cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer. Oncogene 2010;29(11):1681-90.
47. Kaimori A., Potter J.J., Choti M. et al. Histone deacetylase inhibition suppresses the transforming growth factor beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition in hepatocytes. Hepatology 2010;52(3):1033-45.
48. Chung C.L., Sheu J.R, Chen W.L. et al. Histone deacetylase inhibitor mcarboxycinnamic acid bis-hydroxamide attenuates plasminogen activator inhibitor-1 expression in human pleural mesothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2012;46(4):437-45.
49. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144(5):646-74.
50. Ortega S., Malumbres M., Barbacid M. Cyclin D-dependent kinases, INK4 inhibitors and cancer. Biochim Biophys Acta 2002;1602(1):73-87.
51. Choi Y.J., Li X., Hydbring P. et al. The requirement for cyclin d function in tumor maintenance. Cancer Cell 2012;22(4):438-51.
52. Schutte M., Hruban R.H., Hedrick L. et al. DPC4 gene in various tumor types. Cancer Res 1996;56(11):2527-30.
53. Aso T., Lane W.S., Conaway J.W., Conaway R.C. Elongin (SIII):
a multisubunit regulator of elongation by RNA polymerase II. Science 1995;269(5229):1439-43.
54. Cockman M.E., Masson N., Mole D.R. et al. Hypoxia inducible factor-alpha binding and ubiquitylation by the von Hippel—Lindau tumor suppressor protein. J Biol Chem 2000;275(33):25733-41.
55. Jalava S.E., Porkka K.P., Rauhala H.E.
et al. TCEB1 promotes invasion of prostate cancer cells. Int J Cancer 2009;124(1): 95-102.
56. Zhao X., Chen M., Tan J. Knockdown of ZFR suppresses cell proliferation and invasion of human pancreatic cancer. Biol Res 2016;49(1):26.
57. Lim Y.S., Tang B.L. The Evi5 family in cellular physiology and pathology. FEBS Lett. 2013; 587(12):1703-10.
X ш
и
