CC BY
1211. Torres L. de F., Ribeiro D., Hirata R., Jr. et al. Multiplex polymerase chain reaction to identify and determine the toxigenicity of Corynebacterium spp. with zoonotic potential and an overview of human and animal infections. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2013,108 (3). pii: S0074-02762013000300272.
12. Zasada A. A, Forminska K., Wolkowicz T. et al. The utility of the PCR melting profile technique for typing Corynebacterium diphtheriae isolates. Lett Appl. Microbiol. 2014, 59 (3): 292298.
Поступила 05.03.17
Контактная информация: Борисова Ольга Юрьевна, д.м.н.,
125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, р.т. (499)747-64-84
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
А.А.Калошин, А.В.Солдатенкова, Е.М.Зимина, Н.А.Михайлова
ПОЛУЧЕНИЕ СЛИТЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ OprF-AOprI, AOprF-AOprl И OprF-aTox-AOprl PSEUDOMONAS AERUGINOSA
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Получение слитых рекомбинантных белков Pseudomonas aeruginosa, обладающих защитными свойствами от экспериментальной синегнойной инфекции. Материалы и методы. В плазмидах, предназначенных для экспрессии в клетках Escherichia coli, клонированы слитые последовательности генов oprF, oprl и делеционной формы toxA P. aeruginosa. Синтезированные рекомбинантные белки очищали в колонках с никель-сефарозой. При оценке защитных свойств препараты рекомбинантных белков вводили мышам внутрибрю-шинно двукратно с двухнедельным интервалом. При экспериментальном заражении живую вирулентную культуру P. aeruginosa штамма РА103 инъецировали животным внутрибрю-шинно через две недели после курса иммунизаций. Результаты. Получены три слитых рекомбинантных белка: 1. OprF-AOprI включал полноразмерную последовательность белка OprF и делеционный вариант белка Oprl (с отсутствием первых 20 аминокислотных остатков); 2. AOprF-AOprI состоял из С-концевой области (192 — 342 аминокислотные остатки) OprF и делеционного варианта белка Oprl; 3. OprF-aTox-AOprl включал полноразмерную последовательность белка OprF, последовательность нетоксичного варианта экзотоксина А (без 106 С-концевых аминокислотных остатков) и делеционный вариант белка Oprl. Показано, что наилучшими защитными свойствами обладали слитые рекомбинантные белки OprF-AOprI и OprF-aTox-AOprl в иммунизирующих дозах 25 мкги 50 мкг на животное соответственно для первого и второго белков. Заключение. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейших исследований по созданию специфических иммунобиологических препаратов на основе слитых рекомбинантных белков синегнойной палочки.
Журн. микробиол., 2017, № 5, С. 32—38
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, белок F наружной мембраны (OprF), белок I наружной мембраны (Oprl), экзотоксин А, анатоксин, слитые рекомбинационные белки OprF-AOprI, AOprF-AOprI и OprF-aTox-AOprl
A.A.Kaloshin, A.V.Soldatenkova, E.M.Zimina, N.A.Mikhailova
OBTAINING FUSED RECOMBINANT PROTEINS OprF-AOprI, AOprF-AOprl AND OprF-aTox-AOprl OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Obtaining fused recombinant proteins of Pseudomonas aeruginosa that have protective properties against experimental Pseudomonas infection. Materials and methods. Fused sequences of P. aeruginosa genes oprF, oprl and deleted form of toxA were cloned in plasmids for the expres-
sion in Escherichia coli. The synthesized recombinant proteins were purified in Ni-sepharose columns. Recombinant proteins were administered to mice intraperitoneally twice with a 2 week interval to evaluate protective properties. Virulent culture of P. aeruginosa strain PA103 was injected into the animals intraperitoneally 2 weeks after the immunization course as experimental challenge. Results. 3 fused recombinant proteins were produced: 1. OprF-AOprl included full sequence of OprF protein and deletion variant of OprI (lacking first 20 amino acids); 2. AOprF-AOprl consisted of C-terminal region (192 — 342 amino acids) OprF and deletion variant of OprI protein; 3. OprF-aTox-AOprI included full sequence of OprF protein, sequence of nontoxic variant of exotoxin A (without 106 C-terminal amino acids) and deletion variant of OprI protein. Fused recombinant proteins OprF-AOprl and OprF-aTox-AOprI at immunization doses of 25 and 50 ng for the first and second protein, respectively, were shown to have the best protective properties. Conclusion. The results obtained open perspectives for further studies to create specific immune biological preparations based on fused recombinant proteins of P. aeruginosa.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 5, P. 32-38
Key words: Pseudomonas aeruginosa, F protein of the outer membrane (OprF), I protein of the outer membrane (OprI), exotoxin A, anatoxin, fused recombinant proteins OprF-AOprl, AOprF-AOprI and OprF-aTox-AOprI
ВВЕДЕНИЕ
Одним из наиболее серьезных возбудителей оппортунистических инфекций является синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Этот микроорганизм характеризуется высокой способностью к быстрому развитию резистентности к антибиотикам, что делает неэффективными общепринятые методы лечения. Поэтому актуальным является разработка иммунобиологических препаратов для борьбы с синегнойными инфекциями. Создание вакцин на основе про-тективных антигенов возбудителя пока не увенчалось положительными результатами из-за технологических трудностей выделения целевых антигенов, которые преодолимы с использованием генно-инженерных методов [6, 8, 9].
Ранее показано, что рекомбинантный белок F наружной мембраны (OprF) Р. aeruginosa и делеционная форма экзотоксина А (анатоксин) Р. aeruginosa способствовали защите иммунизированных мышей от экспериментальной внутрибрюшинной синегнойной инфекции. При этом комплексное введение обоих белков приводило к увеличению защитных свойств [2]. Поэтому представляло интерес получение слитного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности OprF и анатоксина — OprF-aTox, который также показал свою эффективность [7]. С целью увеличения протективных свойств и спектра антигенных детерминант исследована возможность включения в состав вакцинного препарата белка 1 наружной мембраны (OprI). Ген этого белка был слит с геном белка OprF в двух вариантах, с получением слитых рекомбинантных белков OprF-Oprl и AOprF-OprI. Показано, что в результате добавления последовательности белка OprI происходило усиление защитных свойств [3]. Однако все слитые рекомбинантные белки (OprF-Oprl, AOprF-OprI и OprF-aTox) оказались не однородны в очищенных препаратах, что обусловило актуальность усовершенствования их структур. Кроме того, представлялось целесообразным объединение трех основных протективных антигенов в одном слитом рекомбинантном белке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генно-инженерные конструкции для синтеза слитых рекомбинантных белков OprF-AOprl и AOprF-AOprI получены с использованием рекомбинантных плазмид pQE30-oprF-oprI и pQE30-AoprF-oprI [3], несущих слитые гены
oprF (полноразмерный и кодирующий только 192 — 342 аминокислотные остатки) и oprl. Для удаления первых 60 нуклеотидов гена oprl использовали ПЦР. Прямой праймер для ПЦР ( 5 ' -ТС A G AT CTG CAG CCA CTC CAA AGA AAC С) содержал нуклеотидные последовательности, кодирующие с 21 по 27 аминокислоты белка Oprl и имел на 5'-конце дополнительный сайт рестрикции BglII (подчеркнут). Обратный праймер для ПЦР (5'-ТСА G AT CTC TTG GCT TCA G CT TCT ACT ТС) был комплементарен концу гена oprF и также содержал на 5'-конце дополнительный сайт рестрикции BglII (подчеркнут). Полученные амплификаты после очистки в агарозном геле обработали ре-стриктазой BglII и использовали в реакции лигирования с Т4 ДНК-лигазой. Продуктами лигирования трансформировали клетки Escherichia coli штамма М15 (QIAGEN).
Генно-инженерная конструкция для синтеза слитого рекомбинантного белка OprF- aTox-AOprl получена на основе рекомбинантной плазмиды рЕТ28-oprF-atox, несущей слитые гены полноразмерного oprF и делеционного варианта toxA (atox) [4]. При ПЦР гена oprl использовали следующие праймеры: 5'- А АСС TCG AGC AGC AG С САС ТСС AAA GAA АС и 5'-ТТС CTC GAG ТТА СТТ GCG GCT GGC ТТТ TTC С. Они содержали на своих 5'-концах дополнительные сайты рестрикции Xhol (подчеркнуты). Первый праймер включал с 59 по 80 нуклеотидные последовательности гена oprl и имел после сайта рестрикции дополнительный нуклеотид (С) для восстановления рамки считывания, а второй был комплементарен концу гена oprl. В качестве матрицы для получения гена oprl служила плазмидная конструкция, предназначенная для экспрессии рекомбинантного белка Oprl [1]. Размер делеционного варианта гена oprl составил 210 нуклеотидов. Амплификат и векторную ре-комбинантную плазмиду pET28-oprF-atox обработали рестриктазой Xhol и после очистки в агарозном геле объединили в реакции лигирования с Т4 ДНК-лигазой. Полученную лигазную смесь использовали для трансформации клеток Е. coli штамма BL21(DE3).
Все генно-инженерные манипуляции проводили в соответствии с общепринятыми методиками [10]. Отбор рекомбинантных клонов осуществляли по результатам рестриктного анализа и секвенирования. Секвенирование проводили с помощью капиллярного ДНК секвенатора (Applied Biosystems 310 DNA analyzer) с использованием BigDye Terminator v 3,1 Cycle Sequencing Kit в соответствии с рекомендациями фирмы производителя.
Синтез рекомбинантных белков с использованием созданных продуцентов осуществляли путем индукции экспрессии с помощью изопропил-р-Д-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Белковые продукты анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли. Рекомбинантные белки очищали методом аффинной хроматографии с использованием Ni-сефарозы (GE Healtheare, Швеция) в 8 M буферном растворе мочевины. Белковые препараты переводили в физиологический раствор хлорида натрия с помощью диализа.
Содержание белков определяли в спектрофотометре Genesys 6 (Thermo-scientific, США) при длине волны 280 нм. При расчете концентрации белков использовали следующие коэффициенты экстинкции: 0,6 для OprF-AOprI и 0,5 для AOprF-AOprI, 0,89 для OprF-aTox и 0,96 для OprF-aTox-Aoprl, рассчитанные в программе OMIGA.
Иммуноблоггинг проводили по общепринятой методике [10]. При анализе использовали следующие иммунные сыворотки крови кроликов: к реком-бинантному белку OprF [5], к рекомбинантному белку Oprl [1] и к ре-
комбинантному анатоксину [4]. Для предотвращения неспецифического взаимодействия поликлональной сыворотки крови с белками Е. coli сыворотку обрабатывали бактериальным лизатом [10].
Для проведения иммунизации животных рекомбинантные белки сорбировали в течение суток при температуре 4 — 7°С на гидроксиде алюминия (гель гидроксида алюминия, НПО «Микроген») в соотношении 1:1. Препарат вводили мышам массой 18 — 20 г внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Использовали двукратную с двухнедельным интервалом схему иммунизации.
Через две недели после второй иммунизации животных заражали внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл различными дозами живой вирулентной культуры P. aeruginosa (штамм РА103), выращенной на агаризованной среде Хоттингера. Подсчет погибших и выживших особей проводили в течение семи дней с последующим определением ЛД50, которую вычисляли по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьева: ЛД5о=10л(1§А — lg2x(Bi/Q + В2/С2 + В3/С3 + В4/С4 + В5/С5 — 0,5)). где А — максимальная инфекционная доза в опыте, В — количество животных, павших в группе, С — первоначальное количество животных в группе.
Все работы с животными проводили в соответствии с положениями «Правила проведения работ и использованием экспериментальных животных».
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для получения рекомбинантных белков, содержащих слитые последовательности белка OprF (в полноразмерной и укороченной формах) и белка OprI с отсутствием первых двадцати аминокислот, проведены делеции в плазмидных конструкциях pQE30-oprF-oprI (4,7 kb) и pQE30-AoprF-oprI (4,3 kb), которые использовались для синтеза слитых рекомбинантных белков OprF-OprI (47,9 кДа) и AOprF-OprI (31,6 кДа) [6]. Делеции проводили с помощью ПЦР, ам-плифицируя в линейном виде плазмиды pQE30-oprF-oprI и pQE30-AoprF-oprI, у которых отсутствовали триплеты, кодирующие первые двадцать аминокислот белка OprI. Амплификаты (размером около 4,7 kb и 4,3 kb) после обработки рестриктазой Bglll (содержались в последовательностях, используемых для ПЦР праймерах) замкнули в кольцевые формы в реакции лигирования. В результате экспрессии полученных модифицированных конструкций (pQE30-oprF-Aoprl и pQE30-AoprF-AoprI) в клетках Е. coli штамма М15 наблюдали синтез слитых рекомбинантных белков OprF-AOprI и AOprF-AOprI с массой около 50 и 30 кДа соответственно. Расчетные молекулярные массы данных белков соответствовали 46,8 и 30,5 кДа.
Для создания слитого рекомбинантного белка OprF-aTox-AOprI, включающего в своем составе аминокислотные последовательности основных про-тективных антигенов P. aeruginosa, использовали плазмидную конструкцию pET28-oprF-atox (8 kb), предназначенную для синтеза рекомбинантного белка OprF-aTox (103,6 кДа) [7]. В эту плазмиду встроили амплифицированный делеционный вариант гена oprl по сайту рестрикции Xhol, который был расположен после гена atox. В результате экспрессии полученной плазмидной конструкции pET28-oprF-atox-AoprI в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) происходил синтез рекомбинантного белка OprF-aTox-AOprI с массой около 110кДа.
Рекомбинантные белки хроматографически очищали в колонках с никель-сефарозой, поскольку они имели на N-конце дополнительную 6-гистидино-вую аминокислотную последовательность. Слитые рекомбинантные белки OprF-AOprI и AOprF-AOprI проявили высокую специфичность в иммуноблот-
тинге по отношению к кроличьим сывороткам, иммунным к отдельным ре-комбинантным белкам OprF и Oprl. Слитый рекомбинантный белок OprF-аТох-AOprI был специфичен в иммуноблоттинге при взаимодействии с кроличьими антисыворотками к отдельным рекомбинантным белкам OprF, Oprl и анатоксину.
Защитные свойства очищенных гибридных белков оценены при экспериментальной синегнойной инфекции. При иммунизации рекомбинант-ными белками OprF-AOprI и AOprF-AOprI использовали дозы 25 и 50 мкг, а при иммунизации рекомбинантным белКОМ OprF-aTox- Исследование защитных свойств рекомбинантных белков AOprI использовали ДОЗЫ 50 и Р- aeruginosa 100 мкг. В качестве препарата сравнения при исследовании рекомбинантного OprF-aTox-AOprl использовали рекомбинантный белок OprF-aTox, который вводили в дозах 50 и 100 мкг по аналогичной схеме.
После курса двукратной иммунизации животных заражали различными дозами с двукратным шагом (от 6,25 до 100 млн микробных клеток м.к.) живой вирулентной культурой P. aeruginosa. ЛД50 для мышей, иммунизированных рекомбинантным белком OprF-AOprI, составила 50 млн м.к. при дозе 50 мкг и 53,59 млн м.к. при дозе 25 мкг. ЛД50 в группах мышей, иммунизированных рекомбинантным белком AOprF-AOprI в тех же дозах, составила 46,65 и 43,53 млн м.к. соответственно. Значения ЛД50 в группах мышей, иммунизированных рекомбинантным белком OprF-aTox-AOprI, составили 53,59 и 35,36 млн м.к. для доз введения 50 и 100 мкг соответственно. В то же время, аналогичные значения для групп мышей, иммунизированных рекомбинантным белком OprF-aTox, составляли 40,61 и 32,99 млн м.к. В качестве контроля выступала группа неиммунизированных животных той же партии, которым водили от 3,125 до 50 млн
Группа животных Доза заражения, млн м.к. Количество мышей, павших/выживших ЛД50, млн м.к. иэ*
Иммунизированные 100 8/2 40,61 2,64
ОргР-аТох 50 5/5
(50 мкг на мышь) 25 3/7
12,5 2/8
6,25 0/10
Иммунизированные 100 10/0 32,99 2,14
ОргР-аТох 50 6/4
(100 мкг на мышь) 25 3/7
12,5 2/8
6,25 0/10
Иммунизированные 100 7/3 53,59 3,48
ОргР-аТох-ДОрг1 50 4/6
(50 мкг на мышь) 25 2/8
12,5 1/9
6,25 0/10
Иммунизированные 100 8/2 35,36 2,30
ОргР-аТох-ДОрг1 50 5/5
(100 мкг на мышь) 25 6/4
12,5 1/9
6,25 0/10
Иммунизированные 100 5/5 50,00 3,25
ОргР-ДОрг1 50 4/6
(50 мкг на мышь) 25 4/6
12,5 2/8
6,25 0/10
Иммунизированные 100 7/3 53,59 3,48
ОргР-ДОрг1 50 5/5
(25 мкг на мышь) 25 1/9
12,5 1/9
6,25 0/10
Иммунизированные 100 8/2 46,65 3,03
ДОргР-ДОрг1 50 5/5
(50 мкг на мышь) 25 2/8
12,5 1/9
6,25 0/10
Иммунизированные 100 10/0 43,53 2,83
ДОргР-ДОрг1 50 4/6
(25 мкг на мышь) 25 3/7
12,5 0/10
6,25 0/10
Интактные мыши 50 10/0 15,39 _
(контрольные) 25 7/3
12,5 3/7
6,25 2/8
3,125
Примечание. *ИЭ -ных свойств.
0/10
индекс эффективности защит -
м.к. синегнойной культуры и ЛД50в которой соответствовала 15,39 млн м.к. (табл.)
ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее получены и исследованы гибридные (слитые) рекомбинантные белки наружной мембраны Р. aeruginosa: OprF-Oprl и AOprF-OprI. Первый рекомбинантный белок включал полноразмерную последовательность, а второй С-концевую область (192 — 342 аминокислотные остатки) белка OprF, которые были слиты с полноразмерной последовательностью белка OprI [3]. В результате двукратной иммунизации установлено, что слитый рекомбинантный белок обладал более выраженным защитным эффектом в сравнении с использованием отдельного рекомбинантного белка OprF. Второй слитый рекомбинантный белок — AOprF-OprI, полученный с использованием деле-ционного варианта гена oprF, не показал достоверного преимущества по сравнению с рекомбинантным белком OprF. Хроматографически очищенные рекомбинантные белки OprF-Oprl и AOprF-OprI состояли из двух фракций различной молекулярной массы. Молекулярная масса тяжелых фракций составляла около 50 кДа для белка OprF-Oprl и около 30 кДа для белка AOprF-OprI, что соответствовало расчетным данным для слитых рекомбинантных белков. Молекулярная масса легких фракций соответствовала 40 кДа и 20 кДа. Тяжелые фракции реагировали с антисыворотками к обоим рекомбинантным белкам (OprF и OprI), в то время как легкие только с антисывороткой к ре-комбинантному белку OprF. Разница в размерах фракций у обоих рекомбинантных белков составила 10 кДа, что соответствовало размеру рекомбинантного белка OprI. Предположительно, образование легких фракций происходило из-за отщепления аминокислотных последовательностей белка OprI в клетке-продуценте. Вероятно, в районе первых аминокислотных остатков последовательности белка OprI расположен сайт расщепления полипептидной цепи. Поэтому в рекомбинантных плазмидных конструкциях pQE30-oprF-oprl и pQE30-AoprF-oprI, предназначенных для экспрессии в бактериальных клетках Е. coli штамма Ml5, проведена делеция нуклеотидной последовательности, кодирующей начальные аминокислотные остатки белка OprI. В результате удалось получить слитые рекомбинантные белки OprF-AOprI и AOprF-AOprI, уровень синтеза которых, визуально, оказался в несколько раз выше, чем у штаммов-продуцентов белков OprF-Oprl и AOprF-OprI. При этом не происходило накопления в клетках более легких фракций, а рекомбинантные продукты проявили специфичность как с сывороткой к OprF, так и с сывороткой OprI.
Основой при создании конструкции, предназначенной для синтеза рекомбинантного белка, состоящего из слитых последовательностей основных про-тективных антигенов Р. aeruginosa, стимулирующих иммунные реакции против поверхностных белков OprF и OprI, а также экзотоксина А, служила реком-бинантная плазмида pET28b-oprF-atox [7]. Эта плазмида содержала полноразмерный ген oprF P. aeruginosa (1050 н.п.), встроенный по сайту рестрикции Hindlll. После гена oprF по сайтам рестрикции Hindlll и Xhol был встроен делеционный вариант гена toxA (ген, кодирующий экзотоксин А Р. aeruginosa) — atox. Ген atox, размером 1593 н.п., кодировал полноразмерные первый и второй домены экзотоксина А и только часть третьего цитотоксического домена. Эти слитые последовательности генов oprF и atox находились под контролем регуляторных участков для экспрессии в бактериальных клетках Е. coli штамма BL21 (DE3). В конце последовательности гена atox отсутствовал стоп-
кодон, что давало возможность для встраивания следующего гена, который представлял собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок OprI P. aeruginosa, по сайту рестрикции Xhol. При этом проводили встраивание не полноразмерного гена, а последовательности с отсутствующими нуклео-тидами, кодирующих первые двадцать аминокислот. В результате был получен слитый рекомбинантный белок OprF-aTox-AOprI, специфически реагирующий в иммуноблотгинге с антисыворотками к отдельным рекомбинантным белкам OprF, oprl и анатоксину.
При подборе иммунизирующих доз для оценки защитных свойств в настоящем исследовании использовали дозы 25 и 50 мкг для слитых рекомби-нантных белков OprF-AOprI и AOprF-AOprl. Для рекомбинантного белка OprF-AOprI, вводимого в дозе 25 мкг, индекс эффективности защитных свойств (соотношение значения ЛД50 в опытной группе к значению ЛД50 в контрольной группе) соответствовал 3,48, для варианта AOprF-AOprl — 3,03.
При исследовании слитого рекомбинантного белка OprF-aTox-AOprI использовали дозы 50 и 100 мкг. Наиболее эффективной для этого рекомбинантного белка можно считать дозу 50 мкг, при которой индекс эффективности соответствовал индексу эффективности слитого рекомбинантного белка OprF-AOprI — 3,48. Использование более высокой дозы в 100 мкг вызывало снижение индекса эффективности до 2,3.
Полученные предварительные результаты открывают перспективы для дальнейших исследований по созданию специфических иммунобиологических препаратов на основе слитых рекомбинантных белков синегнойной палочки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гатыпова Е.В., Злыгостев С.А., Калошин A.A., Михайлова H.A. Получение рекомбинантного белка I наружной мембраны (Oprl) Pseudomonas aeruginosa и исследование его антигенных свойств. Журн. микробиол. 2008, 6: 50-53.
2. Калошин A.A., Леонова Е. И., Солдатенкова A.B., Михайлова H.A. Исследование про-тективных свойств комплекса рекомбинантного белка F наружной мембраны и рекомбинантного анатоксина Pseudomonas aeruginosa. Вестник РАМН. 2016, 71 (1): 5-10.
3. Калошин A.A., Михайлова H.A. Леонова Е.И. Получение гибридного белка ÖprF-Oprl Pseudomonas aeruginosa. Журн. микробиол. 2012, 3: 35-43.
4. Калошин A.A., Исаков М.А., Михайлова H.A., ВертиевЮ.В. Получение рекомбинант-ной атоксической формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012, 154 (9): 330-335.
5. Калошин A.A., Гатыпова Е.В., Михайлова H.A. Получение рекомбинантных форм белка F наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммуногенных свойств. Биотехнология. 2011,2:74-84.
6. Лазарева A.B., Чеботарь И.В., Крыжановская O.A. и др. Pseudomonas aeruginosa: пато-генность, патогенез и патология. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015,17 (3): 170-186.
7. Солдатенкова A.B., Михайлова H.A., Зимина Е.М. и др. Получение рекомбинантного слитого белка OprF-aTox Pseudomonas aeruginosa, обладающего защитными свойствами. Биопрепараты. 2016,16 (2): 96-100.
8. Chatteijee М., Anju С.Р., Biswas L. et al. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. Int. J. Med. Microbiol. 2016, 306 (1): 48-58.
9. Döring G., Pier G.B. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa. Vaccine. 2008, 26 (8): 1011-1024.
10. Sambrook J.F., Russell D.W. Molecular Cloning. 2001.
Поступила 22.05.17
Контактная информация: Калошин A.A.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-49-00
