CC BY
29
УДК 577.355
ПОЛУЧЕНИЕ И ОЦЕНКА БИОДОСТУПНОСТИ НАНОЧАСТИЦ С ГАТИФЛОКСАЦИНОМ
Е.В. Блынская12, К.В. Алексеев2, С.Э. Кондаков, Р.Н. Аляутдин1, В.Ю. Балабаньян1
(кафедра химической кинетики; e-mail: [email protected])
Изучена фармакокинетика новой транспортной формы противотуберкулезного препарата га-тифлоксацина в виде наночастиц. В опытах in vivo на лабораторных животных показано, что лекарственная форма гатифлоксацина в виде наночастиц на сополимере DL-молочной и гли-колевой кислот по сравнению с лекарственной формой, выпускаемой промышленностью, имеет измененный фармакокинетический профиль. Для полученного в виде наночастиц препарата в плазме крови увеличивается период полувыведения (Т1/2) и среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT). Показано, что площадь под фармако-кинетической кривой "концентрация - время" (AUC(0^36)) увеличивается в основном за счет терминального участка кривой.
Ключевые слова: наночастицы, гатифлоксацин, сополимер молочной и гликолевой кислот, полимерный носитель.
Проблема лечения туберкулеза становится все более актуальной, так как появились его новые формы, которые не поддаются лечению существующими лекарственными средствами [1]. Под лекарственно устойчивыми штаммами в настоящее время понимаются микробактерии туберкулеза, устойчивые к двум и более противотуберкулезным препаратам, прежде всего к изониазиду и рифампицину. Есть основания полагать, что такое положение является результатом, с одной стороны, появления штаммов возбудителей, резистентных по отношению к применяемым лекарствам, с другой - снижением общего уровня иммунитета населения и недостаточным лекарственным обеспечением [2, 3]. Одним из перспективных подходов к лекарственной терапии таких штаммов является создание новых транспортных форм фармацевтических препаратов в виде наночастиц с контролируемым высвобождением действующего вещества на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях [4]. Высокая эффективность терапии новых транспортных форм, содержащих наночастицы, основана прежде всего на их способности обеспечивать эффективный транспорт лекарственных веществ в макрофаги [5]. Кроме того, биоразлагаемые наночастицы обладают более низкой токсичностью по сравнению с обычной лекарственной формой [6]. Все это делает использование наночастиц одним из наиболее перспективных на-
правлений создания инновационных транспортных форм доставки лекарственных веществ [7].
В настоящее время одним из наиболее перспективных противотуберкулезных препаратов для использования против мультирезистентных штаммов является гатифлоксацин (ГТФК) (рис. 1) (7-(3-метилпипера-зин-1 -ил)-8-метокси-4-оксо-6-фтор-1 -циклопропил-1,4-дигидро-хинолин-3-карбоновой кислоты сесквигидрат) (8-метоксифторхинолон).
Цель настоящей работы - исследование фармакоки-нетических параметров ГТФК с помощью наночастиц и в традиционной форме.
В работе использовали промышленно выпускаемый гатифлоксацина сесквигидрат (НД 42-13523-05), сополимер БЬ-молочной и гликолевой кислот
о
F, --- А соон
Рис. 1. Структурная формула ГТФК
1 ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, 2 ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва.
("Boehringer Ingelheim"), а также блок-сополимеры окиси этилена и окиси пропилена - плюроник Ф68 (BASF) без дополнительной очистки. Размеры полученных наночастиц в растворе определяли при помощи наносайзера "Nicomp 380 submicron Particle Sizer" ("Particle Sizing Systems", США). Чистоту исходного ГТФК и его определение в фармакокинетических исследованиях проводили при помощи жидкостного хроматографа "Series 200" ("Perkin Elmer", США) с петлевым краном-дозатором фирмы "Rheodyne" (модель 7125, США).
Наночастицы ГТФК получали методом двойного эмульгирования. В 20 мл дихлорметана растворяли 400 мг DL-молочной и гликолевой кислот сополимера, в 10 мл очищенной воды растворяли 400 мг ГТФК. При непрерывном перемешивании на магнитной мешалке (350 об/мин) к полученному раствору по каплям добавляли раствор сополимера DL-молочной и гликолевой кислот в дихлорметане. Перемешивание продолжали в течение 3-5 мин (эмульсия № 1). Готовили 1%-й водный раствор плю-роника Ф68 (сополимеры окиси этилена и пропилена). Эмульсию № 1 по каплям прибавляли к приготовленному 1%-у раствору плюроника Ф68 (100 мл), проводя при этом непрерывное перемешивание на магнитной мешалке при 400 об/мин (эмульсия № 2). Процесс перемешивания осуществляли в течение 3 ч до полного удаления дихлорметана из раствора. Приготовленную смесь фильтровали через пористый фильтр (0,22 мкм), разливали по флаконам и подвергали лио-филизации в течение 24 ч на лиофильной сушке "Alpha Christ 2-6" (Германия). Полученные флаконы с препаратом отправляли на радиационную стерилизацию при дозе облучения 15 кГр.
Размер полученных наночастиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии на приборе "Nicomp 380" ("Particle Sizing Systems", США). Лиофилизат растворяли в 2 мл очищенной воды, отбирали аликвоту (50 мкл) и помещали в кювету, содержащую 3 мл воды. Размер частиц определяли сразу после растворения при следующих рабочих параметрах: угол рассеяния 90°, температура 25°С, вязкость 0,001 Па, показатель преломления 1,333. Полученные результаты по распределению частиц по размерам приведены в табл. 1.
Степень сорбции определяли как отношение количества ГТФК, включенного в полимерную матрицу, к общему количеству ГТФК в лекарственной форме. Свободный и включенный ГТФК разделяли методом ультрацентрифугирования на центрифуге "J21" фирмы
Т а б л и ц а 1
Распределение наночастиц ГТФК по размерам (pH 2,6)
Номер эмульсии Размер, нм Стандартное отклонение, нм Количество, % (по массе)
1 5 0,8 1,1
2 339 22 97,3
3 423 31 1,6
"Бесктап". Лиофилизат ресуспендировали, добавляя исходный объем очищенной воды. В пробирку помещали 3 мл суспензии и центрифугировали 70 мин при 2000С^. Степень сорбции определяли по формуле:
степень сорбции, % = 100%х(С - Ссвоб)/С
теор'
где Сисх - исходная концентрация ГТФК в среде образования матрицы, Ссвоб - концентрация ГТФК в надосадочной жидкости. Концентрацию ГТФК в су-пернатанте определяли спектрофотометрически в фосфатном буфере.
Количественное содержание ГТФК в надосадочной жидкости определяли методом ВЭЖХ. Пробоподготовку осуществляли следующим образом: к содержимому флакона добавляли 3 мл ди-метилформамида, взвесь количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, объем доводили до метки диметилформамидом и проводили интенсивное встряхивание в течение 30 с на аппарате "358Б" (Польша). После этого отбирали 1,0 мл образца, разбавляли в пять раз смесью вода:диметилформамид (2:3) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин.
Фармакокинетические исследования проводили на лабораторных животных (12 здоровых кроликов-самцов породы шиншилла). Животных содержали в стационарных условиях при естественном световом режиме и стандартном рационе (комбикорм, вода). За 12 ч до начала эксперимента животных лишали пищи, оставляя свободный доступ к воде. Непосредственно перед началом эксперимента кроликов помещали в специальные станки и проводили катетеризацию краевой ушной вены. Исследуемые субстанции ГТФК вводили животным однократно путем внутривенной инфузии в дозе 2,86 мг/кг.
Для проведения фармакокинетических экспериментов экстракцию ГТФК из образца крови лабораторного животного осуществляли по следующей методике. К пробам плазмы крови (0,5 мл) добавляли 2,5 мл этилацетата, пробирку встряхивали в течение
15 мин в аппарате для встряхивания и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. Органическую фазу отделяли и выпаривали на водяной бане при 70°С в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,1 мл подвижной фазы. 50 мкл полученного раствора вводили в хроматографическую колонку с помощью петлевого крана-дозатора. Процент экстракции ГТФК из плазмы крови определяли по формуле:
^экстр = tga/tgßx 100%,
где tga, tgß - тангенс угла наклона соответственно внутренней и внешней калибровочных кривых по отношению к оси абсцисс.
Хроматографический анализ содержания ГТФК в плазме крови кроликов проводили на жидкостном хроматографе "Series 200", оснащенном градиентным насосом, спектрофотометрическим детектором на компьютере с программным обеспечением "MultiChrom". Условия хроматографирования: стационарная фаза - колонка "X Terra MS" фирмы "Waters" с обращенно-фазным сорбентом C18 (3x50 мм; 5 мкм); подвижная фаза - смесь ацето-нитрила и 0,025 M раствора Na2HPO4 с рН 3; (20:80, по объему); скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин; изократический режим работы насоса; детектирование на УФ-спектрофотометре при X = 293 нм, соответствующей максимуму поглощения вещества; объем петли хроматографа 50 мкл; температура хроматографирования 21°С. Перед хроматографированием подвижную фазу фильтровали и дегазировали на ультразвуковой бане. Такая система очистки позволила избежать появления дополнительных пиков во время анализа. Предел обнаружения разработанной методики ~25 нг/мл.
По результатам экспериментов была проведена оценка качества разработанной лекарственной формы ГТФК в виде лиофилизата наночастиц для приготовления раствора для инъекций. Анализ полученных данных позволил установить, что лиофилизат ГТФК для приготовления инъекций на основе сополимера DL-молочной и гликолевой кислот значительно медленнее выводится и соответственно дольше находится в кровяном русле после введения тест-препарата (Г1/2 = 17,32±1,05 ч), а не референс-препарата (Г1/2 = 10,13±2,83 ч). Полученные графики приведены на рис. 2. Дополнительным подтверждением более интенсивной элиминации ГТФК из системного кровотока животных после введения ре-ференс-препарата являются также низкая величина среднего времени удерживания ГТФК в организме (MRT = 9,44±1,25 ч); более высокий клиренс
Рис. 2. Фармакокииетические кривые усредненных концентраций ГТФК в плазме крови кроликов после однократного перо рального введения таблеток и капсул препарата в дозе 68,3 мг/кг (n = 6, M±SD): 1 - капсулы гатифлоксацина (200 мг), 2 - таблетки гатифлоксацина (200 мг)
(Cl = 122,67±13,27 мл/кг/ч) в сравнении с аналогичными фармакокинетическими параметрами, рассчитанными для тест-препарата (MRT = 12,8±0,40 ч; Cl = 74,45±4,29 мл/кг/ч). Полученные данные для тест-препарата и препарата сравнения приведены в табл. 2. Сравнение абсолютных величин параметров AUC
(0^36)
и Смакс п0казал0, что Смакс ГТФК
после внутривенного введения тест и референс-пре-парата путем константной инфузии не различаются (4,105±0,880 и 3,903±0,355 мкг/мл соответственно), однако величина ЛИС
(0^36)
выше для тест-препара-
та (30,342±1,570 ч-мкг/мл) по сравнению с рефе-ренс-препаратом (21,717±2,077 ч-мкг/мл), в основном за счет терминального участка фармакокинети-ческой кривой.
Таким образом, проведенное на кроликах исследование особенностей фармакокинетики разработанной лекарственной формы ГТФК в виде наночастиц на сополимере DL-молочной и гликолевой кислот по сравнению с лекарственной формой, выпускаемой промышленностью ("KRKA", Словения), показало, что введение ГТФК в виде наночастиц DL-молоч-ной и гликолевой кислот приводит к изменению фар-макокинетического профиля препарата в плазме крови: увеличивается период полувыведения (Г1/2) и среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT), площадь под фармакоки-нетической кривой "концентрация-время" (AUC(0^36)) также возрастает (в основном за счет терминального участка кривой).
Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле в концентрациях, достаточных для эффективного воздействия, что позволяет предположить пролонгацию действия ГТФК в виде наночастиц на сополимере DL-молочной и гликолевой кислот.
Т а б л и ц а 2
Значения фармакокинетических параметров ГТФК после однократного внутривенного введения изучаемых лекарственных
форм кроликам в дозе 2,86 мг/кг
Тест-препарат
Номер образца Т 1 макс с макс АиС(0^36) АиС^») С1 V* V ' 55 Т1/2 ке! МЯТ
ч мкг/мл чхмкг/мл чхмкг/мл мл/ч/кг л/кг л/кг ч ч-1 Ч
1 0,5 2,786 29,242 38,196 74,88 1,97 1,87 18,26 0,038 13,58
2 0,5 4,361 31,737 39,435 72,52 1,67 1,56 15,97 0,043 12,44
3 0,5 3,283 28,204 35,038 81,63 1,92 1,79 16,28 0,043 12,82
4 0,5 4,931 30,931 39,293 72,79 1,85 1,67 17,62 0,039 12,57
5 0,5 4,910 29,649 37,604 76,06 1,89 1,74 17,23 0,040 12,75
6 0,5 4,356 32,286 41,535 68,86 1,85 1,64 18,58 0,037 12,66
М 0,5 4,105 30,342 38,517 74,45 1,86 1,71 17,32 0,040 12,80
ББ - 0,880 1,570 2,172 4,29 0,10 0,11 1,05 0,002 0,40
Доверительный интервал а = 0,05 - 0,704 1,257 1,738 3,43 0,08 0,09 0,84 0,002 0,32
Референс-препарат
Номер образца Т макс с макс АИС(0^36) АИС(0^») С1 V* V ' 55 Т1/2 ке! МЯТ
ч мкг/мл чхмкг/мл чхмкг/мл мл/ч/кг л/кг л/кг ч ч-1 Ч
7 0,5 3,783 25,812 29,787 96,01 1,86 1,69 13,44 0,052 11,84
8 0,5 4,201 21,451 22,117 129,31 1,39 1,26 7,45 0,093 8,63
9 0,5 3,796 21,175 22,815 125,36 1,63 1,52 9,02 0,077 9,29
10 0,5 3,357 20,915 21,740 131,56 1,51 1,29 7,94 0,087 8,35
11 0,5 3,912 21,065 22,299 128,26 1,66 1,50 9,00 0,077 9,51
12 0,5 4,371 19,885 22,781 125,54 2,53 1,88 13,94 0,050 9,03
М 0,5 3,903 21,717 23,590 122,67 1,76 1,53 10,13 0,073 9,44
ББ - 0,355 2,077 3,063 13,27 0,41 0,24 2,83 0,018 1,25
Доверительный интервал а = 0,05 - 0,284 1,662 2,451 10,62 0,32 0,19 2,26 0,014 1,00
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Нечаева О.Б. // Уральское медицинское обозрение. 2001. № 1. С. 16.
2. МачневаЛ.А. // Фармац. вестн. 2000. № 13. С. 9.
3. O 'Brien R.J., Nunn P.P. // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2001. 163. Р. 1055.
4. Krishna K. et al. // J. Drug Targeting. 2008. 16. Р. 311.
5. ВодовозоваЕ.Л., КузнецоваН.Р., КадыковВ.А.,Хуцян С.С., Гаенко Г.П., Молотковский Ю.Г. // Российские нанотехно-логии. 2008. 3. № 3-4. С. 162.
6. Минъко Н.И., Нарцев В.М. Методы получения и свойства нанообъектов. Белгород, 2007.
7. Себякин Ю.Л., Буданова У.А., Колоскова О.О., Миронов А.Ф. // Российские нанотехнологии. 2009. 4. № 5-6. С. 108.
8. Алексеев К.В., Аляутдин Р.Н., Блынская Е.В., КвинхБ.Т. // Вестник новых медицинских технологий. 2009. 16. № 2. С. 142.
9. Гусева А.Ф., Нейман А.Я., Нохрин С.С. Методы получения наноразмерных материалов. Екатеринбург, 2008.
Поступила в редакцию 20.01.10
SYNTHESIS OF THE NANO PARICLES OF GATIFLOXACINE WITH THE (D,L-LACTIDE GLYCOLIDE) CARRIER. COMPARATIVE PHARMACOLOGICAL KINETICS INVESTIGATION.
Ye.V. Blynskaya, K.V. Alekseyev, S.E. Kondakov, R.N. Alyautdin, V.Yu. Balabaniyan
(Division of Kinetic Chemistry)
Synthesis and investigation of the nano paricles of gatifloxacine with the (D,L-lactide glycolide) as a carrier was described. The differences of pharmacological kinetics of gatifloxacine in nano particles and as is forms was investigated.
Key words: nanoparticles, gatifloxacine, D,L-lactide glycolide, polymer carrier.
Сведения об авторах: Блынская Евгения Викторовна - аспирант кафедры фармакологии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, мл. науч. сотр. лаборатории готовых лекарственных форм ГУ НИИ им. В.В. Закусова РАМН; Кондаков Сергей Эмилъевич - ст. науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ, докт. фарм. наук ([email protected]); Алексеев Константин Викторович - зав. лаб. готовых лекарственных форм ГУ НИИ им. В.В. Закусова РАМН, докт. фарм. наук; Аляутдин Ренад Николаевич — зав. кафедрой фармакологии ГОУ ВПО ММА им И.М. Сеченова, докт. фарм. наук; Балабанъян Вадим Юръевич - доцент кафедры фармакологии ГОУ ВПО ММА им И.М. Сеченова, канд. фарм. наук.
