CC BY
14ISSN 0868-5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2014, том 24, № 2, c. 98-103
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ ДЛЯ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ -
УДК 543.9:543.068.8:53.082.56
© Н. А. Есикова, А. А. Евстрапов, Т. В. Антропова
МИКРОФЛЮИДНОЕ УСТРОЙСТВО С ОПТИЧЕСКИМ СЕНСОРНЫМ ЭЛЕМЕНТОМ НА ОСНОВЕ НАТРИЕВОБОРОСИЛИКАТНОГО ПОРИСТОГО СТЕКЛА ДЛЯ ИММУННОГО АНАЛИЗА
В статье представлены результаты исследований по постановке конкурентного иммунного анализа на пористом стекле SBS-МАП (средний размер пор 490 нм, пористость 50 %) и в микрофлюидном устройстве с интегрированным сенсорным элементом. Продемонстрирована возможность обнаружения инсулина в диапазоне концентраций (2.9^10-7^2.3^10-6) М в 600 мкл пробы на сенсорном элементе и в 40 мкл пробы в микрофлюидном устройстве с интегрированным сенсорным элементом.
Кл. сл.: микрофлюидное устройство, конкурентный иммунный анализ, натриевоборосиликатное пористое стекло
ВВЕДЕНИЕ
Разработка биосенсорных систем на основе микрофлюидных технологий является одним из перспективных направлений аналитического приборостроения [1]. Благодаря высокой специфичности связывания широкое распространение получили иммунные методы анализа [2]. Наиболее чувствительным методом детектирования результата иммунной реакции является флуоресцентный метод [3, с. 259-262]. Применение натриевобороси-ликатных пористых стекол (ПС), обладающих такими свойствами, как термическая, химическая и биологическая устойчивость, прозрачность в видимой области спектра в сочетании с регулируемыми структурными характеристиками и превосходными адсорбционными свойствами, обусловленными большим объемом пор с разветвленной поверхностью, способной к хемосорбции разнообразных веществ [4], позволяет дополнительно повысить чувствительность анализа. Для создания сенсорного элемента необходимо иммобилизиро-вать на поверхность пористого стекла сенсорный слой, например, методом ковалентного связывания. Адаптация иммунного анализа под формат микрофлюидного устройства дает возможность снизить расход пробы и реагентов, повысить быстродействие и в перспективе объединить несколько стадий или весь анализ на одном устройстве [5].
Данная статья является развитием работы [6], в которой показана принципиальная возможность создания сенсорного элемента на основе натриево-боросиликатного пористого стекла.
СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА
Иммобилизация белка на натриевоборосиликатное пористое стекло проводится в 5 стадий: 1) предварительный прогрев стекла для удаления сорбированной влаги; 2) активация поверхности; 3) силанизация; 4) обработка глутаральдегидом и 5) непосредственно иммобилизация белка. Принцип функционирования сенсорного элемента основан на конкурентной иммунной реакции, что позволяет исключить стадию связывания образовавшегося иммунного комплекса с флуоресцентной меткой для детектирования:
IgG + (FITC-Ins-) + Ins
I
(IgG-FITC-Ins) + (IgG-Ins) + (FITC-Ins) + Ins,
где IgG — иммобилизованный на пористое стекло иммуноглобулин G, FITC-Ins — меченный изоцио-натом флуоресцеина (fluorescein isothyocyanat, FITC) инсулин, Ins — немеченый инсулин, (IgG-Ins-FITC) и (IgG-Ins) — образующиеся меченый и немеченый иммунные комплексы.
В работе использовались реактивы фирмы Sigma Aldrich: белки (иммуноглобулин G, инсулин, бычий сывороточный альбумин) и соли для буферных растворов. Образцы натриевоборосиликатных пористых стекол разработаны и синтезированы в Институте химии силикатов им. В.И. Гребенщикова РАН.
1x10
-6
2x10 3x10 4x10"
Концентрация Ins (М)
5x10
-6
Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции сенсорных элементов от концентрации инсулина в пробе на длине волны 528 нм
6
ОБНАРУЖЕНИЕ ИНСУЛИНА В ПРОБЕ
Для обнаружения инсулина в пробе в статическом режиме было создано 17 образцов сенсорных элементов на основе ПС SBS-МАП (средний размер пор, согласно методу БЭТ, ~ 490 нм, пористость ~ 50 %) размером 8 х 8 х 0.5 мм. Концентрация раствора IgG для иммобилизации CIgG = = 5.7^0"7 М, БСА — 25 мг на образец.
Для контроля воспроизводимости сенсорных элементов (пористого стекла с иммобилизованным IgG) проведены измерения интенсивности флуоресценции образцов в отраженном свете на макете, состоящем из лазера DPBL-9010F (Photop Suwtech Inc, Китай) с длиной волны излучения 473 нм, столика для позиционирования образца, рамановского акусто-оптического спектрометра РАОС-1 (НТЦ уникального приборостроения РАН, Россия) и волоконно-оптической системы (далее макет детектора). На полученных зависимостях наблюдался широкий пик флуоресценции глутаральдегида, используемого при иммобилизации белка, с максимумом на длине волны 540 нм. Данные показали, что по уровню флуоресценции сенсорные элементы можно разделить на 2 группы из 12 и 5 образцов: (5020 ± 130) и (4340 ± 150) у.е. Такое разделение образцов позволяет улучшить воспроизводимость измерений. Однако в связи с ограниченным числом образцов иммунная реакция для каждой концентрации аналита проведена на двух образцах из одной группы сенсорных
элементов и на одном из другой, так чтобы учесть вклад, вносимый технологией изготовления в погрешность измерений. Коэффициент вариации (KV) интенсивности флуоресценции на 540 нм составил 2.7 %.
Конкурентная иммунная реакция на сенсорных элементах в статическом режиме осуществлялась в стеклянных бюксах. Для этого сенсорные элементы помещались в реакционную смесь (300 мкл меченого инсулина и 300 мкл инсулина) на 30 мин при температуре 37 °C. Измерения проводились при CFITC.Ins = 4.6-10"6 М, для концентраций CIns = = 4.610-5, 4.6-10"6, 2.3-10"6, 1.210-6, 5.7-10-7, 2.8-10-7 и 0 М. На рис. 1 приведены зависимости интенсивности флуоресценции (в отраженном свете) на длине волны 528 нм от концентрации инсулина после проведения иммунной реакции (по 3 образцам), измеренные на спектрофлуориметре HITACHI F-4010 (Япония). Коэффициент вариации (KV) не превышает 7 % для X = 528 нм. Приведенные длины волн соответствуют максимумам полученных спектральных зависимостей. На зависимости (рис. 1) наблюдается монотонный участок в диапазоне концентраций от 5.7-10-7 до 4.610-6 М, пригодный для проведения анализа. При концентрации аналита, равной концентрации меченого инсулина, интенсивность флуоресценции резко возрастает. Увеличение сигнала при больших концентрациях немеченого инсулина, возможно, связано с увеличением суммарной концентрации и его более плотным размещением на поверхности.
16 000-
1х10"6 2х10"6 3х10"6 4х10"6 Концентрация Ins (М)
5х10"
Рис. 2. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации инсулина в пробе на длине волны 523 нм
0
Немонотонный участок с экстремумами также наблюдается при низких концентрациях инсулина.
Экспериментальные зависимости можно аппроксимировать функцией
-с/
F = F0 + А(1 -е /Со),
где (для длины волны 512 нм) F0 = 249.6 у.е. — интенсивность флуоресценции при отсутствии инсулина в пробе (величина фонового сигнала); С — концентрация аналита; С0 = 10-6 М — характерная концентрация инсулина; А = -125 у.е. — коэффициент, зависящий от аппаратной функции прибора. Коэффициент корреляции между экспериментальными значениями и аппроксимирующей функцией составляет 0.997. При С << С0 зависимость близка к линейной, коэффициент чувствительности равняется А / С0; при С >> С0 происходит насыщение.
На рис. 2 приведена аналогичная зависимость, измеренная на макете детектора. Характер зависимости отличается от полученной на спектро-флуориметре. Вероятно, это связано с глубиной проникновения излучения в ПС (область детектируемого слоя). При малой интенсивности возбуждающего излучения аналитический сигнал регистрируется преимущественно с поверхности сенсорного элемента, в этом случае интенсивность флуоресценции возрастает при уменьшении концентрации аналита, что согласуется с теоретическими предпосылками. При использовании в качестве источника возбуждения флуоресценции лазера детектируется сигнал с более
глубоких слоев сенсорного элемента. Величина аналитического сигнала существенно зависит от поглощения и рассеяния меченого и немеченого инсулина в объеме ПС, определяемом в том числе концентрацией аналита. Измерение интенсивности пропускания в проходящем свете позволяет регистрировать интегральный аналитический сигнал на фиксированной толщине сенсорного элемента. Коэффициент вариации аналитического сигнала при детектировании конкурентной реакции по трем измерениям для трех образцов не превышает 2.5 %. В случае проведения реакции только с меченным инсулином КУ составляет 6 %.
Зависимость для длины волны 523 нм (рис. 2) также можно аппроксимировать функцией F при Fo = 10202 у.е., О = 7.25-10-7 М, А = 3422 у.е. Коэффициент корреляции между экспериментальными значениями и аппроксимацией составляет 0.987. Используя полученные результаты, можно оценить рабочий диапазон определяемых концентраций инсулина на созданных сенсорных элементах, соответствующий монотонному участку зависимости: (2.9-10-7^2.3-10-6) М инсулина в 600 мкл реакционной смеси.
ОБНАРУЖЕНИЕ ИНСУЛИНА НА МИКРОФЛЮИДНОМ УСТРОЙСТВЕ
Прототипы микрофлюидного устройства для проведения иммунной реакции представляют собой двухуровневую систему подвода / отвода пробы и регентов к интегрированному в устройство
Рис. 3. Изображение прототипа микрофлюидного устройства (а) и его поперечное сечение (б).
1 — сенсорный элемент, 2 — двухуровневая система подвода / отвода пробы и реагентов
а
б
Рис. 4. Схема проведения анализа на МФУ.
а — введение пробы, б — проведение иммунной реакции, в — промывка МФУ
сенсорному элементу на основе пористого стекла (рис. 3) и позволяют проводить иммунный анализ в пробе объемом до 40 мкл. Материалом для МФУ выбран полидиметилсилоксан (Sylgard-184, Dow Corning), поскольку он обладает высоким свето-пропусканием в видимой области спектра и позволяет оперативно создавать прототипы устройств в условиях исследовательской лаборатории. Сенсорный элемент вклеивается в МФУ при помощи более вязкого силастика Т4 (ООО "Пента Север").
Измерения интенсивности флуоресценции от исходных сенсорных элементов в отраженном свете (концентрация IgG для иммобилизации CigG = 9.2-10~8 М) показали, что полученные образцы следует разделить на 3 группы по интенсивности флуоресценции на длине волны 524 нм: 8450 ± 125, 9650 ± 140 и 10350 ± 140 у.е.
Концентрация меченого инсулина для проведения иммунной реакции на МФУ составила CFITc-Ins = 4.6-10~6 М. Концентрация БСА — 25 мг/образец. Измерения проводились при CIns = 4.6-10-6, 2.340-6, 1.2-10-6 и 7.540-7 М.
Поскольку результаты исследования массопе-реноса через пористое стекло показали, что заполнение порового пространства ПС SBS-МАП раствором FITC-Ins происходит примерно за 4 мин, то применялась следующая последовательность операций: верхняя часть устройства заполнялась пробой, а через 5 мин нижняя часть устройства заполнялась буфером (пористая структура уже заполнена пробой) (рис. 4, а). Далее для проведения иммунной реакции МФУ выдерживалось 30 мин
в термостате при температуре 37 °C, в течение которых нижняя часть сенсорного элемента промывалась натрий-фосфатным буферным раствором (PBS) при помощи перистальтического насоса (рис. 4, б). После этого обе стороны МФУ промывались буфером (рис. 4, в), а затем проводились оптические измерения. Общее время анализа, включая стадии заполнения, инкубирования и промывки устройства составило 1 ч 40 мин. Детектирование осуществлялось на макете детектора путем измерения интенсивности флуоресценции находящегося в МФУ сенсорного элемента в проходящем свете. Зависимость интенсивности флуоресценции образцов от концентрации инсулина в пробе после проведения иммунной реакции приведена на рис. 5.
Зависимость аппроксимируется функцией F, при этом: Fo = 16111 у.е., Со = 1.25-10-6 М — характерная концентрация инсулина, А = 8500 у.е. Коэффициент корреляции между экспериментальными значениями и аппроксимирующей функцией составляет 0.9994. Аналогичные зависимости также были получены для концентрации Ситс-ьк = 4.6-10-6 М по 10 образцам.
Как следует из графиков, увеличение концентрации аналита приводит к повышению интенсивности флуоресценции. Корреляция аппроксимирующей функции и экспериментальных данных для измерений в проходящем свете существенно выше, чем для ранее проведенных измерений на сенсорных элементах в отраженном свете. Это может быть связано с тем, что при детектировании
<и 16 000
1х10-6 2x10"
Концентрация П (М)
4.8x10"
Рис. 5. Градуировочная зависимость при определении инсулина в пробе на МФУ.
От
5 = 4.6-10 М. Длина волны измерений 528 нм
в проходящем свете исключается влияние концентрации аналита на глубину детектирования, не учтенное в аппроксимирующей функции.
Вышеприведенные результаты продемонстрировали возможность обнаружения инсулина в диапазоне концентраций (2.9^10-7^2.3^ 10-6) М в 40 мкл реакционной смеси за 1ч 40 мин.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Разработан, создан и исследован прототип микрофлюидного устройства с интегрированным сенсорным элементом на основе натриевоборосили-катного стекла SBS-МАП для иммунного анализа.
Совокупность исследований позволила продемонстрировать возможность обнаружения инсулина в диапазоне концентраций (2.9Т0"7^-2.3Т0"6) М в 600 мкл пробы на сенсорном элементе в статическом режиме и в 40 мкл пробы в МФУ за 1 ч 40 мин.
При проведении анализа на сенсорном элементе и детектировании результатов иммунной реакции на спектрофлуориметре НкасЫ-Р4010 и макете детектора получены градуировочные зависимости, противоположные друг другу. Выдвинута гипотеза о том, что величина аналитического сигнала определяется глубиной проникновения возбуждающего излучения (зависящей в том числе от концентрации аналита), неоднородностью распределения иммунного комплекса
по глубине пористого стекла и областью регистрации сигнала флуоресценции. Таким образом, детектирование результата иммунной реакции на пористом стекле в проходящем свете позволило уменьшить влияние данных факторов на аналитический сигнал.
Работа выполнена при поддержке субсидией молодым ученым, молодым кандидатам наук вузов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга КНВШ за 2013 г.
Авторы благодарят Цымбалова А.И. за создание мастер-форм для отливки деталей и устройств детектирования и д.ф.-м.н. Буляницу А.Л. за конструктивную критику и терпеливое обсуждение результатов, а также за ряд ценных замечаний и рекомендаций.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Микрофлюидные системы для химического анализа / Под ред. Золотова Ю.А., Курочкина В.Е. М.: Физматлит, 2011. 528 с.
2. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. 288 с.
3. Основы аналитической химии. В 2 кн. / Под ред. Золотова Ю.А. М.: Высшая школа, 1996. 461 с.
4. Антропова Т.В. Физико-химические процессы создания пористых стекол и высококремнеземных материалов на основе ликвирующих щелочнобороси-ликатных систем. Автореф. дис. ... д-ра хим. наук. СПб., 2005. 45 с.
5. Lin C.-C., Wang J.-H., Wu H.-W., Lee G.-B. Microfluidic immunoassays // JALA. 2010. Vol. 15, nu. 3. P. 253-274.
6. Evstrapov A., Esikova N., Rudnitskaja G., Antropova T. Porous glasses as sensor elements for microfluidic chips // Optica Applicata. 2010. Vol. 40, nu. 2. P. 333-340.
Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург (Есикова Н.А., Евстрапов А.А.)
Институт химии силикатов им. И.В. Гребенщикова РАН, г. Санкт-Петербург (Антропова Т.В.)
Контакты: Есикова Надежда Александровна, elpis-san@yandex.ru
Материал поступил в редакцию: 19.12.2013
MICROFLUIDIC DEVICE WITH OPTICAL SENSOR ELEMENT BASED ON SODIUMBOROSILICATE POROUS GLASSES FOR IMMUNE ANALYSIS
N. A. Esikova1, A. A. Evstrapov1, T. V. Antropova2
1 Institute for Analytical Instrumentation ofRAS, Saint-Petersburg, RF Grebenshchikov Institute of Silicate Chemistry of RAS, Saint-Petersburg, RF
Results of studies on the implementation of a competitive immune analysis on at sodiumborosilicate porous glass SBS-MAP (490 nm average pore size, porosity 50 %) and in a microfluidic device with an integrated sensor element are discussed in the article. The opportunity of insulin detection is demonstrated in concentration range (2.9-10-7^2.3-10-6) M at sensor element in sample volume 600 ^l and in microfluidic device with sensor element in sample volume 40 ^l.
Keywords: microfluidic device, competitive immune analysis, sodiumborosilicate porous glass
REFERENСES
1. Lin C.-C., Wang J.-H., Wu H.-W., Lee G.-B. Microfluidic immunoassays. JALA, 2010, vol. 15, nu. 3, pp. 253-274.
2. Evstrapov A., Esikova N., Rudnitskaja G., Antropova T. Porous glasses as sensor elements for microflui-
dic chips. Optica Applicata, 2010, vol. 40, nu. 2, pp. 333-340.
Contacts: Esikova Nadezhda Aleksandrovna, elpis-san@yandex.ru
Article arrived in edition: 19.12.2013
