CC BY
60
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICAL-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY
Оригинальная статья / Original article
УДК 544.773.432, 547.485.5
DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-2-65-70
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПОЛИМЕРНЫХ МАТРИЦ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ ФОРМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
© Н.В. Горбунова, А.В. Банникова
Саратовский государственный аграрный университет
Были созданы полислойные капсулы на основе биополимеров растительного происхождения и оценено их поведение в условиях ферментативного гидролиза. Исследования степени набухания показывают, что все капсулы уменьшаются в размерах в условиях «искусственного желудка» в связи с протониро-ванием свободных карбоксильных групп альгината, тогда как в условиях «искусственного кишечника» полислойные капсулы демонстрируют набухание (а 40%). Результаты по анализу активности анти-оксиданта свидетельствуют, что разработанные полислойные капсулы способны выдерживать кислые условия и сохраняют более половины аскорбиновой кислоты, таким образом доставляя биологически активный компонент непосредственно в место всасывания питательных веществ. Использование разработанных капсул поможет снизить дефицит биологически активных веществ в рационе человека и принести новые разработки в сфере функциональных пищевых продуктов и ингредиентов. Ключевые слова: инкапсуляция, полислойные капсулы, набухание, высвобождение, ферментативный гидролиз.
Формат цитирования: Горбунова Н.В., Банникова А.В. Совершенствование получения биополимерных матриц адресной доставки инкапсулированных форм биологически активных веществ // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. т. 6, N 2. с. 65-70. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-2-65-70
DEVELOPMENT AND IMPROVEMENT OF BIOPOLYMER MATRICES FOR THE CONTROLLED DELIVERY
OF ENCAPSULATED BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
N.V. Gorbunova, A.V. Bannikova
Saratov State Agrarian University
In this work, multilayer capsules were developed on the basis of biopolymers of plant origin with evaluation of their behavior during enzymatic hydrolysis. The degree of swelling shows that all multilayer capsules had a reduction in size in acidic environment of "model stomach" due to the protonation of free carboxylate groups of alginate, whereas the capsules exhibit swelling (a 40%) in the conditions of "model intestine". The results on the amount of antioxidant released from the capsule during in vitro digestion show that the developed multilayer capsules are able to withstand the acidic environment and protect of more than half of ascorbic acid thus delivering directly the bioactive component in place where the nutrient absorption is taken place. Use of the designed capsule can help to reduce the deficit of biologically active substances in the human's diet and bring novel developments in the field of functional foods and ingredients.
Keywords: encapsulation, multilayer capsule, swelling, release, enzymatic hydrolysis
For citation: Gorbunova N.V., Bannikova A.V. Development and improvement of biopolymer matrices for the controlled delivery of encapsulated biologically active substances. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Bio-tekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 2, pp. 6570. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-2-65-70 (in Russian)
ВВЕДЕНИЕ тание. Адекватное, сбалансированное питание
Основным фактором, влияющим на общее обеспечивает нормальную жизнь человека,
состояние и здоровье человека, является пи- способствует профилактике заболеваний, по-
вышению работоспособности, создает условия для укрепления иммунной системы.
К сожалению, такие факторы, как урбанизация, ускорение темпов жизни и глобализация всё больше и больше отдаляет человека от природы, создавая определённые проблемы в области питания и здоровья. Так, сократилась потребность в энергетической составляющей пищи, увеличилось потребление консервированных, подвергнутых кулинарной обработке и хранению пищевых продуктов, и, как следствие, наблюдается дефицит в витаминах, макро- и микроэлементах. Анализ литературы показывает, что современные продукты питания не в силах обеспечить организм всеми необходимыми эссенциальными веществами, а их длительный дефицит приводит к различным заболеваниям и снижению иммунитета.
Состояние здоровья населения во всём мире и России в частности в последние годы показало, что медицине не удаётся сделать людей здоровыми только с помощью увеличения капиталовложений в здравоохранение. Все чаще работники здравоохранения ищут проблему заболевания в питании человека. Решение проблемы заключается в употреблении пищевых продуктов, обогащенных витаминами, белками, антиоксидантами, макро- и микроэлементами в дозах, покрывающих, по крайней мере, 30% суточной потребности в данных эссенциальных веществах.
Однако в обогащении витаминами существуют вопросы технологического характера, связанные с деградацией и биодоступностью эссенциальных веществ. Из литературных источников известно, что, например, витамин С легко разрушаем при воздействии света, температуры, изменении кислотности среды и других факторов. Функциональные продукты могут быть разработаны с включением инкапсулированных биологически активных соединений с целью их защиты от условий окружающей среды, повышения стабильности и сохранения нативных свойств [2]. Так, альгинаты являются нетоксичным, универсальным и экономичным материалом для создания гидрогеля. Технология использования альгинатов основана на известном свойстве образовывать сферы в присутствие солей двухосновных металлов, тем самым позволяя создавать барьерную оболочку, за счет которой сохранятся эсенциальные вещества в практически неизменном виде [5].
В литературе описано достаточное количество примеров по инкапсулированию масел, красителей, ароматизаторов, белков, витаминов и других веществ, однако имеется недостаточно информации по сравнению различных способов инкапсуляции, степени биодоступности инкапсулированного ингредиента и проявлению заданных физиологически ценных
свойств.
Цель настоящей работы - создание инкапсулированных форм аскорбиновой кислоты тремя различными способами, исследование их физико-химических параметров в процессе ферментативного гидролиза, а также анализ доступности инкапсулированного биологически ценного компонента.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для проведения исследований использовали альгинат натрия (Sigma Aldrich), аскорбиновую кислоту [C6H8O6] с аналитической чистотой более 99% (Hebel Welcome Pharmaceutical Co., Ltd.) и различные аналитические реагенты.
В работе были использованы три способа приготовления капсул:
1. Раствор альгината капали в раствор, содержащий 0,012 М хлорида кальция и 1% аскорбиновой кислоты. Далее капсулы хранили в растворе хлорида кальция 0,012 М при 5 оС.
2. Раствор альгината натрия и аскорбиновой кислоты капали в 0,012 М раствор хлорида кальция и там же хранили.
3. Раствор альгината капали в 0,012 М раствора хлорида кальция, пока не образовались шарики. Шарики оставались в ванне хлорида кальция в течение 30 мин, затем их просеивали и промывали деионизированной водой. Далее капсулы помещали в 1%-ый раствор аскорбиновой кислоты и оставляли там на 30 мин, затем переносили в 0,012 М раствор хлорида кальция на 30 мин и промывали деионизован-ной водой. Капсулы хранили, как описано выше.
Деградация капсул была исследована в ходе имитации модели переваривания в желудочных и кишечных соках.
Модельный желудочный сок: 2%-ый раствор NaCl в воде Millipore, рН 2 (1 М HCl), пепсин 3600 U / мл, температура 37 оС. Образцы инкубировали в водяной бане при постоянном встряхивании в течение заданного периода времени (120 мин).
Модельный кишечный сок: 0,68% одноосновного фосфата калия; 0,1% солей желчных кислот; 0,4% панкреатина; рН 7,5 (0,5 М NaOH); температура 37 оС. Образцы инкубировали в водяной бане при постоянном встряхивании в течение заданного периода времени (= 20 мин).
Степень набухания капсул была определена в условиях ферментативного гидролиза по следующей формуле:
S = 100^1,
mi
где S - это степень набухания капсул; mf - конечная масса капсулы; mi - начальная масса капсулы [8].
Выход капсул с аскорбиновой кислотой рассчитывали как отношение между весом капсул, полученных в конце процесса, и перво-
начальным весом инкапсулированных веществ. Эффективность инкапсуляции рассчитывали как соотношение между весом аскорбиновой кислоты в микрокапсулах от ее первоначального веса, который необходимо инкапсулировать [7].
Содержание влаги в альгинатных сферах определяли с использованием анализатора влажности Эвлас 2М (Сигагроприбор, Россия). Три грамма образца наносили на алюминиевую пластину и нагревали до 103 оС в течение 40 мин. Анализ проводили в трехкратном повторении. Анализ активности воды проводили с использованием АВК R 9 (АВК, Россия). Эксперимент проводили при комнатной температуре (22 оС) с использованием 10 г образца, в результате брали усредненное значение после трех повторов измерений.
Цвет капсул был измерен с помощью колориметра NR 100 ^Н, Китай). Были получены следующие цветовые параметры: Ц* (степень белизны / черноты), а* (покраснение и позеленение) и Ь* (желтизны и голубизны). Эксперимент был выполнен в 10-кратном повторении.
Для определения концентрации аскорбиновой кислоты и кальция использовали метод капиллярного электрофореза [3].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Биодоступность микронутриента характеризуется такими факторами, как:
- состав рациона, определяющий время прохождения пищи через кишечник;
- вязкость и эмульсионные характеристики пищи, рН;
- форма микронутриента, которая определяет скорость и степень его всасывания;
- стабильность в желудке и кишечнике при переваривании и метаболическую функциональность, т.е. легкость превращения в метаболически активные или коферментные формы;
- взаимодействие между микронутриентом и другими микро- и макрокомпонентами пищи [1].
Говоря о последнем факторе следует учитывать, что взаимодействия микро- и макро-нутриентов могут не только оказывать прямое
разрушающее или инактивирующее воздействие, но и оказывать косвенное влияние путем снижения степени всасывания микронутриента в кишечнике.
Так, в данной работе представлены три различных способа приготовления инкапсулированных форм аскорбиновой кислоты. Результаты исследований физико-химических характеристик одно- и полислойных капсул приведены в таблице.
При анализе полученных данных по выходу капсул, эффективности инкапсуляции, влажности, содержанию кальция, активности воды, параметров цвета не было выявлено существенного отличия между образцами каждого вида капсул (р > 0,05). Результаты таблицы показывают также, что размер и другие физико-химические параметры всех капсул в исследовании были схожи с литературными данными [4, 6, 8]. Все образцы показали сопоставимое количество инкапсулированной аскорбиновой кислоты, что подтверждается похожими значениями эффективности инкапсуляции.
Степень набухания разработанных капсул в модельных условиях желудочно-кишечного тракта изображена на рис. 1. В результате исследования выявлена похожая тенденция для всех видов капсул, заключающаяся в уменьшении размеров в условиях, где рН ниже 2. При этом капсулы, полученные по способу 3, сократились более значительно (примерно на 40%), чем капсулы, полученные по способу 1 (= 30%) и 2 (= 20%). Анализ литературы показывает, что данное сокращение в структуре геля альгината происходит за счет протонирования свободных карбоксильных групп альгината, позволяя аль-гинатной цепи сближаться и образовывать водородные связи [6].
Из рис. 1 видно, что полученные по способу 2 капсулы меньше в размере, по сравнению с другими образцами. Как обсуждалось ранее, это может быть связано первоначально с низким значением рН-системы из-за использования аскорбиновой кислоты на начальной стадии -производства капсул, что привело к образованию водородных связей и, как следствие,
Физико-химические параметры инкапсулированных форм аскорбиновой кислоты
Параметры Способ 1 Способ 2 Способ 3
Выход инкапсуляции, % 53,4 + 1,8 52,7 + 2,1 52,7 + 2,2
Эффект инкапсуляции, % 36,09 + 3,7 38,01 + 4,5 35,60 + 3,7
Содержание влаги, % 98,6 + 0,3 98,4 + 0,1 98,5 + 0,3
Содержание аскорбиновой кислоты, % 0,68 + 0,15 0,59 + 0,12 0,71 + 0,14
Ca, % 0,002 + 0,0003 0,002 + 0,0005 0,002 + 0,0007
Активность воды 0,99 + 0,01 0,99 + 0,01 0,99 + 0,01
L* 27,54 + 1,21 29,50 + 0,91 28,85 + 1,13
a* 1,95 + 0,16 2,71 + 0,14 2,13 + 0,16
ь* 5,74 + 0,18 5,67 + 0,24 5,86 + 0,43
Диаметр, мм 4,6 + 0,3 4,2 + 0,4 4,5 + 0,6
уменьшению размера капсул. Данная тенденция прослеживается по результатам таблицы, где заметно, что диаметр капсул, приготовленных по способу 2, значительно меньше. В стадии модельного «искусственного кишечника» все капсулы стали набухать в различной степени в связи с увеличением электростатических сил отталкивания, что впоследствии привело к распаду капсул [8].
Кинетика высвобождения аскорбиновой кислоты из капсул была охарактеризована с
помощью капиллярного электрофореза, основанного на миграции анионных форм аскорбиновой кислоты под действием электрического поля в кварцевом капилляре и в фосфатном или боратном электролите. Электрофореграм-мы были получены на длине волны 254 нм и оптимальном напряжении 25 кВ. Наблюдения высвобождения аскорбиновой кислоты были проведены в течение 180 мин в модельных условиях желудочно-кишечного тракта человека. Как было отмечено на рис. 2, максимальное
к к к
а
й
К л К си С си н О
40 -
20
-20 -
-40 -
-60 -
-80
Фаза "модельного желудка"
рН го 2
О
4 *
• I
А
О
О
Фаза "модельного кишечника" А
4 О
4
Ф ■
= 8 О
9 рН го 8
О Способ 1 ■ Способ 2 ▲ Способ 3
50
100
150
Время [мин]
Рис. 1. Степень набухания капсул, приготовленных по различным способам в модельных условиях желудочно-кишечного тракта
ьО Н О
ч
о
5®
О «
о я к ю ср
ы
о св
а
СЗ р
н я
<и
я
Я £
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Фаза "искусственного желудка"
Фаза "искусственно го кишечника"
О
111,
О Способ 1
I Способ 2
I Способ 3
30 60 90 120
Время [мин]
150
180
Рис. 2. Концентрация аскорбиновой кислоты в капсулах, полученных по разным способам в модельных условиях желудочно-кишечного тракта
0
0
0
высвобождение аскорбиновой кислоты наблюдалось из капсул, полученных по способу 2, что указывает на их слабую устойчивость сохранения антиоксиданта внутри матрицы вследствие частично разрушенной природы носителя на стадии получения капсул при добавлении аскорбиновой кислоты в альгинат натрия. Показано, что диффузия биоактивных веществ из капсул, полученных по способу 3, была менее выражена в связи с многослойным способом их приготовления.
На рис. 2 видно, что почти 90% от остаточного количества аскорбиновой кислоты было высвобождено из капсул в модельной фазе «искусственного кишечника». Таким образом, результаты показывают, что капсулы с 0,7% аскорбиновой кислоты в начале ферментативного гидролиза т-^Лт теряли около 0,20% к концу модельной фазы «искусственного желудка», но все же сохранили 0,5% антиоксиданта в модельной фазе «искусственного кишечника». В конце эксперимента капсулы, как оказалось, высвобождали все инкапсулированные биологически активные вещества.
ВЫВОДЫ
Обобщая вышесказанное, интерес к данной работе заключается в совершенствовании технологии приготовления капсул для контролируемого
1. Замощина Т.А. Лекарства и пища // Новая аптека. 2010. № 9. 57-60.
2. Колодязная В.С. Пищевая химия: учеб. пособие. СПб.: СПбГАХПТ, 1999. 140 с
3. Комарова Н.В., Каменцев Я.С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ». СПб.: ООО «Веда», 2006. 212 с.
4. Coppi G., lannuccelli V., Leo E., Bernabei M.T., Cameroni R. Chitosan- alginate microparticles as a protein carrier // Drug Development and Industrial Pharmacy. 2001. 27 (5). С. 393-400.
5. Goh C.H., Heng P.W.S., Chan L.W., Goh C.H. Alginate as a useful natural polymer for micro-
высвобождения модельных микронутриентов. Показано, что многослойные капсулы, приготовленные по способу 3, обладали наиболее оптимальными показателями для сохранения биологически активных соединений. Известно, что поглощение аскорбиновой кислоты в естественных условиях также зависит от физиологических и метаболических факторов, свойственных живому организму. Значит, на следующем этапе исследований будет обеспечено понимание функциональности капсул в условиях in vivo.
В этом исследовании разработан системный протокол для рационализации технологии получения инкапсулированных форм аскорбиновой кислоты. Перспективы промышленного применения данных технологических решений заключается в доставке биологически активных соединений через кислую среду, что является подтверждением их технофункциональности. Использование биополимерных мембран на основе растительных компонентов позволяет осуществлять прямой и контролируемый транспорт веществ, что впоследствии имеет большое значение в разработке «функциональных продуктов», а также спортивного и детского питания.
Работа выполнена в рамках Гоанта Президента РФ для поддержки молодых ученых кандидатов наук МК-5740.2015.4.
КИЙ СПИСОК
encapsulation and therapeutic applications // Carbohydrate Polymers. 2012. 88 (1). P. 1-12.
6. Norton I. T., Frith W.J., Ablett S. Fluid gels, mixed fluid gels and satiety // Food Hydrocolloids. 2006. № 20. С. 229-239.
7. Panyoyai N., Bannikova A., Small D.M., Shanks R.A., Kasapis S. Diffusion of nicotinic acid in spray-dried capsules of whey protein isolate // Food Hydrocolloids. 2016. № 52. С. 811-819.
8. Rayment P., Wright P., Hoad C., Ciampi E., Haydock D., Gowland P., Butler M.F. Investigation of alginate beads for gastro-intestinal functionality, Part 1: In vitro characterization // Food Hydrocolloids. (2009). № 23. С. 816-822.
REFERENCES
1. Zamoshchina T.A. Lekarstva i pishcha [Medicines and food]. Novaya apteka - New Pharmacy, 2010, vol. 9, pp. 57-60.
2. Kolodyaznaya V.S. Pishchevaya khimiya [Food chemistry]. St. Petersburg, SPBGAKHPT Publ., 1999, 140 p.
3. Komarova N.V Prakticheskoe rukovodstvo po ispol'zovaniyu sistem kapillyarnogo elektoforeza "Kapel'" [Practical guidance on the use of capillary systems electrophoresis "Kapel'"]. St. Petersburg, Veda Publ., 2006, 212 p.
4. Coppi G., lannuccelli V., Leo E., Bernabei M.T., Cameroni R. Chitosan-alginate microparticles
as a protein carrier. Drug Development and Industrial Pharmacy, 2001, no. 27(5), pp. 393-400. Cited 79 times. DOI: 10.1081/DDC-100104314
5. Goh C.H., Heng P.W., SChan L.W. Alginate as a useful natural polymer for microencapsulation and therapeutic applications. Carbohydrate Polymers, 2012, no. 88(1), pp. 1-12. Cited 94 times. DOI: 10.1016/j.carbpol.2011.11.012
6. Norton I.T., Frith W.J., Ablett S. Fluid gels, mixed fluid gels and satiety. Food Hydrocolloids, 2006, no. 20, pp. 229-239. Cited 67 times, DOI: 10.1016/j.foodhyd.2004.03.011
7. Panyoyai N., Bannikova A., Small D.M.,
Shanks R.A., Kasapis S. Diffusion of nicotinic acid in spray-dried capsules of whey protein isolate. Food Hydrocolloids, 2016, no. 52, pp. 811-819. Cited 21 times, DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2012.12.008
8. Rayment P., Wright P., Hoad C., Ciampi E.,
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Наталья В. Горбунова
Саратовский государственный аграрный университет
410005, Россия, г. Саратов, ул. Соколовая, 335 Аспирант
gelladriel@gmail.com Анна В. Банникова
Саратовский государственный аграрный университет
410005, Россия, г. Саратов, ул. Соколовая, 335 К.т.н, доцент, зав. лабораторией annbannikova@gmail.com
Поступила 15.02.2016
Haydock D., Gowland P., Butler M.F. Investigation of alginate beads for gastro-intestinal functionality, Part 1: In vitro characterization. Food Hydrocolloids, 2009, no. 23, 816-822. Cited 33 times, DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2008.04.011
AUTHORS' INDEX Affiliations
Natalia V. Gorbunova
Saratov State Agrarian University 335, Sokolovaya St., Saratov, 410005, Russia Postgraduate student gelladriel@gmail.com
Anna V. Bannikova
Saratov State Agrarian University 335, Sokolovaya St., Saratov, 410005, Russia PhD of Engineering, Associated professor, Head of the Laboratory annbannikova@gmail.com
Received 15.02.2016
