CC BY
2619. Xiong N., Raulet D.H. Development and selection of gammadelta T cells. Immunol. Res. 2007, 215: 15-31.
20. Zanoni I., Granucci F., Foti M., Ricciardi-Castagnoli P. Self-tolerance, dendritic cell (DC)-mediated activation and tissue distribution of natural killer (NK) cells. Immunol. Lett. 2007, 110 (1): 6-17.
Поступила 18.06.13
Контактная информация: Ахматова Нэлли Кимовна, д.м.н., проф., 105064, Москва, М.Казенный пер., 5А, р.т. (495) 916-07-74
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
А.В.Солдатенкова, И.В.Яковлева, Н.В.Гаврилова, Н.А.Михайлова, В.В.Свиридов
ПОЛУЧЕНИЕ И ОЦЕНКА СВОЙСТВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЭКЗОТОКСИНУ А PSEUDOMONAS AERUGINOSA
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Получение, изучение свойств и оценка возможности использования монокло-нальных антител к экзотоксину А Pseudomonas aeruginosa (ЭТА) для выявления молекул рекомбинантных экзотоксина А и анатоксина. Материалы и методы. Получены гибридо-мы — продуценты моноклональных антител к ЭТА. Для иммунизации мышей использован рекомбинантный экзотоксин А, его атоксичные формы, анатоксин синегнойной палочки и живая культура P. aeruginosa PA-103. Результаты. Наиболее продуктивным оказался опыт по слиянию злокачественной клеточной линии и иммунных лимфоцитов, полученных от одной мыши, иммунизированной рекомбинантным ЭТА. Оценена интенсивность взаимодействия моноклональных антител с рекомбинантными атоксичными формами ЭТА в иммуноферментном анализе. Изучена протективная (токсиннейтрали-зующая) активность антител на культуре клеток и способность выявлять экзотоксин А в реакции латекс-агглютинации. Антитела гибридной культуры № 21 способны выявлять молекулы рекомбинантного ЭТА и анатоксина в реакции латекс-агглютинации. Заключение. Предполагается использование полученных антител для тестирования токсигенности штаммов P. aeruginosa, а также выявления анатоксина в технологическом процессе получения профилактических препаратов на основе экзотоксина А.
Журн. микробиол., 2014, № 1, С. 30—35
Ключевые слова: экзотоксин А, Pseudomonas aeruginosa, monoclonal antibodies
A.V.Soldatenkova, I.V.Yakovleva, N.V.Gavrilova, N.A.Mikhailova, V.V.Sviridov
PRODUCTION AND PROPERTIES EVALUATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN A
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Production, study ofproperties and evaluation ofa possibility to use monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (ETA) for the detection ofmolecules ofrecombinant exotoxin A and anatoxin. Materials and methods. Producer hybridomas for monoclonal antibodies against ETA were generated. Recombinant exotoxin A, its atoxic forms, P.aeruginosa anatoxin and P. aeruginosa PA-103 live culture were used for immunization of mice. Results. The experiment of
fusion of malignant cell line with immune lymphocytes obtained from a mouse immunized with recombinant ETA turned out to be the most productive. Intensity of interaction of monoclonal antibodies with recombinant atoxic forms ofETA was evaluated in enzyme immunoassay. Protective (toxin-neutralizing) activity of antibodies in cell culture and the ability to detect exotoxin A in latex-agglutination reaction were studied. Antibodies of hybrid culture No. 21 are able to detect molecules of recombinant ETA and anatoxin in the latex-agglutination reaction. Conclusion. Use of the antibodies produced for testing toxigenicity of P. aeruginosa strains as well as detection of anatoxin in the technological process of production of prophylaxis preparations based on exo-toxin A is expected.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 1, P. 30-35
Key words: exotoxin A, Pseudomonas aeruginosa, monoclonal antibodies
ВВЕДЕНИЕ
Синегнойная палочка (P. aeruginosa)— один из наиболее опасных возбудителей внутрибольничных инфекций, чаще всего регистрируемых в отделениях урологии, травматологии, трансплантологии, неонатологии. Смертность от синегнойного сепсиса у ожоговых больных, несмотря на проводимую комплексную терапию, достигает 60 — 70%. Быстрая идентификация P. aeruginosa — одна из главных задач клинической лабораторной диагностики.
Наиболее значимым фактором патогенности P.aeruginosa является продуцируемый вирулентными штаммами возбудителя экзотоксин А (ЭТА), вызывающий как системные, так и местные проявления инфекции в виде локального некроза тканей. ЭТА способствует диссеминации и препятствует репаративным процессам, что существенно утяжеляет течение инфекции [4].
Наряду с дифтерийным (Corynebacterium diphtheriae), холерным (Vibrio cholerae), шига- (Shigella dysenteriaе) и сибиреязвенным (Bacillus anthracis) токсинами, ЭТА является высокотоксичным для животных, включая приматов [11].
На сегодняшний день можно сформулировать две тенденции для эффективного лечения и профилактики оппортунистических инфекций, вызванных P. aeruginosa — создание вакцинных препаратов; усовершенствование методов ранней диагностики заболевания.
За более чем 50 лет исследований по изучению ЭТА в практике появилось множество сведений о получении поликлональных сывороток и моноклональных антител к экзотоксину. Накоплен опыт по пассивной защите от токсической формы инфекции P. aeruginosa. Получены моноклональные антитела ко всем доменам ЭТА (1а, Ib, II, III) [3, 5, 6 , 8 — 10].
Известно, что штаммы синегнойной палочки, дефицитные по продукции ЭТА, являются менее вирулентными, нежели токсинпродуцирующие, поэтому идентификация токсинообразования клиническими изолятами синегнойной палочки могла бы стать важным шагом в диагностике внутрибольничных инфекций, вызванных P. aeruginosa. Однако на сегодняшний день тест-системы для определения токсигенности изолятов P. aeruginosa нет.
В результате выполненных ранее в НИИВС им. И.И. Мечникова исследований разработан ускоренный метод выявления P. aeruginosa при помощи полученных видоспецифичных моноклональных антител [2]. На сегодняшний день представляет интерес разработка методов выявления ЭТА в клинических изолятах P. aeruginosa.
Цель исследования — получение моноклональных антител к ЭТА, изучение их свойств и оценка возможности использования для выявления ЭТА и рекомби-нантного анатоксина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Рекомбинантный ЭТА (ToxA) и его атоксичные формы (aTox1 — состоящий из домена I ЭТА, aTox1, 2 — ^стоящий из доменов I и II, aTox1,2 , A3 — состоящий из доменов I, II и III с делецией 106 аминокислотных остатков) получали выращиванием соответствующего бактериального продуцента в среде Luria bertani с канамициноном. Индукцию экспрессии генов рекомбинантных белков осуществляли добавлением изопропил-Р^-1-тиогалактопиранозида. Хроматографиче-скую очистку осуществляли с использованием Ni-сефарозы, как описано в [1].
Мышей линии BALB/с массой 15 — 18 г получали из питомника «Андреевка» Московской области. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом.
Самок мышей линии BALB/c иммунизировали различными дозами рекомбинантных препаратов, анатоксином P. aeruginosa («Микроген» — «Иммунопрепарат», Уфа) или экзотоксином А («Sigma-Aldrich»), сорбированных на гидроокиси алюминия или без адъюванта в зависимости от протокола.
Слияние иммунных спленоцитов мышей линии BALB/с и злокачественной линии миеломы мыши P3-X63-Ag8.653 проводили в соответствии с общепринятыми методиками [7]. Гибридные культуры культивировали в 96-луночных планшетах («Costar»), антитело-продуцирующие гибридомы отбирали на основе им-муноферментного анализа и переносили в планшеты больших размеров.
Иммуноферментный анализ проводили согласно общепринятой методике. В качестве антигена, сорбированного на планшет, использовали рекомбинантный ЭТА, его атоксичные формы или ЭТА («Sigma-Aldrich»).
Для оценки протективной активности моноклональных антител в лунки 96-лу-ночного планшета вносили пробы супернатантов или асцитных жидкостей гибридных культур, содержащих моноклональные антитела, или поликлональных сывороток в различных разведениях в объеме 100 мкл. Затем в те же лунки вносили 4 цитопатогенные дозы рекомбинантного ЭТА в объеме 50 мкл и инкубировали 30 мин при температуре 37°C, после чего вносили СНО в концентрации 10 тыс. клеток на лунку в объеме 100 мкл. За изменениями в лунках следили в течении 5 дней под микроскопом, а также визуально — по цветной реакции.
Латекс-агглютинацию проводили согласно общепринятым методикам c использованием латексных микросфер, сенсибилизированных моноклональными антителами.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для получения гибридных культур использовали 8 различных схем иммунизации (табл. 1). Наиболее продуктивной оказалась схема иммунизации, при которой инактивированный рекомбинантный ЭТА, сорбированный на гидроокиси алюминия, вводили двухкратно с интервалом две недели в дозе 25 мкг. За три дня перед гибридизацией мышке вводили дополнительную дозу белка внутривенно без адъюванта. Получено 20 специфичных к рекомбинантному ЭТА клонов-продуцентов моноклональных антител.
Для второй схемы иммунизации в качестве иммуногена использовали анатоксин P. aeruginosa («Микроген» — «Иммунопрепарат», Уфа), сорбированный на гидроксиде алюминия. Препарат вводили с аналогичными интервалами в дозе 15 мкг. Получено два слабоспецифичных к рекомбинантному ЭТА клона.
Следующая схема предусматривала четырехкратное введение мышке по 15 мкг анатоксина («Микроген» — «Иммунопрепарат», Уфа), сорбированного на гидро-кисиде алюминия, а затем дополнительную дозу без адъюванта рекомбинантного инактивированного ЭТА. Получено 13 новых гибридных культур.
Таблица 1. Схемы иммунизации
Варианты
Препарат
Количество иммунизаций
Дозы
Полученные продуценты
Инакт. ToxA Анатоксин
Анатоксин инак. ToxA
ЭТА aToxl, 2 aToxl
PA103+ToxA
2 (с/а)+1 (б/а)
2 (с/а)+1 (б/а)
4 анатокс. (с/а)+1-ToxA (б/а)
3 (с/а)+1 (б/а) 2+1
2+1
1 (б/а)+1 (б/а)
PA103+к/ж после культ. PA103 2 (б/а)+к/ж после культ. PA103
25 мкг 15 мкг
15 мкг+25 мкг
5 мкг 50 мкг 50 мкг
25 млн м.к.+25 мкг 12,5 млн м.к.
1 — 14, 17— 19, 24, 26, 27
34, 35
15, 16, 20, 22, 23, 28—33, 36, 37
38—47
Примечание. с/а — с адьювантом, б/а — без адьюванта, к/ж — культуральная жидкость.
Четвертая схема иммунизации включала трехкратное введение ЭТА («Sigma-Aldrich») в дозе 5 мкг сорбированного на гидроксиде алюминия. Дополнительная доза вводилась внутривенно без адьюванта.
При двухкратном введении атоксичной формы ЭТА aTox1, 2 или aTox1 в дозе 50 мкг на мышь с Al(OH)3 и дополнительной дозы без адьюванта. Специфичных к ToxA клонов получить не удалось.
Не получено клонов-продуцентов антител и при схемах иммунизации, включающих введение живой токсигенной культуры PA103.
Для определения направленности моноклональных антител к определенному домену выполнен ряд экспериментов ИФА с белками aTox1, aTox1, 2, aTox1, 2, Л3 и ТохА и ЭТА «Sigma-Aldrich». Супернатанты культур тестировали в ИФА в разведении 1/8. За положительный результат (+) принимали оптическую плотность более 0,8; за слабоположительный (±) — оптическую плотность от 0,3 до 0,8; за отрицательный (—) — оптическую плотность ниже 0,3 при значении отрицательного контроля 0,08. Все гибридные культуры синтезировали антитела, специфичные к ToxA. Большинство антител взаимодействовали с ЭТА «Sigma-Aldrich» и лишь немногие антитела гибридных культур взаимодействовали с aTox1 (табл. 2).
Представляло интерес оценить протективную (токсиннейтрализующую) активность моноклональных антител. Первоначально рекомбинантный ЭТА и его атоксичные формы были оценены на токсичность на линии клеток СНО. Делеционные варианты экзотоксина А (aTox1, 2, Л3, aTox1, 2, aTox1) не обладали токсичностью, тогда как полноразмерный рекомбинантный ЭТА обладал выраженной цитотоксичностью — около 20 нг/мл при концентрации клеток CHO 105.
Среда культивирования пяти гибридных культур (№ 12, 23, 33, 36 и 37) обладала выраженной токсиннейтрализующей активностью (клетки СНО не гибли в разведениях супернатантов 1:10 — 1:160) и пяти культур (№ 2, 16, 20, 24 и 28) — незначительной токсиннейтрализующей активностью (клетки не гибли только в разведении 1:2).
Также оценена способность антител № 21 и 33 выявлять рекомбинантный ЭТА и рекомбинантный анатоксин в реакции латекс-агглютинации. Антитела, продуцируемые гибридной культурой № 21, выявляли рекомбинантный ЭТА и ре-комбинантный анатоксин с чувствительностью 6 — 10 нг. Антитела гибридной культуры № 33 выявляли только полноразмерный ЭТА и не выявляли делецион-ные формы ЭТА.
3. ЖМЭИ 1 № 29
33
Таблица 2. Взаимодействие проб антител с рекомбинантным ЭТА, его атоксичными формами и ЭТА «Sigma-Aldrich»
№ aTox1 aTox1.2 aTox1.2.3 aToxA ЭТА «Sigma-Aldrich» № aTox1 aTox1.2 aTox1.2.3 aToxA ЭТА «Sigma-Aldrich»
1 — ± — + + 24 — — — + +
2 — — — + + 26 — + + + +
3 — + + + + 27 — + + + +
4 ± + + + + 28 — + + + +
5 — + + + + 29 — + + + +
6 + ± ± ± — 30 — ± ± ± ±
7 — + ± + + 31 — — — + +
8 — + + + + 32 — + + + +
9 — + ± + + 33 — ± ± + +
10 + — — ± — 34 — — — ± ±
11 ± ± — + + 35 — — — + ±
12 — — — + + 36 — — — + ±
13 — + + + + 37 — + + + +
14 — + + + + 38 — — — + +
15 — ± ± + + 39 — — + + +
16 — ± ± + + 40 — — — + +
17 + — ± ± — 41 — — — + +
18 — + + + + 42 — + + + +
19 — + — + + 43 — — — + +
20 — — — + + 44 — — — + +
21 — + + + + 45 — — — + ±
22 ± + + + + 46 + — + + +
23 — — — + + 47 — — — + +
ОБСУЖДЕНИЕ
Наиболее продуктивной оказалась первая схема иммунизации, при которой
вводили инактивированный рекомбинантный ЭТА. При иммунизации мышки рекомбинантным белком, представляющим домен I ЭТА, получены антитела, реагирующие с белком-иммуногеном, но неспецифичные к ToxA, что, вероятно, связано с иной конформацией домена I ЭТА в полноразмерной молекуле, чем в делеционной форме. Отсутствие клонов в седьмой и восьмой схеме, вероятно, объясняется тем, что ЭТА, вырабатываемый штаммом PA103, мог разрушить большую часть иммунных лимфоцитов.
Стоит отметить, что большинство из токсиннейтрализующих антител (№ 2, 12, 20, 23, 24, 36) взаимодействуют в ИФА только с полноразмерным ЭТА и ЭТА («Sigma-Aldrich») и не взаимодействуют с делеционными вариантами ЭТА. Антитела гибридной культуры № 33 слабо взаимодействуют в ИФА с aTox1, 2, A3, aTox1, 2 и не взаимодействует с aTox1. В связи со сходной интенсивностью взаимодействия большинства протективных антител с делеционными формами ЭТА в ИФА представляет интерес оценка направленности к определенному эпитопу. Возможно, большинство антител, продуцирующихся протективными гибридными культурами, направлены к одной детерминанте.
Предварительные эксперименты с антителами гибридных культур № 21 и 33 показали возможность создания универсальной тест-системы на основе антител № 21 для выявления рекомбинантных ЭТА и рекомбинантного анатоксина.
В дальнейшем предполагается использование полученных антител для тестирования токсигенности штаммов P. aeruginosa, а также выявления анатоксина в технологическом процессе получения профилактических препаратов на основе экзотоксина А.
ЛИТЕРАТУРА
1. Исаков М.А., Солдатенкова А.В., Калошин А.А., Михайлова Н.А. Иммунобиологические свойства рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. Журн. микробиол. 2011, 2: 37-42.
2. Ломтатидзе М.Н., Храпова Н.П., Крючкова Т.П. и др. Экспресс-выявление Pseudomonas aeruginosa при помощи меченных ФИТЦ моноклональных антител. Эпидемиология и вакциопрофилактика. 2004, 2 (15): 42-45.
3. Chia J., Pollak M., Avigan D., Steinbch S. Functionally distinct monoclonal antibodies reactive with enzymatically active and binding domains of Pseudomonas aeruginosa toxin A. Infect. Immun. 1986, 52 (3): 756-762.
4. Danielsen L., Westh H., Balselv E. et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A antibodies in rapidly deteriorating chronic leg ulcers. Lancet. 1996, 347: 265.
5. Elzaim H. S., Chopra A. K., Peterson J. W. et al. Protection against exotoxin A (ETA) and Pseudomonas aeruginosa infection in mice with ETA-specific antipeptide antibodies. Infect. Immun. 1998, 66 (11): 5551-5554.
6. Galloway D. R., Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R. Production and characterization of monoclonal antibodies to exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa. Infect. Immun. 1984, 44 (2): 262267.
7. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice. London, Acad. Press. Inc. Ltd, 1986.
8. Ogata M., Pastan I., Fitzgerald D. Analysis of Pseudomonas exotoxin activation and conformational changes by using monoclonal antibodies as probes. Infect. Immun. 1991, 59 (1): 407-414.
9. Ohtsuka H., Horigome K., Higuchi A. Binding of monoclonal antibody specific for domain Ia/II of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A at pH 4 strongly neutralize exotoxin A-induced cytotoxicity in cell culture and in vivo. Infect. Immun. 1992, 60 (3): 1061-1068.
10. Shang H., Yfeh M., Lin C., Hwang J. Characterization of monoclonal antibody B7, which neutralizes the cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Clin. Diagn. Lab. Immun. 1996, 3 (6): 727-732.
11. Schmitt C.K., Meysick K.C., O'Brien A.D. Bacterial toxins: friends or foes? Emerg. Infect. Dis. 1999, 5(2): 224-234.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Свиридов Валерий Васильевич, к.м.н., 105064, Москва, М.Казенный пер.,5А, р.т. (495) 917-03-93
