CC BY
64
УДК 544.773.432;547.485.5
Получение функциональных ингредиентов с применением принципа инкапсулирования для сохранения нативной структуры биологически
активных белков
Дружинина Людмила Сергеевна, аспирант e-mail: ljusechka17@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Cаратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Евтеев Александр Викторович, ведущий специалист учебно-научной испытательной лаборатории по определению качества пищевой и сельскохозяйственной продукции
e-mail: ewteew@gmail.com
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Ларионова Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, заведующий кафедрой «Микробиология, биотехнология и химия» e-mail: larionovaos@sgau.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Банникова Анна Владимировна, кандидат технических наук, доцент кафедры «Технологии продуктов питания», заведующая учебно-научно-испытательной лабораторией по определению качества пищевой и сельскохозяйственной продукции e-mail: annbannikova@gmail.com
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Евдокимов Иван Алексеевич, доктор технических наук, профессор института живых систем, кафедра прикладной биотехнологии e-mail: ievdokimov@ncfu.ru
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет»
Аннотация. В данной работе приведены результаты исследований по созданию функциональных ингредиентов с применением принципа инкапсулирования для сохранения нативной структуры биологически активных белков. Были проведены наблюдения по изменению их механических свойств и количества высвободившегося инкапсулированного белка в условиях ферментативного гидролиза in vitro. Изучение механических свойств показывает, что капсулы становится более плотными в условиях имитированного «желудка», что связано с «усадкой» биополимерного геля при низких значениях рН. В фазе модельного «кишечника» происходит набухание капсул и их последующий распад, что позволяет говорить о контролируемом высвобождении инкапсулированных биоактивных компонентов. Отмечено, что полислойные капсулы имели наибольшую склонность противостоять агрессивной среде «модельного желудка» и сконцентрировать в себе максимальное количество биоактивного компонента. Выявлено, что концентрация белка в капсулах была снижена на 20% во время прохождения фазы «искусственного желудка», однако 80% биологически активного вещества было высвобождено в имитированных кишечных условиях. Результаты исследований показывают, что изменения механических свойств и набухание инкапсулированных функциональных ингредиентов обеспечивают прямую связь в управлении высвобождением биологически активных веществ в конкретном месте имитированного желудочно-кишечного тракта человека.
Ключевые слова: контролируемое высвобождение, биополимеры, гели, набухание.
Молоко является особо важным источником биологически активных пептидов. Последние находятся в составе как казеина (а, в, к и Y-казеина), так и белков сыворотки (а-лактальбумина, (в-лактоглобулина, лактоферрина и иммуноглобулинов), и могут быть высвобождены в ходе гидролиза собственными ферментами пищеварения или ферментами микроорганизмов. Содержащиеся в молоке функциональные белки обладают широчайшим спектром биологической активности. Так, содержащиеся в молоке и молозиве многочисленные факторы роста играют важнейшую роль в росте и развитии организма новорожденных. Некоторые из этих факторов (EGF, TGFp, IGF-I, IGF-II) являются необходимыми для пролиферации и дифференцировки специфических типов клеток, включая как клетки органов ЖКТ, так и других систем (включая ЦНС). Отдельно необходимо указать роль факторов роста в процессах клеточной репарации и формирования иммунитета. Данное свойство необходимо также и взрослому человеку. Все эти функции обеспечиваются способностью факторов роста влиять на процессы синтеза ДНК, транскрипции РНК и синтеза белка.
Содержащиеся в молоке и молозиве иммуноглобулины оказывают защитное действие, подавляя агглютинацию и адгезию патогенных бактерий к поверхности эпителиальных клеток, осуществляя нейтрализацию токсинов и инактивацию вирусов. IgA, содержащийся в молоке и в молозиве, обеспечивает формирование пассивного иммунитета у новорожденных, так как их собственный интестинальный барьер не обладает достаточной степенью зрелости. IgM в то же время является наиболее эффективным в отношении нейтрализации вирусов и подавлении бактериальной агглютинации.
Основываясь на источниках литературы [1-3] и материалах собственных исследований [4-8], инкапсуляция позволяет максимально сохранить свойства биологически активных веществ от внешних агрессивных условий. Нами ранее была разработана технология получения полислойных капсул для создания новых видов ингредиентов, содержащих биологически активные вещества молока. Цель данного исследования - оценить возможность инкапсулирования модельных биологически активных белков и пептидов, а также процесс их высвобождения в имитированных условиях желудочно-кишечного тракта. Таким образом, был реализован комплексный подход в целях установления динамики высвобождения белковых веществ, тем самым подтверждая возможность контролируемой доставки биоактивных компонентов. С точки зрения перспективности, данные технологии можно применять в производстве диетических и лечебных продуктов питания, а также создания сухих ингредиентов и смесей в целях обеспечения баланса основных питательных веществ.
В работе были использованы следующие ингредиенты: альгинат натрия (Sigma Aldrich); сывороточный альбумин (BSA) (Bovogen, Австралия; содержание белка -> 98% согласно результатам электрофореза в агарозном геле, рН 1% раствора в 0,15 М NaCl - 6,5-7,2); карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ, Lihong fine chemicals, Китай; вязкость 2% водного раствора - 10000 мПа-с); аналитические реагенты: хлорид кальция, хлорид натрия, соляная кислота, одноосновный фосфат калия (BDH Chemicals, Poole, Англия); соли желчных кислот, панкреатин (6000 U) и пепсин (3600 U) (Aventis Farm Ltd., Индия).
Подготовка инкапсулированных ингредиентов: капсулы получали при комнатной температуре тремя различными методами:
1. 2% альгината натрия и 2% BSA растворяли в деионизированной воде при
непрерывном перемешивании в течение 2 ч при 22 °С. 50 мл данного раствора капали в 50 мл 0,025 М раствора хлорида кальция с использованием воронки для создания потока. Капсулы оставляли в растворе хлорида кальция на 30 мин, а затем извлекали из раствора и промывали с помощью деионизированной воды. Капсулы хранили в контейнере со свежим раствором хлорида кальция при 5 °С в течение 22 часов перед исследованиями.
2. Подготовка образцов была та же, что и при способе 1, но с различной концентрацией полимеров: 1,5% альгината натрия и 1% BSA. Кроме этого, в рамках апробации технологии полислойных капсул полученные ингредиенты помещали в 1% раствор КМЦ на 30 мин, затем переносили в емкость с хлоридом кальция и оставляли еще на 30 минут и, наконец, промывали деионизированной водой. Капсулы хранили, как описано ранее.
3. Способ получения полислойных капсул был подобным способу 2, но с различными концентрациями компонентов: 2% альгинат натрия, 2% BSA и 1% КМЦ [8].
Ферментативный гидролиз in-vitro: был разработан и адаптирован экспериментальный протокол, имитирующий желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека.
На стадии искусственного «желудка» использовали имитированный желудочный сок, который содержал 2%-ный раствор NaCl в деионизированной воде и 3600 U/мл пепсина при рН = 2. Образцы инкубировали на водяной бане при постоянном встряхивании (37 °C) в течение заданного промежутка времени (до 120 мин).
После стадии искусственного «желудка» капсулы переходили на стадию искусственного «кишечника», где их помещали в предварительно нагретый (37 °C) имитированный кишечный сок (0,68% одноосновного фосфата калия; 0,1% солей желчных кислот; 0,4% панкреатин; рН = 7,5). Образцы инкубировали при 37 °С при постоянном встряхивании в течение заданного интервала времени (до 20 мин). В конце установленного периода времени пробы промывали деионизированой водой и анализировали на содержание белка.
Определение содержания белка: 200 мг капсул промывали деионизированной водой, измельчали и гомогенизировали с добавлением фосфатного буфера (рН = 7,4). Образцы выдерживали при этих условиях в течение 1 ч при непрерывном перемешивании при температуре 4 °С. Затем образцы центрифугировали в течение 10 мин при 8 000 g, надосадочую жидкость использовали для определения содержания белка. Для этого, добавляли 5 мл реагента Брэдфорда в 0,1 мл надосадоч-ной жидкости. Образец выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин до изменения цвета; максимальное оптическое поглощение регистрировали при длине волны 595 нм. До проведения исследований была построена калибровочная кривая в диапазоне концентраций BSA от 0,01 до 0,1 мг на мл.
Текстурный анализ: сжатие капсул, прошедших условия ферментативного гидролиза in vitro, было проведено с помощью анализатора текстуры Brookfield CT3-4500. Измерительная проба состояла из цилиндрического алюминиевого зонда (диаметр 6 мм), которым было проведено сжатие образца на 30% от первоначальной высоты капсулы при 1,5 мм/с с нагрузкой 0,067 H. В целях получения статистически репрезентативных результатов было сжато тридцать капсул каждого образца. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (22 ± 1 °С).
Модуль Юнга рассчитывали, используя следующее уравнение [4]:
3 X (1 - V2} х F
Е =
ЛГхТР
где d - диаметр капсулы, мм; F - сила, приложенная к капсуле, Н; H -смещение, м; v - коэффициент Пуассона.
В процессе хранения и переработки продукции происходит инактивация физиологически активных веществ, в т.ч. белков. Как уже было отмечено, при применении технологии инкапсулирования обеспечивается сохранение функциональных пищевых ингредиентов в нативном виде как до, так и после обогащения ими продуктов питания. Известно также, что инкапсуляция способствует эффективному усвоению биологически активных веществ организмом человека, обеспечивая адекватную биодоступность и сохранение физиологических свойств. Нами была изучена кинетика высвобождения модельных биоактивных белков (сывороточный альбумин) из полислойных капсул, содержащих альгинат натрия и КМЦ, проходящих модельный процесс деградации в условиях ферментативного гидролиза in vitro, имитирующих желудочно-кишечный тракт человека.
Экспериментальные данные по изучению кинетики высвобождения инкапсулированных ингредиентов из моно- и полислойных капсул позволили установить, что почти 90% остаточного количества белка было высвобождено из моно- и полислойных капсул в фазе «искусственного кишечника», что говорит об их роли в качестве защитного компонента биологически активных соединений в нативной форме, а также их контролируемой доставки. Выявлено, что концентрация белка в капсулах была снижена на 20% во время прохождения фазы «искусственного желудка», однако 80% биологически активного вещества было высвобождено в имитированных кишечных условиях.
(D
ч fr
к
ев
W «
се W
ч
(D
ю «
s я
ев Л H
к
(D
я к
о «
0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
Фаза искусственного "желудка"
Фаза искусственного "кишечника"
о <> о H
:: [] " " " [] []
_1_I_
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Время, мин
Рис. 1. Концентрация BSA в капсулах, полученных по способу 1 (А), 2 (п),3 (О) в условиях ферментативного гидролиза in vitro в зависимости от времени
Из рисунка 1 видно, что полислойные капсулы, полученные по способу 3 (2% альгината натрия, 1% КМЦ + 2% BSA) имели наибольшую концентрацию модельного биологически активного белка в модельных условиях ЖКТ человека. Впоследствии капсулы, полученные по способу 2, имели максимальное высвобождение BSA за счет меньшего содержания биополимеров на стадии подготовки инкапсулированных ингредиентов.
Влияние кислых условий «модельного желудка» на морфологию капсул также было рассмотрено. Показано, что снижение рН может привести к некоторой «усадке» биопролимерного геля, что стало причиной увеличения плотности геля. Полученные данные позволяют говорить о прохождении материалов через среду с высокой кислотностью, которая, как известно, оказывает деградирующий эффект на белки.
На рисунке 2 показана взаимосвязь высвобождения биоактивных белков и механических свойств капсул в условиях ферментативного гидролиза in vitro в зависимости от времени [4]:
(2)
где С - высвобождение вещества, %; О обозначает концентрацию вещества в определенное время, %; СО - это начальная концентрация вещества, %.
Наглядно показано, что набухание и распад капсул в кишечных условиях обеспечивают контролируемую доставку модельных биологически активных соединений. Установлено, что высвобождение биоактивного компонента регулируется составом капсул и условиями окружающей среды.
й и К
й и К
л
ч
6.0
5.0 -
л
В
£ 4.0 А
3.0
2.0
1.0
0.0
Фаза искусственного "желудка"
120
- 100
- 80
Фаза lO искусственного
60
40
50
100
Время, мин
150
200
К
<D «
О
ю о и о
3 и
20
0
0
Рис. 2 . Взаимосвязь механических свойств (открытые символы) и кинетики высвобождения биологически активных белков в условиях ферментативного гидролиза in vitro в зависимости от времени (закрытые символы) в модельных условиях желудочно-кишечного тракта (■= - способ 2, о^ -способ 3)
Таким образом, изменение типа и количества биополимеров в инкапсулированных ингредиентах позволяют управлять механическими свойствами матрицы и использовать их для доставки биоактивных соединений с максимальной скоростью в фазе кишечника.
Несомненно, различные физико-химические, физиологические и метаболические факторы оказывают влияние на поглощение белка в естественных условиях in vivo. В этой связи, помимо основных физико-химических параметров инкапсулированных ингредиентов, рассмотренных в данном исследовании, необходимо обратить внимание на поглощение данных биоактивных соединений и их влияние на организм животных. Исследование данных показателей будет осуществлено в дальнейшей работе.
Выводы
В данной работе исследована возможность получения функциональных ингредиентов с применением принципа инкапсулирования для сохранения нативной структуры биологически активных белков и их контролируемым высвобождением. Полученные данные по механическим свойствам капсул подтверждают целесообразность данной технологии, поскольку разработанные ингредиенты набухают в имитированных кишечных условиях и в конечном счете распадаются в течение 160 мин ферментативного гидролиза in vitro. Показано, что полислойные капсулы наиболее защищены от изменений рН и ионной силы, свойственным ЖКТ человека. Результаты по количеству белка, высвободившегося из капсул, позволяют предположить, что разработанные ингредиенты способны выдерживать кислые условия желудка и высвободить инкапсулированный материал в модельном тонком кишечнике. Полученные данные перспективны в области разработки средств контролируемой доставки биоактивных компонентов в пищевой и фармацевтической промышленности, а также получения «функциональных продуктов», таких как детское, спортивное питание, сухие завтраки, молочные продукты, а также сухих ингредиентов и концентратов.
Список литературных источников:
1. Eriksen, E. K., Different digestion of caprine whey proteins by human and porcine gastrointestinal enzymes / E. K. Eriksen, H. Holm, E. Jensen, R. Aaboe, T. G. Devoid, M. Jacobsen et al.// The British Journal of Nutrition. - 2010. - 104(3). - P. 374-381.
2. Rayment, P. Investigation of alginate beads for gastro-intestinal functionality, Part 1: In vitro characterization / P. Rayment, P. Wright, C. Hoad, E. Ciampi, D. Haydock, P. Gowland & M.F. Butler // Food Hydrocolloids. - 2009. - 23. - P. 816-822.
3. Steijns, J. Gastric digestion of bovine lactoferrin in vivo in adults / J. Steijns, R. J. Brummer, F. J. Troost, & W. H. Saris // The Journal of Nutrition. - 2001. -131(8). - P. 2101-2104.
4. Gorbunova, N. Kinetics of ascorbic acid transport from alginate materials during in vitro digestion / N. Gorbunova, A. Evteev, I. Evdokomov, A.Bannikova // Journal of Food and Nutrition Research. - 2016. - № 55(2). - P. 148-158.
5. Банникова, А.В. Разработка технологии инкапсулированных форм белков и антиоксидантов // Современная наука и инновации. - 2016. - №1(16). - С. 56-60.
6. Горбунова, Н.В Практические аспекты создания и исследование инкапсулированных форм аскорбиновой кислоты в условиях ферментативного гидролиза / Н.В Горбунова, А.В. Банникова // Технология и товароведение инновационных пищевых продуктов. - 2016. - №2(37). - С. 35-40.
7. Горбунова, Н.В. Совершенствование получения биополимерных матриц адресной доставки инкапсулированных форм биологически активных веществ / Н.В. Горбунова, А.В. Банникова // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2016. - № 6(2). - С. 65-70.
8. Оценка возможности применения полислойных капсул на основе пищевых волокон в качестве средств адресной доставки биоактивных белков / Л.С. Разумова, А.В. Евтеев, О.С. Ларионова, И.А. Евдокимов, А.В. Банникова // Аграрный научный журнал. - 2016. - № 8. - С. 75-78.
References:
1. Eriksen E. K. Different digestion of caprine whey proteins by human and porcine gastrointestinal enzymes. The British Journal of Nutrition, 2010, no. 104(3), pp. 374-381.
2. Rayment P. Investigation of alginate beads for gastro-intestinal functionality, Part 1: In vitro characterization. Food Hydrocolloids, 2009, no. 23, pp. 816-822.
3. Steijns J. Gastric digestion of bovine lactoferrin in vivo in adults. The Journal of Nutrition, 2001, no. 131(8), pp. 2101-2104.
4. Gorbunova N. Kinetics of ascorbic acid transport from alginate materials during in vitro digestion. Journal of Food and Nutrition Research, 2016, no. 55(2). pp. 148-158.
5. Bannikova A.V. Development of technology of encapsulated forms of proteins and antioxidants. Sovremennaya nauka i innovatsii. [Modern science and innovation], 2016, no. 1(16), pp. 56-60. (in Russian)
6. Gorbunova N.V. Practical aspects of the creation and study of encapsulated forms of ascorbic acid in the conditions of enzymatic hydrolysis. Tekhnologiya i tovarovedenie innovacionnyh pishchevyh produktov [Technology and merchandising of innovative food products], 2016, no. 2(37), pp. 35-40. (in Russian)
7. Gorbunova N.V. Improving obtain biopolymer matrix targeted delivery of encapsulated forms of biologically active substances. Izvestiya vuzov. Prikladnaya himiya i biotekhnologiya [Proceedings of the universities. Applied Chemistry and Biotechnology], 2016, no. 6(2), pp. 65-70. (in Russian)
8. Razumova L.S. Evaluation of the possibility of using multilayer capsules on the basis of dietary fiber as a means of targeted delivery of bioactive proteins. Agrarnyj nauchnyj zhurnal [Agricultural Research Journal], 2016, no. 8, pp. 7578. (in Russian)
Preparation of functional ingredients based on the encapsulation principle for the conservation of native structure
of biologically active proteins
Druzhinina Lyudmila, postgraduate student e-mail: ljusechka17@mail.ru
The Federal State Budget Educational Institution of Higher Education "Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov "
Evteev Alexander, Leading Specialist of the Educational and Scientific Testing Laboratory for Determining the Quality of Food and Agricultural Products e-mail: ewteew@gmail.com
The Federal State Budget Educational Institution of Higher Education "Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov "
Larionova Olga, Doctor of Science (Biology), Head of the Department "Microbiology, Biotechnology and Chemistry" e-mail: larionovaos@sgau.ru
The Federal State Budget Educational Institution of Higher Education "Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov "
Bannikova Anna, Candidate of Science (Technology), Associate Professor of the Department of Food Technology, Head of the Educational, Scientific and Testing Laboratory for Determining the Quality of Food and Agricultural Products e-mail: annbannikova@gmail.com
The Federal State Budget Educational Institution of Higher Education "Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov "
Evdokimov Ivan, Doctor of Science (Technology), Professor of the Institute of Living Systems, Department of Applied Biotechnology e-mail: ievdokimov@ncfu.ru
The Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Professional Education "North-Caucasian Federal University"
Abstract. In this paper, we present the results of studies on the development of functional ingredients using the principle of encapsulation to preserve the native structure of biologically active proteins. Observations were made on the change in their mechanical properties and the amount of released encapsulated protein under conditions of enzymatic hydrolysis in vitro. The study of mechanical properties shows that the capsules become denser under conditions of a simulated "stomach", which is due to the "shrinkage" of the biopolymer gel at low pH values. In the phase of the model "intestine", swelling of the capsules takes place and their subsequent decay, which allows to speak about controlled release of encapsulated bioactive components. It was noted that the multilayer capsules had the greatest propensity to withstand the aggressive environment of the "model stomach" and concentrate in themselves the maximum amount of the bioactive component. It was found that protein concentration in the capsules was reduced by 20% during the passage of the "artificial stomach" phase, but 80% of the active substance was released in imitated intestinal conditions. The results of the studies show that changes in mechanical properties and swelling of encapsulated functional ingredients provide a direct link in controlling the release of biologically active substances at a particular location of the simulated human gastrointestinal tract.
Keywords: controlled release, biopolymers, gels, swelling.
