Научная статья на тему 'ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ САРКОМ МЯГКИХ ТКАНЕЙ И ОСТЕОГЕННЫХ САРКОМ ДЛЯ ТРАНСЛЯЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ'

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ САРКОМ МЯГКИХ ТКАНЕЙ И ОСТЕОГЕННЫХ САРКОМ ДЛЯ ТРАНСЛЯЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
258
59
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
саркома / клеточная линия / культивирование опухолевых клеток. / sarcoma / cell line / tumor cell culture

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Н.А. Авдонкина, А.Б. Данилова, В.А. Мисюрин, Е.А. Просекина, Н.В. Емельянова

Редкая встречаемость, высокая гистологическая гетерогенность, меняющиеся стандарты классификации и сложность культивирования in vitro являются причинами дефицита клеточных линий сарком мягких тканей и остеогенных сарком, необходимых для проведения крупномасштабных доклинических исследований. Получение и характеристика новых клеточных линий сарком имеют большое значение для создания клеточных моделей, позволяющих изучать процессы онкогенеза и метастазирования опухолей из тканей мезенхимного гистогенеза при разработке новых методов лечения. Цель работы: создание коллекции новых охарактеризованных клеточных линий сарком мягких тканей и остеогенных сарком, пригодных для трансляционных исследований. В исследовании использовали образцы опухолей 71 пациента НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с диагнозом «саркома», полученных интраоперационно за период 2013–2020 гг. Для культивирования клеток сарком был разработан стандартный протокол. Была изучена пролиферативная, инвазивная и миграционная активность полученных клеточных линий в монослое и сфероидах, проведены HLA типирование, оценка экспрессии раково-тестикулярных генов и маркеров стволовых клеток СD133 и ALDH1. Создана коллекция клеточных линий сарком, включающая 54 постоянные клеточные линии 18 гистологических подтипов: 39 культур сарком мягких тканей и 15 культур остеогенных сарком, культуры метастатического происхождения составили 81,5% (n=44). В процессе длительного культивирования увеличилась пролиферативная активность клеток сарком (p<0,05). Выявлены статистически значимые различия по параметрам миграционной активности между культурами мягкотканных и остеогенных сарком (р<0,05). Обнаружена высокая степень гетерогенности транскрипционной активности изучаемых раково-тестикулярных генов, отсутствие экспрессии выявлено в 19,2% случаев. С наибольшей частотой детектировали активность генов PRAME (55,8%) и GAGE1 (50%), была обнаружена коэкспрессия этих генов (rho=0,5025; p=0,00015). Экспрессия PASD1 коррелировала с GAGE1 (rho=0,6951; p=0,00001), PRAME (rho=0,5743; p=0,00001). Также была выявлена коэкспрессия генов NY-ESO-1 и MAGEA1 (rho=0,4027; p=0,00308). Установлена обратная корреляция средней силы между количеством ALDH1+-клеток и CD133+-клеток в культурах и значением времени до прогрессирования заболевания у пациентов (rho=0,505, p=0,033; rho=-0,513, p=0,021, соответственно). Полученные и охарактеризованные клеточные линии могут стать важным компонентом для реализации перспективных трансляционных исследований, востребованным инструментом для решения разнообразных задач современной медицины, таких как протеомные исследования, выявление важных сигнальных механизмов, поиск таргетных молекул для создания новых терапевтических подходов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Н.А. Авдонкина, А.Б. Данилова, В.А. Мисюрин, Е.А. Просекина, Н.В. Емельянова

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE OBTAINING AND CHARACTERIZATION NEW SOFT TISSUE SARCOMA AND OSTEOGENIC SARCOMA CELL LINES FOR TRANSLATIONAL RESEARCH

The rare occurrence, high histological heterogeneity, changing classification standards, and complexity of cultivation are the reasons for the failure of soft tissue and bone sarcomas (STBS) cell lines required for large-scale preclinical studies. Obtaining and characterization new STBS cell lines is the great importance for creating cell models that allow us to study the processes of oncogenesis and metastasis of mesenchymal tumors in the development of new treatment methods. Purpose: to create a collection of new characterized STBS cell lines suitable for translational research. In the study were used tumor samples from 71 patients of the N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology with the diagnosis of “sarcoma”. The samples were received during the operation in period 2013–2020. A standard protocol was developed for the cultivation of STBS cells. The proliferative, invasive and migration activity of the obtained cell lines in monolayer and spheroids was studied, HLA typing was performed, and the expression of cancer-testicular genes (CTG) and stem cell markers (CD133 and ALDH1). A collection of STBS cell lines, which includes 54 stable cell lines of 18 histological subtypes, including 39 soft tissue and 15 bone sarcomas cultures, with the metastatic culture of 81.5% was created (n=44). In the process of long-term cultivation there was an increase in the proliferative activity of sarcomas cells (p<0,05). Statistically significant differences in migration activity parameters between soft tissue and bone sarcomas cultures were revealed (p<0,05). A high degree of heterogeneity of the transcriptional activity of the studied CTG was found, and the absence of expression was detected in 19.2% of cases. The activity of the PRAME (55.8%) and GAGE1 (50%) genes was detected with the highest frequency (rho=0.5025; p=0.00015). PASD1 expression correlated with GAGE1 (rho=0.6951; p=0.00001), PRAME (rho=0.5743; p=0.00001). Co-expression of the NY-ESO-1 and MAGEA1 genes was also detected: (rho=0.4027; p=0.00308). The inverse correlation of average strength between the number of ALDH1+ cells and CD133+cells in cultures and the value of time to progression in patients (rho=-0.505, p=0.033; rho=-0.513, p=0.021, respectively) was established. The received and characterized cell lines can become an important component for realization of perspective translational research, a demanded tool for solution of various tasks of modern medicine, such as proteomic research, revealing of important signal mechanisms, search of target molecules for creation of new therapeutic approaches.

Текст научной работы на тему «ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ САРКОМ МЯГКИХ ТКАНЕЙ И ОСТЕОГЕННЫХ САРКОМ ДЛЯ ТРАНСЛЯЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ»

Поступила: 03.06.2020 Принята к печати: 09.10.2020 Опуликована on-line: 01.12.2020

DOI: 10.23868/202011014

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ САРКОМ МЯГКИХ ТКАНЕЙ И ОСТЕОГЕННЫХ САРКОМ ДЛЯ ТРАНСЛЯЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Н.А. Авдонкина1, А.Б. Данилова1, В.А. Мисюрин2, Е.А. Просекина1, Н.В. Емельянова1, Т.Л. Нехаева1, О.В. Скачкова1, А.В. Новик1, Н.П. Пипиа1, Г.И. Гафтон1, Е.В. Левченко1, А.М. Беляев1, И.А. Балдуева1

1 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург, Россия

2 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина, Москва, Россия

THE OBTAINING AND CHARACTERIZATION NEW SOFT TISSUE SARCOMA AND OSTEOGENIC SARCOMA CELL LINES FOR TRANSLATIONAL RESEARCH

N.A. Avdonkina1, A.B. Danilova1, V.A. Misyurin2, E.A. Prosekina1, N.V. Emelyanova1, T.L. Nekhaeva1, O.V. Skachkova1, A.V. Novik1, N.P. Pipia1, G.I. Gafton1, E.V. Levchenko1, A.M. Belyaev1, I.A. Baldueva1

1 N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Moscow, Russia

2 N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Moscow, Russia

e-mail: nataliaavdonkina@gmail.com

Редкая встречаемость, высокая гистологическая гетерогенность, меняющиеся стандарты классификации и сложность культивирования in vitro являются причинами дефицита клеточных линий сарком мягких тканей и остеогенных сарком, необходимых для проведения крупномасштабных доклинических исследований. Получение и характеристика новых клеточных линий сарком имеют большое значение для создания клеточных моделей, позволяющих изучать процессы онкогенеза и ме-тастазирования опухолей из тканей мезенхимного гистогенеза при разработке новых методов лечения.

Цель работы: создание коллекции новых охарактеризованных клеточных линий сарком мягких тканей и остеогенных сарком, пригодных для трансляционных исследований.

В исследовании использовали образцы опухолей 71 пациента НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с диагнозом «саркома», полученных интраоперационно за период 2013-2020 гг. Для культивирования клеток сарком был разработан стандартный протокол. Была изучена пролиферативная, инвазивная и миграционная активность полученных клеточных линий в монослое и сфероидах, проведены HLA типирование, оценка экспрессии раково-тестику-лярных генов и маркеров стволовых клеток CD133 и ALDH1.

Создана коллекция клеточных линий сарком, включающая 54 постоянные клеточные линии 18 гистологических подтипов: 39 культур сарком мягких тканей и 15 культур остеогенных сарком, культуры метастатического происхождения составили 81,5% (n=44). В процессе длительного культивирования увеличилась пролиферативная активность клеток сарком (p<0,05). Выявлены статистически значимые различия по параметрам миграционной активности между культурами мягкотканных и остеогенных сарком (р<0,05). Обнаружена высокая степень гетерогенности транскрипционной активности изучаемых ра-ково-тестикулярных генов, отсутствие экспрессии выявлено в 19,2% случаев. С наибольшей частотой детектировали активность генов PRAME (55,8%) и GAGE1 (50%), была обнаружена коэкспрессия этих генов (rho=0,5025; p=0,00015). Экспрессия PASD1 коррелировала с GAGE1 (rho=0,6951; p=0,00001), PRAME (rho=0,5743; p=0,00001). Также была выявлена коэкспрессия генов NY-ESO-1 и MAGEA1 (rho=0,4027; p=0,00308). Установлена обратная корреляция средней силы между количеством ALDH1+-клеток и CD133+-клеток в культурах и значением времени до прогрессирования заболевания у пациентов (rho=-0,505, p=0,033; rho=-0,513, p=0,021, соответственно).

Полученные и охарактеризованные клеточные линии могут стать важным компонентом для реализации перспективных трансляционных исследований, востребованным инструментом для решения разнообразных задач современной медицины, таких как протеомные исследования, выявление важных сигнальных механизмов, поиск таргетных молекул для создания новых терапевтических подходов.

Ключевые слова: саркома, клеточная линия, культивирование опухолевых клеток.

The rare occurrence, high histological heterogeneity, changing classification standards, and complexity of cultivation are the reasons for the failure of soft tissue and bone sarcomas (STBS) cell lines required for large-scale preclinical studies. Obtaining and characterization new STBS cell lines is the great importance for creating cell models that allow us to study the processes of oncogenesis and metastasis of mesenchymal tumors in the development of new treatment methods.

Purpose: to create a collection of new characterized STBS cell lines suitable for translational research.

In the study were used tumor samples from 71 patients of the N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology with the diagnosis of "sarcoma". The samples were received during the operation in period 2013-2020. A standard protocol was developed for the cultivation of STBS cells. The proliferative, invasive and migration activity of the obtained cell lines in monolayer and spheroids was studied, HLA typing was performed, and the expression of cancer-testicular genes (CTG) and stem cell markers (CD133 and ALDH1).

A collection of STBS cell lines, which includes 54 stable cell lines of 18 histological subtypes, including 39 soft tissue and 15 bone sarcomas cultures, with the metastatic culture of 81.5% was created (n=44). In the process of long-term cultivation there was an increase in the proliferative activity of sarcomas cells (p<0,05). Statistically significant differences in migration activity parameters between soft tissue and bone sarcomas cultures were revealed (p<0,05). A high degree of heterogeneity of the transcriptional activity of the studied CTG was found, and the absence of expression was detected in 19.2% of cases. The activity of the PRAME (55.8%) and GAGE1 (50%) genes was detected with the highest frequency (rho=0.5025; p=0.00015). PASD1 expression correlated with GAGE1 (rho=0.6951; p=0.00001), PRAME (rho=0.5743; p=0.00001). Co-expression of the NY-ESO-1 and MAGEA1 genes was also detected: (rho=0.4027; p=0.00308). The inverse correlation of average strength between the number of ALDH1 + cells and CD133+cells in cultures and the value of time to progression in patients (rho=-0.505, p=0.033; rho=-0.513, p=0.021, respectively) was established.

The received and characterized cell lines can become an important component for realization of perspective translational research, a demanded tool for solution of various tasks of modern medicine, such as proteomic research, revealing of important signal mechanisms, search of target molecules for creation of new therapeutic approaches.

Keywords: sarcoma, cell line, tumor cell culture.

оригинальные исследования

93

Введение

саркомы — это редко встречающиеся опухоли, доля которых составляет приблизительно 1,5% от всей онкологической заболеваемости взрослого населения российской Федерации [1]. Ежегодно регистрируется около 3000 случаев сарком мягких тканей (сМт) и 1000 случаев остеогенных сарком (ос). По распространенности у детей сМт и ос занимают третье место. В настоящее время прогноз при саркомах остается в целом неблагоприятным и находится в прямой зависимости от гистологического подтипа опухоли и ее индивидуальных характеристик, таких как размер и степень злокачественности [2]. Изучение биологии сМт и ос с использованием тест-систем на основе клеточных моделей in vitro — необходимый этап для разработки новых стратегий лечения от этого вида злокачественных новообразований. одним из подходов, определяющим успех данного направления, является получение охарактеризованных клеточных линий сМт и ос.

Биобанки клеточных культур — важнейший источник материала для молекулярно-генетических и трансляционных исследований. Использование культур клеток in vitro позволяет изучать непосредственно опухолевые клетки без следового влияния микроокружения, исключая любые неопухолеспецифические белки. со времени депонирования первой культуры клеток опухоли человека HeLa в 1951 г. [3] получены и охарактеризованы десятки тысяч малигнизированных клеточных линий, которые могут быть использованы научным сообществом.

В то же время, в мировых клеточных коллекциях представлено лишь ограниченное число хорошо охарактеризованных линий сМт и ос. Это связано с постоянным совершенствованием гистологической и иммуногистохи-мической диагностики опухолей и изменениями, которые претерпевает классификация опухолей ВоЗ от издания к изданию, а также с появлением новых нозологических единиц [4]. Как следует из работы X. Pan и соавт. (2016), для исследователей доступна всего 121 клеточная линия сарком, которые представляют 21 гистологический тип и хранятся в 7 крупнейших биобанках мира [5].

Необходимо отметить, что количество доступных клеточных линий отдельных гистотипов отражает не их распространенность, а легкость приспособления клеток этих опухолей к культивированию в условиях in vitro. так, клинически липосаркома встречается гораздо чаще, чем остеогенная саркома, тем не менее, в биобанках хранится всего 4 клеточные линии липосар-комы и 41 линия остеогенной саркомы. Многие клеточные линии являются клонами одной и той же культуры. такие редкие саркомы, как внескелетная миксоидная хондросаркома и плеоморфная липосаркома не представлены ни в одном из проанализированных биобанков. Во Всероссийской Коллекции Клеточных Культур человека и животных (http://www.cytspb.rssi.ru) депонированы 10 клеточных линий сМт и ос. В целом, обращает на себя внимание недостаточная гистологическая характеристика подавляющего большинства клеточных линий, как в россии, так и за рубежом. В частности, 10 из 13 представленных культур раб-домиосаркомы в мировых биобанках и 2 из 3 отечественных не дифференцированы на подтипы, каждый из которых имеет свои клинические особенности, что существенно ограничивает дальнейшее использование этих клеточных линий. Кроме того, с момента получения клеточных линий диагностические критерии для многих гистологических подтипов сарком существенно изменились, а отсутствие возможности пересмотра гистологических препаратов первичной опухоли

не позволяет переклассифицировать эти клеточные линии, снижая их ценность для исследований.

Идеальным решением, позволяющим избежать в дальнейшем появление подобных вопросов, было бы депонирование клеточных линий совместно с образцами первичной опухоли и ее гистологическими препаратами для беспрепятственной возможности проведения дополнительных исследований при необходимости [5]. такой возможностью обладают биобанки, связанные с крупными клиническими научно-исследовательскими центрами. одним из подобных учреждений является ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава россии.

Цель работы: создание коллекции новых хорошо охарактеризованных клеточных линий ОМт и ос, пригодных для трансляционных исследований.

Материал и методы

Образцы опухолей

В период с 2013 по 2020 гг. интраоперационно были получены образцы опухолей 71 пациента НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с подтвержденным биопсией диагнозом саркомы, послужившие материалом для получения опухолевых клеточных культур. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом НМИЦ (протокол № 20 от 23.11.2017), все пациенты подписывали информированное согласие, образцы тканей хранили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и использовали в соответствии с Законом о тканях человека от 2004 г. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1.

Культивирование опухолевых клеток

Клетки выделяли и культивировали по методу р.Я. Фрешни (2010) [6] c собственными модификациями [7]. В течение 30 мин. после резекции опухоли фрагменты размером не менее 1 см3 отбирали в пробирки со стерильной питательной средой DMEM/F12 (Биолот, россия) и немедленно доставляли в лабораторию. опухолевую ткань помещали в стерильную чашку Петри с несколькими каплями предварительно нагретой до 37 °C питательной среды DMEM/F12, измельчали сначала стерильным скальпелем, а затем с использованием медиконов и медимашины (Aglient Technologies, сША). Клеточную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм (BD Falcon, сША), осадок центрифугировали 10 мин. при 200 g и ресуспендировали в полной питательной среде (ППс), состоящей из DMEM/F12, 20% эмбриональной фетальной крупного рогатого скота (Биолот, рФ), 266,7 мкг/мл L-глутамина (Биолот, рФ), препарата трансферрин-инсулин-селен (Gibco, сША) с конечной концентрацией компонентов в среде 10 мкг/мл, 5,5 мкг/мл, 6,7 нг/мл, соответственно, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma-Aldrich, сША). Клетки выращивали в культуральных флаконах (Sarstedt, Германия) в COg-инкубаторе Heracel (Termo Electron LTD GmbH, Германия) при 37 °с, 5% со2 и 100% влажности. При достижении монослоя клетки пересевали с помощью смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1 (Биолот, россия). Для визуализации использовали автоматическую систему наблюдения за живыми клетками Cell-IQ (Chip-Man Technologies Ltd, Финляндия).

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование

Характеристика

Саркомы мягких тканей, n

Саркомы костей, n

Всего больных

Средний возраст, лет (диапазон)

Пол: мужской женский

Стадия:

• I

• II

• III

• IV

Локализация первичного опухолевого узла:

• конечность

• забрюшинное пространство

• туловище

• средостение

• голова

• матка

• прочие

Гистологические подтипы: липосаркома синовиальная саркома миксофибросаркома лейомиосаркома рабдомиосаркома

опухоль из оболочек периферических нервов альвеолярная саркома светлоклеточная саркома эпителиоидно-клеточная саркома остеогенная саркома хондросаркома прочие

Лечение на момент забора материала:

• хирургическое

• адъювантная терапия:

• 1 линия терапии

• 2 линия терапии

• 3+ линия терапии

55

44,4 (8-82)

28 27

2 3 18 32

31 8 3 3 2 3

5

14 10

6 8 5 3 2 2 2

55 2 12 14 9

16

39,8 (3-82)

11

5

0 0 4 12

12 0 3 0 1 0 0

10 6

16 0 2 6 0

3

Пролиферативная активность

Время удвоения опухолевых клеток (т2) определяли по методике, описанной Р.Я. Фрешни (2010) [6]. Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток сМт и ос в режиме реального времени использовали автоматический клеточный анализатор xCelligence (ACEA Bioscience Inc., сША). Перед началом эксперимента измеряли фоновое сопротивление 50 мкл ППс в лунках пролифера-ционного планшета E-Plate 16 (ACEA Bioscience Inc., сША). суспензию клеток высевали в концентрации 1х104 клеток на лунку и регистрировали электрические сигналы в течение 72 ч. Клеточный индекс (CI), характеризующий изменения импеданса, и параметр Slope, представляющий собой тангенс угла наклона кривой изменения CI и характеризующий скорость пролиферации опухолевых клеток, рассчитывали автоматически [8]. Для представления результатов была использована экспоненциальная запись.

HLA типирование клеток СМТ и ОС

с целью подтверждения идентичности образцам тканей пациента и контроля кроссконтаминации полученных

опухолевых культур проводили HLA типирование опухолевых культур и мононуклеаров периферической крови пациентов с определением генов HLA I класса методом ПЦР-SSP (sequence specific primers) [9]. Для последовательного выделения ДНК из клеток использовали стандартный набор Протранс ДНК Box 500 (Protrans medizinische diagnostische Produkte, Германия). Элюированную ДНК помещали в Циклерплатную систему Протранс HLA-A, -B, -C (Protrans medizinische diagnostische Produkte, Германия) с праймерами и Taq-полимеразой для амплификации в термоциклере. Ампликоны переносили в лунки электрофоретической камеры Протранс DyePUR (Protrans medizinische diagnostische Produkte, Германия), заполненные 2% агарозным гелем с добавлением бромистого этидия, для проведения электрофореза. Результаты исследования детектировали с применением УФ-трансиллюминатора по таблице интерпретации.

Изучение миграции и инвазии опухолевых клеток

Инвазивные и миграционные свойства клеток оценивали в автоматическом клеточном анализаторе

xCelligence (ACEA Bioscience Inc., США) с использованием двухкамерных планшетов CIM-Plate 16 (ACEA Bioscience Inc., США). Принцип метода основан на регистрации клеток, мигрировавших через пористую мембрану. Суспензию клеток в бессывороточной среде DMEM/F12 (Биолот, Россия) в концентрации 105 клеток на лунку высаживали в лунки верхней камеры, куда предварительно вносили по 30 мкл бессывороточной питательной среды или матригеля. Среду DMEM/F12, содержащую 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Биолот, Россия), в качестве хемоаттрактанта, вносили в нижнюю камеру [10]. Наблюдение продолжали в течение 96 ч. Оценивали клеточный индекс CI и параметр Slope.

Определение экспрессии раково-

тестикулярных генов (РТГ)

Молекулярно-генетический анализ экспрессии генов GAGE, HAGE, NY-ESO1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME [11] проводили методом ПЦР в режиме реального времени. Использовали специфические праймеры и флуоресцентные зонды, разработанные с применением последовательностей ресурса NCBI GenBank и программы для сравнения последовательностей нуклеотидов и аминокислот BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi). Референсный ген — контрольный ген ABL. Ввиду существенной гетерогенности данных, кластерный анализ экспрессии РТГ проводили на трансформированных данных: к значениям экспрессии добавляли константу (единицу), поскольку значение логарифма не определено в нуле, и применяли логарифм по основанию 2.

Определение маркеров стволовых

клеток (СКО) в культурах СМТ и ОС

Изучение экспрессии маркера СКО СD133 и активность альдегиддегидрогеназы (ALDH1) осуществляли методом проточной цитометрии с использованием прибора FACS Canto II (BD, США) [12].

Трехмерное моделирование

Спонтанную агрегацию в процессе пролиферации культивируемых клеток в трехмерные сфероидные структуры изучали методом «висячей капли» (hanging drop method) [13, 14]: каплю клеточной суспензии с концентрацией 3х105 клеток в ППС помещали на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри (Sarstedt, Германия) и инкубировали в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37 °C в течение 1 недели. Наличие сфероидов подтверждали микроскопически. Исследование проводили в триплетах. Сфероиды помещали в полимеризованный матригель в 96-луночных планшетах и оценивали время, необходимое для инвазии клеток, с использованием автоматической системы наблюдения за живыми клетками Cell-IQ (Chip-Man Technologies Ltd, Финляндия). Оценивали изменение диаметра и площади, занимаемой клетками сфероида, фиксируемое в системе Cell-IQ. Наблюдение вели в течение 48 ч.

Статистический анализ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Хранение, обработку, статистический анализ данных и визуализацию результатов осуществляли в программах Microsoft Excel 2019 (Microsoft Corporation, США), Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США) и R v.3.6.2. (The R Foundation, Австрия). Для систематизации и наглядного представления

эмпирических данных применяли основные описательные статистики: среднее значение, медиана, минимум, максимум. При исследовании взаимосвязи между номинальными и порядковыми переменными использовали таблицы сопряженности, вычисляя точный критерий Фишера, критерий %2 и коэффициент сопряженности Пирсона. В случае количественных признаков применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Определение различий в группах по значениям количественной переменной проводили с помощью Ы-критерия Манна-Уитни для сравнения независимых выборок и W-критерия Уилкоксона для связанных выборок. Иерархический кластерный анализ (метод полной связи с евклидовой метрикой) применяли для выделения кластеров экспрессии РТГ. Количество кластеров определяли автоматически с помощью библиотеки «\lbClust» в R. [15]. Все различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Культуры опухолевых клеток

В результате проведенной работы было получено 87 первичных культур опухолевых клеток: 75,9% (п=66) СМТ и 24,1% (п=21) ОС от 71 пациента, у 12 больных опухолевый материал был выделен несколько раз после повторных оперативных вмешательств. Среди полученных первичных опухолевых культур 1 9,5% (п=1 7) были выделены из первичных опухолей; большая часть — 60,9% (п=53) — из метастатических опухолей, с преимущественно легочной локализацией метастазов — 75,5% (п=40). Предоперационный диагноз был подтвержден гистологической и иммуногистохимической оценкой резецированных опухолей, которые были классифицированы в соответствии с диагностическими категориями ВОЗ [4]. В табл. 2 представлены распределение образцов по источнику получения и продолжительность культивирования выделенных опухолевых клеток.

Постоянные клеточные линии СМТ и ОС были получены в 54 случаях, что составило 62,1% от общего числа опухолевых образцов (табл. 3). Среди постоянных клеточных линий 7,4% (п=4) и 11,1% (п=6) культур было выделено из образцов первичных и рецидивных сарком, соответственно. 44 культуры (81,5%) СМТ и ОС имели метастатическое происхождение, при этом в 79,5% случаев (п=35) это были культуры клеток, выделенных из легочных метастазов.

Наибольший процент успешного перевода опухолевых клеток в культуру, когда клетки удавалось культивировать более 5 пассажей, был отмечен именно в группе метастатических сарком: 83,0% (п=44 из 53 образцов), что отражает возрастающую с опухолевой прогрессией способность клеток к независимому росту. Для рецидивных сарком он был значительно ниже: из 17 образцов удалось получить 6 (35,3%) клеточных линий. Минимальное количество клеточных культур было получено из образцов первичных сарком — 4 (23,5%).

Среди установленных причин, препятствующих успешному культивированию, чаще всего отмечали контаминацию стромальными клетками (19,5%, п=17) и недостаточный объем опухолевого материала (18,4%, п=16).

Морфология клеток культур СМТ и ОС

На ранних пассажах во всех культурах преобладали варианты клеток с фибробластоподобной и веретеновид-ной формами. В дальнейшем наблюдали значительные отличия внутри каждого из гистологических подтипов.

Таблица 2. Гистотипическая принадлежность полученных культур СМТ и ОС, распределение по локализации опухоли и продолжительность культивирования

Первичная опухоль Рецидив Метастаз Всего Пройдено

Гистологический пассажей

подтип опухоли Первичная >5 Первичная >5 Первичная культура >5 пассажей Первичная >5 <10 >15

культура пассажей культура пассажей п локализация п локализация культура пассажей

ОПУХОЛИ ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ

Миксоидная 6 1 7 1 3 легкое(1) 1 легкое(1) 16 3 1 2

липосаркома мягкие ткани (1)

брюшная полость (1)

Плеоморфная 0 0 0 0 1 средостение(1) 1 средостение 1 1 1 1

липосаркома (1)

ФИБРОБЛАСТИЧЕСКИЕ И МИОФИБРОБЛАСТИЧЕСКИЕ ОПУХОЛИ

Миксофибросаркома 2 1 2 1 5 легкое (3) 5 легкое (3) 9 7 2 5

мягкие ткани (2) мягкие ткани

(2)

Дерматофибросаркома 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1

ОПУХОЛИ ГЛАДКОМЫШЕЧНОЙ ТКАНИ

Лейомиосаркома 2 0 0 0 8 легкое (7) 6 легкое (6) 10 6 4 2

мягкие ткани (1)

ОПУХОЛИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

Эмбриональная 0 0 0 0 1 легкое(1) 1 легкое(1) 1 1 0 1

рабдомиосаркома

Альвеолярная 0 0 0 0 2 мозг (1) 1 мягкие ткани 2 1 1 0

рабдомиосаркома мягкие ткани (1) (1)

Плеоморфная 0 0 0 0 1 легкое(1) 1 легкое(1) 1 1 1 0

рабдомиосаркома

Веретеноклеточная 0 0 0 0 1 легкое(1) 1 легкое(1) 1 1 1 0

рабдомиосаркома

ОПУХОЛИ НЕРВОВ

Опухоль из оболочек 0 0 2 0 1 легкое(1) 1 легкое(1) 3 1 1 0

периферических

нервов

СОСУДИСТЫЕ ОПУХОЛИ МЯГКИХ ТКАНЕЙ

Ангиосаркома 0 0 0 0 1 Легкое(1) 0 0 1 0 0 0

ОПУХОЛИ НЕЯСНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

Синовиальная саркома 1 0 2 1 2 легкое (1) 2 легкое(1) 5 3 2 1

без уточнений мягкие ткани (1) мягкие ткани (1)

Бифазная 0 0 0 0 1 легкое (1) 1 легкое(1) 1 1 1 0

синовиальная саркома

Монофазная 0 0 2 2 5 легкое (3) 5 легкое (3) 7 7 3 4

синовиальная саркома плевра (1) плевра (1)

(веретеноклеточная) брюшная полость брюшная

(1) полость(1)

Эпителиоидная 1 0 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0

саркома

Альвеолярная 0 0 0 0 2 легкое (2) 2 легкое (2) 2 2 1 1

мягкотканая саркома

Светлоклеточная 0 0 0 0 2 легкое(1) 2 легкое(1) 2 2 1 1

саркома мягких тканей мягкие ткани (1) мягкие ткани (1)

Внескелетная 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1

миксоидная

хондросаркома

ОПУХОЛИ ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ

Остеогенная саркома 1 0 0 0 13 легкое (13) 11 легкое (11) 14 11 5 6

ОПУХОЛИ ИЗ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ

Хондросаркома 3 1 0 0 4 легкое (3) 3 легкое (2) 7 4 3 1

средостение(1) средостение (1)

Всего 17 4 17 6 53 легкое (40) 44 легкое (35) 87 54 27 27

мягкие ткани (7) мягкие ткани

средостение (2) (5)

плевра (1) средостение

брюшная полость (2)

(2) плевра (1)

мозг (1) брюшная

полость(1)

Таблица 3. Результаты культивирования клеток СМТ и ОС

т о

Факторы, препятствующие культивированию (п, %)

п опухолевой материала (0 а р ю о о н е т у Переведено в культуру (п, %) Неудачи при ьтивировани (п, %) остаточный объем атериала Рост юмальных клеток ечебный томорфоз !!!-!У ст я я £ 1 * I 1 1 рм еа тт

и 1- л о л у к дм е р т с ^ га п кн ао

С Н ш *

Первичная 17 4 13 7 7 1 2

опухоль 23,5 76,5 41,2 41,2 5,9 11,8

Рецидив 17 6 11 6 6 1 0

35,3 64,7 35,3 35,3 5,9

Метастаз 53 44 9 3 4 2 1

83,0 17,0 11,3 7,5 3,8 1,9

Всего 87 54 33 16 17 4 3

62,1 37,9 18,4 19,5 4,6 3,4

Рис. 1. Клеточные линии, полученные из образцов опухолей пациентов с саркомой мягких тканей (СМТ): А — дерматофибросаркома #705, 10 пассаж; Б — лейомиосаркома #699, 16 пассаж; В — липосаркома #702, 25 пассаж; Г — миксофибросаркома #678, 20 пассаж; Д — рабдомиосаркома #919, 14 пассаж; Е — шваннома #976, 13 пассаж; Ж — синовиальная саркома #997, 2 пассаж; З — светлоклеточная саркома #932, 12 пассаж; И — альвеолярная саркома #927, 10 пассаж. Инвертированный микроскоп. Фазовый контраст. Ув. х100

Клетки миксофибросарком и синовиальных сарком характеризовались наибольшей морфологической гетерогенностью (рис. 1). В культурах этих опухолей были представлены веретеновидная, фибробластоподобная, округлая и полигональная формы клеток. Среди миксофибросарком преобладали культуры, состоящие из округлых (см. рис. 1Г), а в группе синовиальных сарком — вытянутых клеток (см. рис. 1Ж). Округлая и полигональная формы

клеток были присущи культурам дерматофибросаркомы, злокачественной опухоли из оболочек периферических нервов, светлоклеточной и альвеолярной саркомы (см. рис. 1А, Е, З, И). В культурах ОС преимущественно наблюдали вытянутую веретеновидную и фибробластоподобную формы клеток (рис. 2), фибробластоподобная форма клеток была единственным вариантом в группе лейо-и рабдомиосарком (см. рис. 1Б, Д).

"л V - г* ч^ -48 $ , ■: ,'Л ^як а -ч " -г,,' &^Гх^' ' • о . _ , ■ ^ 'Ш ) >■ % . ' /' / '/гу ' ¡(¡Г й' ' * М

: ■■■■ '"Л ■ | £ Щ ' * ш -- - ^ ГЙ рй " . 1 - \ я 9 ■с ' -г - - '', ' - ■ ш Щ щ ■> ^ ^ т - . Ж • т 9 Ш " ••? а. "V: ? 11 ' ^ г и

Рис. 2. Клеточные линии, полученные из образцов опухолей пациентов с остеосаркомой (ОС): А — #921, 10 пассаж; Б — #926, 8 пассаж; В — #962, 8 пассаж; Г — #996, 16 пассаж; Д — #793, 14 пассаж; Е — #938, 35 пассаж. Инвертированный микроскоп. Фазовый контраст. Ув. х100

Таблица 4. Пролиферативная активность культивируемых клеток, полученных из образцов пациентов с СМТ и ОС, и ее изменение в процессе длительного пассирования

.0 а.

<10 пассажей, медиана (минимум-максимум)

>15 пассажей, медиана (минимум-максимум)

1.0 С £ 1 исю|ип саркомы ч. С1 , тах' 72 ч. Б!оре (х10-3), 72 ч. т2, ч. С1 , тах' 72 ч. Б!оре (х10-3), 72 ч.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

СМТ Липосаркома 70 42-89 2,19 1,93-3,74 20,0 15,5-23,8 71 30-85 3,69 3,49-3,89 38,7 34,2-43,2

Синовиальная саркома 85 70-97 2,9 0,59-8,38 18,1 5,4-34,5 73,5 58-86 3,49 1,04-4,73 24,3 10,7-39,5

Миксофибросаркома 68 40-96 2,64 0,32-5,0 26,0 2,8-71,3 64 41-92 3,39 0,69-6,55 22,3 7,4-89,6

Лейомиосаркома 101 55-115 2,6 1,53-6,6 12,2 2,7-75,8 87 67-107 3,35 2,03-4,66 29,45 6,1-52,8

Рабдомиосаркома 83 73-87 3 15 0,96-3,89 22,6 10,6-31,1 85 1,12 11,6

Опухоль из оболочек периферических нервов 81 2,94 32,8 77 4,18 34,5

Альвеолярная саркома 51 3,83 56,1 47 4,28 61,8

Светлоклеточная саркома 112 0,88 8,6 99 1,29 13,4

Дерматофибросаркома 67 2,87 31,0 64 3,49 42,3

Внескелетная миксоидная 86 4,06 14,7 72 3,36 33

хондросаркома

ОС Остеогенная саркома 90 37-119 1,61 0,14-5,11 9,5 1,7-68,5 87 34-112 1,18 0,24-4,77 23 3,3-79,3

Хондросаркома 103,5 62-109 2,86 1,3-7,75 12,2 2,3-47,1 76,5 60-93 -* -*

Примечание: * — нет данных

A

B

Рис. 3. Пролиферативная активность клеток в культурах, полученных из образцов опухолей пациентов с СМТ и ОС на раннем (<10 пассажей) и позднем (>15 пассажей) этапах культивирования: А — slope культуры СМТ за 72 ч. наблюдения; Б — slope культуры ОС, 72 ч. наблюдения. Автоматический клеточный анализатор xCelligence

Пролиферативная активность культивируемых клеток СМТ и ОС

В процессе культивирования опухолевые клетки демонстрировали различную скорость пролиферации: Т2 составило в среднем 81 ч. (37-119 ч). Минимальное значение Т2 было выявлено в культурах миксофибро-сарком и липосарком с медианными значениями 68 ч. (40-96 ч.) и 70 ч. (42 ч.-89 ч.).

Наибольшее значение Т2 было обнаружено для клеток остеогенных сарком и хондросарком — 90 ч. (37-119 ч.) и 103,5 ч. (62-109 ч.), соответственно (табл. 4).

Самой значимой пролиферативной активностью на ранних пассажах обладали клетки культур миксофи-бросаркомы с медианным значением углового коэффициента Slope 26х10-3 (2,8х10-3-71,3х10-3) в течение 72 ч. наблюдения. Минимальная скорость роста была отмечена у остеогенных сарком, для которых медиана Slope составила 9,5х10-3 (1,7х10-3-68,5х10-3). На поздних пассажах было отмечено увеличение пролиферативной активности клеток как в культурах СМТ так и в культурах ОС (p<0,05) (рис. 3), и наиболее существенный прирост пролиферативной активности продемонстрировали клетки культур ОС: медиана Slope 23х10-3 (3,3х10-3-79,3х10-3).

Экспрессия антигенов HLA A/B/C

Анализ экспрессии HLA I класса в клетках опухолевых культур и образцах мононуклеаров периферической крови пациентов исключил вероятность кроссконтаминации и показал высокую частоту встречаемости у пациентов с СМТ и ОС аллелей А2 (76,2%), и А32 (19,0%), что выше, чем в популяции Северо-Западного региона Российской Федерации: 52,3% (p=0,031) и 3,6% (p=0,001), соответственно, по данным ресурса Allele Frequency Net Database (AFND) www.allelefrequencies.net. При этом частота встречаемости остальных аллелей (А, B, C) была сопоставима со средними показателями по данному региону (рис. 4).

Миграционный и инвазивный потенциал культивируемых клеток, полученных из образцов опухолей пациентов с СМТ и ОС

Клетки всех клеточных культур СМТ и ОС обладали инвазивными свойствами, но демонстрировали различный инвазивный потенциал. Согласно данным измерения электрического импеданса в большинстве случаев наблюдали «скачкообразный переход»

малигнизированных клеток через поры мембраны (миграция) и через матригель (инвазия) в период 30-45 ч. наблюдения (рис. 5). Культивируемые клетки ОС характеризовались менее выраженными миграционными и инвазивными свойствами по сравнению с клетками СМТ. Были выявлены статистически значимые различия по параметру миграционной активности между культурами СМТ и ОС (р<0,05) в течение 96 ч. наблюдения, но по инвазивному потенциалу значимых различий обнаружено не было (табл. 5).

Наибольшим миграционным и инвазивным потенциалом характеризовались культуры плеоморфной липо-саркомы #702 (рис. 5А, Б) и светлоклеточной саркомы #932 (см. рис. 5В, Г). Для сарком остеогенной природы максимальное значение CIinv было выявлено в культуре остеосаркомы #926 (см. рис. 5Д, Е), максимальный CImigr — в культуре хондросаркомы #925 (см. рис. 5Ж, З).

Сравнительный анализ миграционной и инвазивной активности культивируемых клеток, выделенных из первичных и метастатических образцов опухолей, провести не удалось из-за недостаточного количества образцов. Однако на примере клеток миксоидной хондросаркомы двух культур #941 и #961, полученных из первичной опухоли и метастаза в легком одного и того же пациента, можно говорить об увеличении пролиферативной активности, способностей к миграции и инвазивного потенциала клеток метастатического происхождения: Slope пролиферации составил 18,7 и 23,8х10-3 для клеток первичной опухоли и метастаза, соответственно, Slope миграции — 24,8 и 26,9х10-3, Slope инвазии — 18,7 и 23,8х10-3 за 96 ч наблюдения.

Экспрессия раково-тестикулярных антигенов

В культурах клеток СМТ и ОС была отмечена высокая степень гетерогенности транскрипционной активности изучаемых РТГ: минимум 0,0001, максимум 8,57. Из 37 исследованных образцов клеточных культур СМТ отсутствие экспрессии РТГ было обнаружено в 18,9% (n=7) образцов. Сходные результаты были получены для культур ОС: экспрессию РТГ выявили в 20% (n=3) из 15 проанализированных образцов.

С наибольшей частотой в группе культур клеток СМТ (n=37) детектировали активность генов PRAME в 51,4% (n=19) и GAGE1 в 45,9% (n=17) случаев. В группе культур ОС (n=15) экспрессию PRAME выявляли в 66,7% (n=10) и GAGE1 в 60,0% (n=9) случаев. При этом в культурах СМТ и ОС была обнаружена коэкспрессия

Рис. 4. Экспрессия антигенов Н1_А А/В/С: в культурах клеток, полученных из образцов опухолей пациентов с СМТ и ОС (собственные результаты); в популяции Северо-Западного региона РФ (данные регистра)

Таблица 5. Параметр Slope и клеточный индекс (CImax) для инвазии и миграции клеток в культурах СМТ и ОС (96 ч. наблюдения)

Гистотип Миграция* Медиана (минимум-максимум) Инвазия** Медиана (минимум-максимум)

саркомы Slope х10-3 CI max Slope х10-3 CI max

СМТ Липосаркома 26,7 24,8-153 3,25 2,6-13,9 26,8 22,7-50,5 3,1 1,9-6,0

Синовиальная саркома 44,4 14,8-93,1 7,1 4,0-12,2 37,7 9,4-76,8 5,2 1,4-11,4

Миксофибросаркома 79,9 5,5 29,4 2,6

Лейомиосаркома 48,5 45,2-100,7 8,5 3,5-13,2 77,2 17,6-116 8,2 1,9-9,0

Рабдомиосаркома 107 11,9 101,1 10,1

Опухоль из оболочек периферических нервов 133,3 10,7 109,9 9,5

Светлоклеточная саркома 203,6 13,8 129,4 12,0

Дерматофибросаркома 34,3 4,8 36,7 3,6

Внескелетная миксоидная хондросаркома 59,1 11,2 34,6 4,0

ОС Остеогенная саркома 17,9 4,8-64,7 4,4 0,4-11,3 29,3 9,2-76,3 3,0 0,7-9,5

Хондросаркома 36,6 29,1-59,1 5,0 3,4-11,2 44,6 31,5-78 4,0 3,4-10,6

Примечание: * — различия между культурами СМТ и ОС, р=0,0256; ** — различия между культурами СМТ и ОС, р=0,2747

Рис. 5. Инвазивная и миграционная активность в культурах опухолевых клеток, полученных из образцов опухолей пациентов с СМТ и ОС при культивировании в течение 96 ч.: А, Б — липосаркома #702 (10 пассаж); В, Г — светлоклеточная саркома #932 (11 пассаж); Д, Е — остеогенная саркома #926 (5 пассаж); Ж, З — хондросаркома #925 (10 пассаж)

этих генов (rho=0,5025; p=0,00015). Ген SLLP1 чаще детектировали в культивируемых клетках ОС — 53,3% (n=8), чем в СМТ — 27,0% (n=10). Активность генов PASD1 и SSX1 была продемонстрирована с сопоставимой частотой: 29,7% (n=11) и 21,6% (n=8) для 37 культур СМТ, 33,3% (n=5) и 33,3% (n=5) для 15 культур ОС, соответственно. Экспрессия PASD1 коррелировала как с экспрессией гена GAGE1 (rho=0,6951; p=0,00001), так и с PRAME (rho=0,5743; p=0,00001). Реже отмечали транскрипционную активность генов NY-ESO-1 и MAGEA1: 16,2% (n=6) и 18,9% (n=7) для 37 культур СМТ; 6,7% (n=1) и 13,3% (n=2) для 15 культур ОС, соответственно. Была выявлена коэкспрессия этих генов (rho=0,4027; p=0,00308) в культурах СМТ и ОС. В двух образцах культивируемых клеток СМТ и двух образцах ОС обнаружили экспрессию гена SPANXA1 (5,4% и 13,3%, соответственно). Транскрипционная активность гена SCP1 была детектирована в единственном образце клеток ОС (6,7%) и отсутствовала в клетках СМТ. Экспрессия гена HAGE была выявлена в трех культурах СМТ (8,1%) и ни в одной культуре ОС. Экспрессия гена SEMG1 не была зарегистрирована.

В культурах СМТ наибольшую транскрипционную активность гена GAGE1 продемонстрировали клетки миксофибросаркомы, которая составила 71,4% (5 случаев в 7 образцах), медиана 4,0 (0-5,43). В клетках синовиальных сарком была выявлена максимальная экспрессия гена РЯАМЕ: 63,6% (7 случаев в 11 образцах), медиана 0,07 (0-4,48). Клетки рабдомиосарком характеризовались минимальным набором активных РТГ: отсутствие экспрессии генов GAGE1, РЯАМЕ, низкие значения экспрессии генов БИР1 (0,007) и БЗХ1 (0,004) (по одному случаю). В культурах ОС большую транскрипционную активность РТГ демонстрировали клетки опухолей костного происхождения. В остеосарко-мах чаще детектировали гены РЯАМЕ: 72,7% (8 случаев в 11 образцах), медиана 0,34 (0-2,31), и GAGE1: 63,6% (7 случаев в 11 образцах), медиана 0,94 (0-4,82).

При анализе экспрессии РТГ было выявлено 3 кластера (рис. 6). В первом кластере были объединены культуры с высоким уровнем экспрессии генов GAGE1, РЯАМЕ и наличием активности гена РАБ01 (миксофибросаркомы, синовиальные саркомы, лейомиосаркомы, дерматофибросаркома). Второй,

Рис. 6. Кластеризация клеточных культур, полученных из образцов опухолей пациентов с СМТ и ОС, в зависимости от экспрессии раково-тестикулярных генов

наиболее обширный кластер, составили культуры с низкой и неопределяемой активностью исследуемых генов, куда вошло большинство культур ОС. В третьем кластере были объединены три опухолевые культуры с высоким уровнем экспрессии гена БИР1 (остеосар-комы, миксофибросаркома).

Экспрессия маркеров стволовых

клеток опухоли (СКО)

Наибольшее количество А_ОН1+- и С0133+-клеток было обнаружено в культурах лейомиосаркомы: 52,5% и 10,8%, соответственно; наименьшее количество — в культурах липосарком: 1,1 и 0,1%, соответственно. С помощью однофакторного регрессионного анализа была установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем синтеза А_ОН1 в клетках культур СМТ и ОС и значением времени до прогрессирова-ния заболевания у пациентов (пИо=-0,490; р=0,039). При оценке относительного содержания клеток, экспрессирующих С0133, было также показано, что существует обратная корреляционная зависимость между количеством С0133+-клеток в культуре и временем до прогрессирования заболевания (пИо=-0,389; р=0,074) (рис. 7).

Свойства культивируемых клеток СМТ

и ОС в трехмерных структурах

Все изученные опухолевые культуры продемонстрировали способность к образованию сфероидов. За одно и то же время (7 сут.) опухолевые клетки, помещенные в каплю в одной и той же концентрации 1х104, образовывали сфероиды различного диаметра с медианным значением 192,5 мкм (113-365 мкм). Размеры сфероидов значительно варьировали в пределах одного гистологического подтипа. Среди СМТ максимальный диаметр к началу эксперимента имели сфероиды миксофибросаркомы линии #982 (рис. 8А-В), минимальный — рабдомиосаркомы линии #862 (рис. 8Г-Е). Среди ОС самые крупные сфероиды имела культура #921 (рис. 8Ж-И), а клетки линии #996 отличались минимальным размером образованных сфер (рис. 8К-М). Проведенный анализ последовательных изображений в режиме реального времени показал прямую корреляционную зависимость высокой силы между начальным диаметром сфероида и скоростью распространения клеток в матригеле (rho=0,721; p=0,014) (рис. 9). Статистически значимых различий между опухолевыми культурами СМт и ОС выявлено не было. За время наблюдения скорость изменения диаметра сфероида для СМТ составила 9,6 мкм/ч. (5,2-14 мкм/ч.),

Рис. 7. Корреляция между относительным содержанием в культуре клеток, несущих маркеры стволовых клеток (СКО), и клиническими параметрами опухолевого процесса. Взаимосвязь между временем до прогрессирования заболевания и: А — количеством АШН-клеток в культурах СМТ и ОС; Б — количеством ГО133+ опухолевых клеток в культурах СМТ и ОС

а занимаемой им площади — 7291,1 мкм2/ч. (2474,1-13387,2 мкм2/ч.). Для ОС эти показатели были несколько ниже и равнялись 6,6 мкм/ч. (3,212,2 мкм/ч.), а занимаемой им площади 2817,5 мкм2/ч. (1093,5-12584,1 мкм2/ч.).

Обсуждение

Редкость встречаемости СМТ и ОС, их высокая гетерогенность и недостаточная эффективность современных режимов терапии, особенно в случае метастатического процесса, диктуют необходимость располагать достаточным количеством доклинических модельных систем для исследований. Такие модели незаменимы для изучения биологических особенностей онкогенеза и опухолевой селекции, для определения новых молекулярных мишеней, оценки эффективности новых лекарственных средств и их комбинаций, выявления и преодоления механизмов химиорезистентности. В качестве материала для проведения доклинических исследований сарком в настоящее время наряду с ксенотрансплантантами [16] и органоидами [17] по-прежнему широко используют культуры опухолевых клеток. Для ряда злокачественных новообразований, клеточные культуры которых в достаточном количестве представлены в биобанках, уже разработаны эффективные стратегии лечения. В частности, именно благодаря наличию значительного количества клеточных линий рака легкого удалось определить спектр драйверных мутаций при этом заболевании [18]. Использование клеточных линий позволило оценить распространенность мутации BRAF V600E при меланоме [19]. В тоже время, данные современных обзоров состояния биобанков свидетельствуют о малом количестве и недостаточном разнообразии гистотипов представленных в них клеточных линий СМТ и ОС [5, 20].

В результате проведенных исследований нами была создана коллекция клеточных линий СМТ и ОС, насчитывающая 39 культур СМТ и 15 ОС, из них 20 и 7 культур, соответственно, были пассированы более 1 5 раз. Высокий процент успешной адаптации опухолевых клеток к условиям in vitro (62,1%), вероятно, можно объяснить преимущественно метастатическим происхождением опухолевых образцов и низкой степенью клеточной диф-ференцировки сарком. Ранее A. Salawu с соавт. (2016) сообщили о создании 7 клеточных линий СМТ из образцов 47 пациентов. Авторы указали на значительные трудности в получении культур клеток сарком, пригодных для длительного культивирования, при этом они отмечали, что в 70% случаев удалось получить культуры,

пассированные 4-5 раз, и только в 15% случаев были получены стабильно пролиферирующие клеточные линии [21]. В нашей работе среди причин, препятствующих культивированию опухолевых клеток, ведущую роль (19,5%) играла контаминация стромальными клетками, которая приводила к очень медленному росту фибробла-стоподобных клеток с последующей гибелью культуры. Рост фибробластов обычно коррелировал со слабой про-лиферативной активностью опухолевых клеток (табл. 3).

Все полученные клеточные линии были охарактеризованы по нескольким параметрам: морфология, про-лиферативная активность, миграционный и инвазивный потенциал, экспрессия антигенов HLA A/B/C и РТА, относительное содержания в популяции CD133+-и ALDH1+-клеток, способность к спонтанной агрегации, формирование трехмерных структур и инвазивный потенциал в 3D-системе.

Наблюдение за скоростью роста культур СМТ и ОС позволило установить, что клетки миксофибро-сарком характеризовались наилучшими ростовыми характеристиками, наименьшую скорость пролиферации демонстрировали культуры остеосарком. Длительное культивирование приводило к статистически значимому увеличению пролиферативной активности. Следует отметить, что B. Lohberger с соавт. (2017) получили несколько субклонов клеток миксофибросаркомы, выделенных из опухоли одного и того же пациента, отличающиеся по пролиферативной активности, способности к инвазии и генетическому профилю [22]. Среди культур миксофибросарком мы также выделили в процессе опухолевой прогрессии две культуры из материала одного пациента: из рецидивной опухоли и из метастаза в мягкие ткани. При этом клетки культуры метастатического происхождения экспрессировали более активно РТГ (GAGE1 и SLLP1] и имели большую субпопуляцию ALDH1+-клеток. Таким образом, получение «родственных» клеточных линий, происходящих из одной опухоли, может быть ценным инструментом для изучения гетерогенности СМТ и ОС на клеточном и молекулярном уровне.

С точки зрения иммунологии опухолей информация об экспрессии антигенов главного комплекса гистосовме-стимости на клеточных линиях злокачественных новообразований является весьма важной, так как при разработке противоопухолевой иммунотерапии часто необходимо иметь модельные системы, такие как клеточные линии с определенным типом HLA [23]. Кроме того, HLA-типирование является одним из маркеров для проверки и отслеживания идентичности клеточных линий. Мы обнаружили экспрессию HLA I типа в клетках всех полученных клеточных линий СМТ и ОС, и варианты аллелей антигенов,

104

оригинальные исследования

А мн г'1 а.-' **айижйУ тщЩШШштш ШЗтеЙйчИ®1111 к ь 1 - ^ > 5 "" ШШЙШШР м№ ■ ■ ' ШЩвКЯЮ т 84 Шй

I.. шт| ! д Л

[ # Ц ^

■ ■ ■ * ' ''' ' ■ » ■ в шашин ■ ^ к А Л * :' ■ . .- . ^ - т ' Вш ■-' Й V * - ■ Я л ■ 1 ■.' ■ ш, яя

Рис. 8. Эволюция сфероидов, образованных из клеточных культур, полученных из образцов опухолей пациентов с ОМт и ос, помещенных в матригель: А, Б, В — культура миксофибросаркомы #982; Г, Д, Е — культура рабдомиосаркомы #862; Ж, З, И — культура остеогенной саркомы #921; К, Л, М — культура остеогенной саркомы #926

Рис. 9. Динамика изменения диаметра (А) и площади (Б) сфероидов, образованных из клеточных культур, полученных из образцов опухолей пациентов с сМт и ос, в течение 48 ч. наблюдения

идентифицируемые в культивируемых малигнизирован-ных клетках, совпадали во всех случаях с выявленными в моноцитах периферической крови больных.

С помощью модельных систем для изучения миграции и инвазии клеток сарком было показано, что все культуры, независимо от их происхождения, обладали миграционным и инвазивным потенциалом. При сравнении миграционных и инвазивных способностей культивируемых клеток СМТ и ОС оказалось, что in vitro в полученных культурах сМт количество подвижных клеток, способных к миграции, статистически значимо больше, чем в культурах ОС, однако в отношении инвазии подобных закономерностей не наблюдалось. Как известно, аберрантный эпители-ально-мезенхимальный переход вовлечен в патогенез различных злокачественных опухолей человека, среди сарком встречаются опухоли с неопределенным гистологическим происхождением, такие как синовиальные саркомы, которые демонстрируют двухфазную морфологию с участием как мезенхимального, так и эпителиального фенотипа [24]. В нашей работе были получены культуры монофазных и двухфазных синовиальных сарком, которые демонстрировали различные свойства и могут служить моделями для дальнейших исследований процессов инвазии и метастазирования.

В настоящее время известно множество молекулярно-генетических предиктивных и таргетных молекулярных маркеров для целого ряда злокачественных новообразований, в том числе для СМТ и ОС. К таким маркерам относят раково-тестикулярные антигены семейств MAGE, NY-ESO-1, BAGE, LAGE и других, общие для многих опухолей и отсутствующие в большинстве здоровых тканей [25]. Мы проанализировали в полученных клеточных линиях СМТ и ОС экспрессию 11 рТг, относящихся к наиболее хорошо изученным семействам, и обнаружили ее гетерогенный характер, при этом гены PRAME и GAGE1 проявляли активность в наибольшем числе случаев и, как правило, наблюдалась их коэкспрессия. J. Roszik с соавт (2017) обнаружили гиперэкспрессию гена PRAME в клеточных линиях синовиальной саркомы и лей-омиосаркомы [26]. Функции гена PRAME в нормальных и опухолевых клетках остаются в значительной степени неясными, однако в последние годы стало очевидно, что ген PRAME может способствовать онкогенезу и метаста-зированию с помощью различных механизмов [27]. Было показано, что высокий уровень синтеза белка PRAME коррелирует с худшей общей выживаемостью при остеосар-коме, и белок PRAME чаще определяется в метастазах, а не в первичных опухолях [28].

В исследовании K. Iura с соавт. (2017) иммуно-гистохимически были оценены уровни экспрессии 4 РТА в 108 образцах синовиальной саркомы [29]: N Y-ESO-1 определили в 66 (61%), PRAME в 93 (86%), MAGEA4 в 89 (82%) и MAGEA1 в 16 (15%) образцах; в 104 (96%) образцах выявили наличие, по меньшей мере, одного из изучаемых рТА. Более того, выраженную экспрессию, по крайней мере, одного из этих антигенов наблюдали в 83% образцов. Высокие уровни NY-ESO-1 и MAGEA4 статистически значимо коррелировали с наличием некроза и высокой распространенностью опухоли. Иммуногистохимическое выявление каждого из определяемых рТА не коррелировало с прогнозом, но коэкспрессия NY-ESO-1, PRAME и MAGEA4 была связана с неблагоприятным исходом заболевания. Эти же авторы в другом исследовании оценили методом ПЦР уровни PRAME и NY-ESO-1 в образцах недифференцированной (n=46), высоко дифференцированной (n=32) миксоидной липосаркомы и плеоморфной липосаркомы (n=14) [30]. Экспрессию PRAME и NY-ESO-1 наблюдали

в 43% и 7% образцов недифференцированной липо-саркомы и в 9% и 3% высоко дифференцированной миксоидной липосаркомы, соответственно. Для плео-морфной липосаркомы эти антигены были обнаружены в 50% и 21% случаев, соответственно. Высокие уровни белка PRAME и (или) NY-ESO-1 в этом исследовании статистически значимо коррелировали с диаметром опухоли, наличием некроза, степенью злокачественности, распространенностью опухоли и плохим прогнозом. Кластерный анализ показал, что клеточные линии сарком характеризуются гетерогенной транскрипционной активностью РТГ, которую нельзя связать с их гистотипом и источником происхождения клеточных культур. Также мы обнаружили, ранее не описанную экспрессию ртГ PASD1 и SLLP1 в клеточных культурах сарком. Есть данные, что экспрессия гена PASD1 ассоциирована с про-лиферативными свойствами клеток глиомы и активацией антиапоптотических белков [31]. SLLP1 в норме является структурным белком, специфичным для сперматозоидов, его избыточная продукция, обнаруженная при онкогема-тологических заболеваниях, позволила рассматривать этот белок как потенциальную мишень для иммунотерапии [32]. Обнаружение гиперэкспрессии генов PASD1 и SLLP1 в клетках СМТ и ОС представляет значительный интерес и нуждается в дальнейшем анализе.

Мы изучили наличие в полученных культурах СМТ и ОС маркеров CD133 и ALDH1, экспрессия которых увеличена в различных типах неоплазий, связана с метастатическим потенциалом опухолей, а также неблагоприятным прогнозом для пациентов [33-36]. Нами была установлена обратная корреляция высокой силы между содержанием ALDH1+- и CD133+-клеток в культурах СМТ и ОС и временем до прогрессирования заболевания у пациентов. В ряде исследований в качестве прогностических и тар-гетных молекул также рассматривают маркеры стволовых опухолевых клеток. Так, в работе I. Zambo с соавт. (2016) иммуногистохимически были проанализированы уровни синтеза нестина, CD133 и ABCG2 в 24 образцах рабдо-миосаркомы, 22 образцах саркомы Юинга и 10 образцах остеосаркомы [37]. Повышенная экспрессия CD133 была связана с низкой выживаемостью у пациентов с рабдоми-осаркомой. Аналогично, о корреляции между экспрессией CD133 и низкой общей выживаемостью у 76 пациентов с эмбриональной рабдомиосаркомой сообщали D. Walter и соавт. (2011) [38]. A. He с соавт. (2012) выявили взаимосвязь экспрессии CD133 с появлением легочных метастазов и уменьшением общей выживаемости больных ОС [39]. В тоже время, Y. Zhou с соавт. (2017) продемонстрировали отсутствие взаимосвязи между экспрессией маркеров CD133, CD29, CD44, нестина, ALDH1 в опухоли и клиническими характеристиками заболевания при изучении биологического материала 20 больных синовиальной саркомой [40]. В настоящее время возможность таргетной терапии, направленной на клетки, несущие маркер CD133, в том числе и для сарком, носит дискуссионный характер [41].

Актуальным направлением является исследование свойств опухолевых клеток, выделенных из злокачественных новообразований пациентов, в трехмерных биологических системах с целью воссоздания сложных канцерогенных механизмов на молекулярном уровне и поиска путей повышения чувствительности опухолевых клеток к фармакологическому лечению [42]. Все полученные нами клеточные культуры СМТ и ОС были способны спонтанно формировать сфероиды, которые были использованы для дополнительного изучения процессов инвазии. Важно отметить, что клетки одного гистотипа сарком, но выделенные из образцов опухолей разных

больных, формировали сфероиды различного диаметра, и размер сфероида коррелировал со скоростью распространения клеток в матригеле. По мнению некоторых исследователей, генерация сфероидов особенно важна для изучения сарком, поскольку скорость роста, морфология клеток и межклеточные взаимодействия в сфероидах достаточно хорошо имитируют первичные опухоли [43].

Заключение

Существует настоятельная необходимость в развитии индивидуальных подходов персонализированной медицины и создании новых препаратов, специфичных для подтипов СМТ и ОС. Культура клеток in vitro является важным инструментом в идентификации инновационных протеинов, и востребованность линий клеток СМт и ОС, вероятно, будет продолжать расти в будущем. Создание новых клеточных линий в течение следующих нескольких лет будет особенно важно для протеомных исследований, которые сосредоточены на изучении глобальных изменений протеома и необходимы для выявления новых таргетных белков.

Внедрение новых терапевтических подходов базируется на доклинических исследованиях in vitro, поэтому получение клеточных линий СМТ и ОС будет

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:

1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году. Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена; 2019. [Kaprin A.D., Starinsky V.V., Petrova G.V., editors. The state of cancer care for the population of Russia in 2018. Moscow: Moscow Herzen Research Oncological Institute; 2019.].

2. Мацко Д.Е. Современные представления о морфологической классификации сарком мягких тканей и их практическое значение. Практическая онкология 2013; 14(2): 77-86. [Matsko D.E. Modern ideas about the morphological classification of soft tissue sarcomas and their practical significance. Practical oncology 2013; 14(2): 77-86.].

3. Gey G.O., Coffman W.D., Kubicek M.T.T. Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium. Cancer Res. 1952; 12: 264-5.

4. Fletcher C.D.M., Bridge J.A., Hogendoorn P.C.W. et al. WHO Classification of Tumours of Soft Tissue and Bone. 4th ed. Lion [France]: IARC Press; 2013.

5. Pan X., Yoshida A., Kawai A. et al. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev. Proteomics 2016; 13(2): 227-40.

6. Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed. Hoboken New Jersey USA: John Wiley & Sons, Inc.; 2010.

7. Данилов А.О., Ларин С.С., Данилова А.Б. и др. Усовершенствование метода приготовления аутологичных модифицированных противоопухолевых вакцин для активной специфической иммунотерапии больных с диссеминированными солидными опухолями. Вопросы онкологии 2004; 50(2): 219-27. [Danilov A.O., Larin S.S., Danilova A.B. et al. An improved procedure for autologous gene-modified vaccine preparation for active specific immunotherapy of disseminated solid tumors. Voprosy onkologii 2004; 50(2): 219-27.].

8. Moniri M.R., Young A., Reinheimer K. et al. Dynamic assessment of cell viability, proliferation and migration using real time cell analyzer system (RTCA). Cytotechnology 2015; 67(2): 379-86.

9. Nowak J., Mika-Witkowska R., Graczyk-Pol E. Genetic methods of HLA typing molecular aspects of hematologic malignancies principles and practice. In: Witt M., Dawidowska M., Szczepanski T., editors. Molecular aspects of hematologic malignancies. Berlin Heidelberg: Springer; 2012. p. 325-39.

10. Chiu C.H., Lei K., Yeh W. et al. Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening. J. Orthop. Surg. Res. 2017; 12: 149.

11. Солодовник A.A., Мкртчан А.С., Мисюрин В.А. и др. Экспрессия раково-тестикулярных генов PRAME, NY-ESO1, GAGE1, MAGE A3, MAGE A6 MAGE A12, SSX1, SLLP1, PASD1 у больных множественной миеломой, их влияние на показатели общей выживаемости и скорость возникновения рецидива. Успехи молекулярной онкологии 2018; 5: 63-70. [Solodovnik A.A., Mkrtchyan H.S., Misyurin V.A. et al. Expression of cancer-testis genes PRAME, NY-ESO1, GAGE1, MAGE A3, MAGE A6, MAGE A12, SSX1, SLLP1, PASD1 in patients with multiple myeloma, their influence on overall survival and relapse rate. Advances in Molecular Oncology 2018; 5: 63-70.].

12. Mele L., Liccardo D., Tirino V. Evaluation and Isolation of Cancer Stem Cells Using ALDH Activity Assay. Methods Mol. Biol. 2018; 1692: 43-8.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

способствовать прогрессу в этой области. Клеточные культуры остаются незаменимым инструментом в изучении опухолей, их использование улучшит дизайн клинических исследований и ускорит появление персонализированных режимов терапии злокачественных новообразований.

В созданную нами коллекцию клеточных культур СМТ и ОС входят образцы, имеющие исчерпывающее гистологическое описание и охватывающие 1 8 гисто-типов СМТ и ОС. Нами подтверждена идентичность полученных клеточных линий СМТ и ОС образцам тканей пациентов и осуществлена первичная характеристика, позволившая выявить их метастатический потенциал и способность к формированию трехмерных структур. Все полученные клеточные культуры имеют стабильные пролиферативные свойства, которые позволяют их использовать в дальнейших научных исследованиях.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ на реализацию научного проекта № 18-29-09014 «Создание персонализированных клеточных систем на основе тумороидов для оптимизации лекарственного лечения агрессивных форм солидных опухолей».

13. Ryu N.E., Lee S.H., Park H. Spheroid Culture System Methods and Applications for Mesenchymal Stem Cells. Cells 2019; 8(12): 1620.

14. Breslin S., O'Driscoll L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today 2013; 18(5-6): 240-9.

15. Charrad M., Ghazzali N., Boiteau V. et al. NbClust: An R Package for Determining the Relevant Number of Clusters in a Data Set. Journal of Statistical Software 2014; 61(6): 1-36.

16. Hoffman R.M. Patient-derived orthotopic xenografts: Better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat. Rev. Cancer 2015; 15: 451-2.

17. Drost J., Clevers H. Organoids in cancer research. Nat. Rev. Cancer 2018; 18: 407-18.

18. Gazdar A.F., Gao B., Minna J.D. Lung cancer cell lines: Useless artifacts or invaluable tools for medical science? Lung Cancer 2010; 68(3): 309-18.

19. Vincent K.M., Postovit L.M. Investigating the utility of human melanoma cell lines as tumour models. Oncotarget 2017; 8(6): 10498-509.

20. Hattori E., Oyama R., Kondo T. Systematic Review of the Current Status of Human Sarcoma Cell Lines. Cells 2019; 8(2): 157.

21. Salawu A., Fernando M., Hughes D. et al. Establishment and molecular characterisation of seven novel soft-tissue sarcoma cell lines. Br.J. Cancer 2016; 115(9): 1058-68.

22. Lohberger B., Stuendl N., Leithner A. et al. Establishment of a novel cellular model for myxofibrosarcoma heterogeneity. Sci. Rep. 2017; 7: 44700.

23. Boegel S., Löwer M., Bukur T. et al. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. Oncoim-munology 2014; 3(8): e954893.

24. Qi Y., Wang C.C., He Y.L. et al. The correlation between morphology and the expression of TGF-ß signaling pathway proteins and epithelial-mesenchymal transition-related proteins in synovial sarcomas. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013; 6(12): 2787-99.

25. Gordeeva O. Cancer-testis antigens: Unique cancer stem cell biomark-ers and targets for cancer therapy. Semin. Cancer Biol. 2018; 53: 75-89.

26. Roszik J., Wang W.L., Livingston J.A. et al. Overexpressed PRAME is a potential immunotherapy target in sarcoma subtypes. Clin. Sarcoma Res. 2017; 7: 11.

27. Al-Khadairi G., Decock J. Cancer Testis Antigens and Immuno-therapy: Where Do We Stand in the Targeting of PRAME? Cancers (Basel) 2019; 11(7): pii: E984.

28. Tan P., Zou C., Yong B. et al. Expression and prognostic relevance of PRAME in primary osteosarcoma. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012; 419(4): 801-8.

29. Iura K., Maekawa A., Kohashi K. et al. Cancer-testis antigen expression in synovial sarcoma: NY-ESO-1, PRAME, MAGEA4, and MAGEA1. Hum. Pathol. 2017; 61: 130-9.

30. Iura K., Kohashi K., Hotokebuchi Y. et al. Cancer-testis antigens PRAME and NY-ESO-1 correlate with tumour grade and poor prognosis in myxoid liposarcoma. Pathol. Clin. Res. 2015; 1(3): 144-59.

31. Li R., Guo M., Song L. PAS Domain Containing Repressor 1 (PASD1) Promotes Glioma Cell Proliferation Through Inhibiting Apoptosis In Vitro. Med. Sci. Monit. 2019; 25: 6955-64.

32. Yousef S., Heise J., Lajmi N. et al. Cancer-testis antigen SLLP1 represents a promising target for the immunotherapy of multiple myeloma. J. Transl. Med. 2015; 13: 197.

33. Toledo-Guzmán M.E., Hernández M.I., Gómez-Gallegos ÁA. et al. ALDH as a Stem Cell Marker in Solid Tumors. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2019; 14(5): 375-88.

34. Liou G.Y. CD133 as a regulator of cancer metastasis through the cancer stem cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2019; 106: 1-7.

35. Zhou F., Mu Y.D., Liang J. et al. Expression and prognostic value of tumor stem cell markers ALDH1 and CD133 in colorectal carcinoma. Oncol. Lett. 2014; 7(2): 507-12.

36. Greco N., Schott T., Mu X. et al. ALDH Activity Correlates with Metastatic Potential in Primary Sarcomas of Bone. J. Cancer Ther. 2014; 5(4): 331-8.

37. Zambo I., Hermanova M., Zapletalova D. et al. Expression of nestin, CD133 and ABCG2 in relation to the clinical outcome in pediatric sarcomas. Cancer Biomark. 2016; 17(1): 107-16.

38. Walter D., Satheesh S., Albrecht P. et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS ONE 2011; 6(5): e19506.

39. He A., Qi W., Huang Y. et al. CD133 expression predicts lung metastasis and poor prognosis in osteosarcoma patients: A clinical and experimental study. Exp. Ther. Med. 2012; 4(3): 435-41.

40. Zhou Y., Chen D., Qi Y. et al. Evaluation of expression of cancer stem cell markers and fusion gene in synovial sarcoma: Insights into histogenesis and pathogenesis. Oncol. Rep. 2017; 37(6): 3351-60.

41. Genadry K.C., Pietrobono S., Rota R. et al. Soft Tissue Sarcoma Cancer Stem Cells An Overview. Front. Oncol. 2018; 8: 475.

42. Heredia-Soto V., Redondo A., Kreilinger J.J.P. et al. 3D culture modelling: An emerging approach for Translational Cancer Research in Sarcomas. Curr. Med. Chem. 2019; 26: 1.

43. Colella G., Fazioli F., Gallo M. et al. Sarcoma Spheroids and Organoids-Promising Tools in the Era of Personalized Medicine. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(2): 615.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.