CC BY
44
УДК 666.189.242
Пиянзина К.И., Шахгильдян Г.Ю., Степко А.А., Натыров А.Н., Сигаев В.Н.
ПОЛУЧЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ НАНОПОРИСТОГО СТЕКЛА С КОНТРОЛИРУЕМЫМ РАЗМЕРОМ ПОР ДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
:Пияшина Ксения Ивановна, магистрант 2 курса Института материалов современной энергетики на нанотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва;
1 Шахгильдян Георгий Юрьевич, к.х.н., ведущий инженер Международного Центра Лазерных Технологий РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва;
1 Степко Александр Александрович, аспирант кафедры химической технологии стекла и ситаллов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва;
2Натыров Алексей Николаевич, научный сотрудник ФГБНУ ВНИИСБ и ООО "НПФ Синтол", Россия, Москва; 1Сигаев Владимир Николаевич, д.х.н., профессор, заведующий кафедры химической технологии стекла и ситаллов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва; e-mail: vlad.sigaev@gmail.com Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
2Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (ФГБНУ ВНИИСБ), ООО "НПФ Синтол" Москва, Россия 127550 Москва, ул. Тимирязевская, д. 42
В работе представлены результаты получения нанопористого CPG-стекла со средним размером пор 100 нм и размером частиц 100 мкм. Произведена химическая функционализация стекла и показана эффективность его использования в качестве твердофазного носителя при синтезе олигонуклеотидов длиной до 100 звеньев по сравнению с зарубежными аналогами.
Ключевые слова: нанопористые стекла, стекла с контролируемым размером пор, CPG, синтез олигонуклетидов
SYNTHESIS AND FUNCTIONALIZATION OF NANOPOROUS GLASS WITH CONTROLLED POROSITY FOR THE SOLID-PHASE SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDS
Piyanzina K.I.1, Shakhgildyan G. Yu.1, Stepko A.A.1, Natyrov A.N.2, Sigaev V.N.1
1D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
2All-Russia Research Institute of Agriculture Biotechnology, SYNTOL LLC, Moscow, Russia
Controlled porous glass (CPG) was synthesized. The medium pore size was 100 nm and particle size was above 100 /m. The chemical functionalization of glass has been performed. It was shown that functionalized CPG is excellently suited for the synthesis of oligonucleotides up to 100 bases in length.
Keywords: porous glass, controlled porous glass, CPG, oligonucleotides synthesis.
К пористым стеклам преимущественно относятся продукты селективного травления в кислоте двухфазных натриевоборосиликатных стекол. К нанопористым относят материалы со средним размером пор 1-100 нм, для расширения пор нанопористые стекла подвергают дополнительной обработке раствором щелочи, что позволяет получать пористый материал со средним диаметром пор до 500 нм.
Пористые стекла всегда играли важную роль в промышленности, порошки пористых стекол использовались в качестве адсорбентов для очистки технических масел, органических растворителей, керосина, СС14, извлечения радионуклидов, осушения низкомолекулярных жирных кислот и т.д.[1-2].
Особое место нанопористые стекла занимают в области медицины и биотехнологий ввиду своих уникальных свойств [3]. Для использования в
области биотехнологий применяют порошковые стекла CPG (стекло с контролируемым размером пор), впервые они были введены в хроматографическую практику в 1965 г. [4]. Их применяют для газопроникающей хромотографии (в водных растворах) белков, вирусов, углеводов, компонентов нуклеиновых кислот;
фракционирования (в органических растворителях) синтетических полимеров, а также в качестве инертных носителей для жидкостной распределительной хроматографии и носителей биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии.
В начале 70-х годов 20 века был предложен способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов (относительно коротких фрагментов нуклеиновых кислот с заданной химической структурой), который предполагает использование ненабухающего твердофазного носителя. Наиболее часто
используемым носителями для подобного синтеза в мировой практике стало стекло CPG [5].
Главной характеристикой CPG является диаметр пор, который может быть равным от 7 до 400 нм, при этом поры весьма однородны по размеру (отклонение составляет ±10 % для 80 % пор). Для того, чтобы сделать такой носитель пригодным для синтеза олигонуклетидов, его обрабатывают аминопропильными силанами, получая
функционализированное CPG.
Размер пор CPG и их разброс являются важнейшими свойствами, от которого зависят две ключевые характеристики синтеза: масштаб, определяемый числом активных функциональных групп на единицу массы носителя, и максимальная длина синтезируемого олигонуклеотида.
Существенной проблемой в синтезе олигонуклетидов на CPG является низкая функциональная загрузка при синтезе олигонуклетидов с длиной более 100 оснований, загрузка таких CPG находится на уровне 30 мкмоль/г, в то время как для адекватной работы современных высокопроизводительных
олигонуклеотидных синтезаторов загрузка должна быть не менее 100 мкмоль/г.
Производство CPG-стекол в России отсутствует, главными производителями являются страны ЕС и США. В то же время потребность в это материале постоянно увеличивается, рост биотехнологического сектора промышленности России обусловливает необходимость производства CPG-стекол в России. В связи с этим в данной работе поставлена задача получения CPG-стекол по технологии химического травления ликвирующих натриевоборосиликатных стекол, эффективность которых для синтеза олигонуклеотидов не уступает или даже превышает эффективность промышленных зарубежных аналогов компании Vitra Bio: PGSucDMTr-dT 1000A и CPGLCAA DMTr-dT 1000А.
Порошок нанопористого стекла был получен на основе ликвирующего натриевоборосиликатного стекла мольного состава, %: SiO2- 68, B2O3-27, Na2O-4, Al2O3-1. Процесс получения включал в себя следующие стадии: многостадийная термообработка, химическое травление и помол до фракции 100±10 мкм. После термообработки образцы обрабатывались раствором NaOH для вскрытия дефектов поверхности. Затем промывались дистиллированной водой и травились в 3Н растворе HCl для образования развитой сквозной пористой структуры. Для увеличения размеров пор до нужных значений после кислотного травления образцы подвергались травлению в 0,5Н растворе NaOH. Затем образцы промывались большим объемом дистиллированной воды и сушились, после чего измельчались в механической ступке и просеивались. Отбиралась фракция с размером частиц от 90 до110 мкм.
Полученный порошок нанопористого стекла отобранной фракции был исследован методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На рис. 1а видна типичная для нанопористого стекла
структура, характеризующаяся наличием сквозных взаимопроникающих пор. Средний размер пор по данным СЭМ составил 94 нм (рис. 1б), при этом разброс по размерам был минимальный, более 80% составлял размер пор 100±20 нм. Для CPG-стекол компании Vitra Bio разброс по размеру пор примерно тот же: 98±25 нм.
0.050 рт
I . 0.070мт :
0.075p т
,. 0S8uri
0.044цт
G.Ö91 рт
^^ Диаметр г
Рис.1. а) - Снимок СЭМ порошка синтезированного нанопористого стекла, б)-соответствующая снимку кривая распределение пор по размерам.
Для проверки применимости разработанных CPG-стекол в качестве твердофазных носителей для синтеза олигонуклетидов была проведена их химическая функционализация. Перед
функционализацией порошок обработали 2Н раствором HCl и дегазировали, затем отфильтровывали, промывали и высушивали. Процесс функционализации заключался в обработке CPG-стекол 3-аминопропилтриэтоксисиланом в толуоле. Объем полезной загрузки CPG определялся по реакции с пикриновой кислотой. Для этого порошок CPG-стекла был погружен в смесь пикриновой кислоты и изопропанола, после чего промыт изопропанолом, отфильтрован и обработан водным раствором аммиака. Потраченный объем (фильтрат) системы аммиак-вода собирали в мерную пробирку и измеряли оптическую плотность раствора на длине волны 358 нм. Расчет объема полезной загрузки осуществляли по формуле:
._ 1000 V^Abs
где L - загрузка, мкмоль/г; V - объем раствора, мл; d - разбавление; Abs- оптическая плотность на длине волны 358 нм;е - коэффициент экстинкции;да - масса навески, мг. По расчету объем загрузки составил
74,5 мкмоль/г, что находится на одном уровне с имеющимися аналогами.
На полученном порошке CPG-стекла (обозначен CPG-РХТУ), а также на импортных CPG, имеющихся на рынке (обозначены CPGSucDMT и CPGLCAADMT), были проведены синтезы олигонуклеотидов с разной длиной цепи от 20 до 100 нуклеотидов. Анализ эффективности синтеза олигонуклеотидов заданной длины на различных CPG-стеклах был проведен при помощи метода электрофореза в полиакриламидном геле. Под действием электрического поля происходит разделение олигонуклеотидов в зависимости от молекулярного веса и длины образца вследствие их различной подвижности в геле, в результате чего можно определить выход целевых
олигонуклеотидов. Визуализация геля производится под УФ-лампой. Этот метод детектирования позволяет различить олигонуклеотиды,
отличающихся на 1 нуклеотид. На рисунке 2а представлены фотографии участков
полиакриламидных гелей олигонуклеотидов, синтезированных на различных CPG-стеклах. На снимке видно, что степень локализации контрастного пятна (которое характеризует количество олигонуклеотидов заданной длины) близка для всех образцов CPG-стекол при синтезе олигонуклеотидов с длиной цепи до 80 ед. В то же время, при синтезе олигонуклеотидов с длиной 100 ед. пятно для образца CPGSucDMT размывается практически полностью, что говорит о минимальном выходе олигонуклеотидов заданной длины, в то время как образец CPG-РХТУ, синтезированный в данной работе, также, как и аналог CPGLCAADMT, демонстрирует сохранение контрастности пятна.
Для количественного определения результатов проведенного синтеза подсчитан выход полученных олигонуклеотидов с разной длиной цепи на различных CPG-стеклах. Зоны олигонуклеотидов целевой длины были вырезаны из геля, и выделены методом элюции, после чего была измерена концентрация с использованием УФ-спектрофотометра при длине волны 260 нм (в области максимального поглощения
олигонуклеотидов). На рис. 2б представлены диаграммы количеств олигонуклеотидов с разной длиной цепи, синтезированных на различных CPG-стеклах. Видно, что образец, синтезированный в данной работе, продемонстрировал степень выхода, не уступающую западным аналогам.
Дальнейшие исследования будут связаны с разработкой CPG-стекол, обеспечивающих повышенный выход олигонуклеотидов. Успех в этом направлении позволит решить вопрос импортозамещения CPG-стекол и будет способствовать развитию отечественных
биотехнологий.
CPG Sue DMT CPG LCAA DMT CPG-PXTy
a)
tffcJt
w m
Mi * w
%M
ll
Э 11-
Ё 3
a
I 9.
a
ъ
§
0
1
И
j CPG Sue DMT ] CPG LCAA DMT СРС-РХТУ
II
20 40 60 80 100
Длина цепи олигонуклиеггидов
б)
Рис.2. а) Фотографии участков полиакриламидных гелей олиготимидилатов с разной длиной цепи Т (20-100), синтезированных на различных CPG-стеклах, после электрофоретического разделения б) диаграммы количеств олигонуклеотидов с разной длиной цепи, синтезированных на различных CPG-стеклах.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (грант № 14.Z50.31.0009).
Список литературы
1. Варшал Б. Г., Мазурин О. В. Двухфазные стекла: структура, свойства, применение. - " Наука," Ленинградское отд-ние, 1991.
2. Вензель Б. И., Роскова Г. П., Цехомская Т. С. Пористые стекла: процесс образования, структура и некоторые свойства //Физикохимия силикатов и оксидов.—СПб.: Наука. - 1998. - С. 199-216.
3. Mazilu C.J. Optoelectronics and advanced mat. -2007. - Vol. 9, № 7.-Р. 2036-2040.
4. На11ет W., Nature, 1965, v. 206, No. 4985, p. 693696.
5. GuzaevA.P. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. — Wiley, 2013
