CC BY
15_МЕТОДЫ_
УДК 57.085.2:636.028 doi: 10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2018.3.106-110
ПОЛУЧЕНИЕ БЛАСТОЦИСТ МЫШИ В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕДАХ ПОСЛЕ МИКРОИНЪЕКЦИИ В ПРОНУКЛЕУСЫ ЗИГОТ СМЕСИ ПЛАЗМИД ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ КОМПОНЕНТОВ CRISPR/Cas9 СИСТЕМЫ
Максименко С.В., Трубицина Т.П., Белова Н.В., Кутьин И.В., Рябых В.П.
ВНИИ физиологии, биохимии и питания животных, Боровск Калужской обл.,
Российская Федерация
Цель работы - исследовать способность зигот к развитию до стадии бластоцисты после микроинъекции в их пронуклеусы смеси плазмид для экспрессии компонентов CRISPR/Cas9 системы и культивирования на коммерческих средах. Донорами клеток были самки мышей линии C57BL6/CBA в возрасте 6-9 недель. В качестве манипуляционной среды использовалась коммерческая среда Global with Hepes® с добавлением 10% заменителя сывороточного белка, а в качестве культуральной среды - Global® с добавлением 10% заменителя сывороточного белка. В результате получены данные, которые свидетельствуют о том, что исследованные среды могут быть успешно использованы для получения бластоцист. При культивировании после микроинъекции в течение суток вступили в развитие 84,5% эмбрионов, -стадии компактной морулы достигли 52%, из них стадии бластоцисты - 92%. Заключили, что выход бластоцист от числа микроиъецированных зигот на уровне 44% достаточен для выполнения дальнейших работ по получению геномно-редактированных животных, продуцирующих рекомбинантные белки с молоком.
Ключевые слова: эмбрионы мыши, генно-инженерные конструкции, микроинъекция, культивирование in vitro
Проблемы биологии продуктивных животных, 2018, 3: 106-110
Введение
Открытие технологии рекомбинантной ДНК в 1970-х положило начало новой эры для биологии. Сначала молекулярные биологи получили возможность манипулировать молекулами ДНК (Xiao et al., 2015), что позволило изучать гены и открывать новое в медицине и биотехнологии и впоследствии - непосредственно редактировать и модулировать функции геномных последовательностей ДНК. В 1980 Гордон и коллеги впервые применили метод микроинъекции в пронуклеус зигот для переноса чужеродных генов в эмбрион мыши, после чего данная технология получила распространение и широко используется по сегодняшний день (Gordon et al, 1980).
Наиболее широко применяется метод получения трансгенных мышей, включающий как микроинъекцию трансгена в пронуклеус оплодотворенных ооцитов, так и генетическое таргетирование (получение целевых мутаций) посредством использования эмбриональных стволовых клеток (Miguel et al., 2010).
Одним из основных методов получения генетически модифицированных животных является метод микроинъекции генно-инженерной конструкции в пронуклеусы зигот. Данный метод используется, преимущественно, для получения трансгенных мышей, кроликов и свиней. Это связано с недостаточной эффективностью метода, обусловленной низкой частотой встраивания рекомбинантной ДНК в геном, доступностью зигот на стадии двух пронуклеусов и сложностью проведения операций на крупных сельскохозяйственных животных (Максименко и др., 2013).
Система CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, регулярно расположенные группами короткие палиндромные повторы) - это адаптивная система иммунологической защиты прокариотов, обеспечивающая их иммунитет против генетически изменчивых элементов, таких как вирусная ДНК (Erwei еt al., 2017). Система CRISPR-Cas9 состоит из двух ключевых молекул, взаимодействие которых способно внести изменение в ДНК. Это фермент Cas9, способный разрезать геномную ДНК в определенном месте - рядом с РАМ-последовательностью, представляющей собой мотив 5'-NGG-3', и гРНК (гайдовая, или направляющая РНК), включающая в себя фрагмент размером 20 нуклеотидов, идентичный таковому рядом с РАМ-мотивом, и структурный фрагмент. В случае, когда тщательно подобранная гРНК комплементарно взаимодействует с нитью ДНК, которой она соответствует, эндонуклеаза Cas9, обнаружив рядом с РАМ-мотивом структурный фрагмент гРНК, вносит двухцепочечный разрыв в целевой последовательности ДНК. Последующий процесс молекулярной репарации ДНК приводит к появлению вставок, удалению или замещению части последовательности. После появления системы редактирования CRISPR/Cas9, существенно упростилось получение нокаутных и трансгенных животных, в первую очередь, мышей как модельных животных (Немудрый и др., 2014, Yang 2015).
Цель данной работы - исследовать способность зигот к развитию до стадии бластоцисты после микроинъекции генно-инженерной конструкции (смесь плазмид, экспрессирующих компоненты CRISPR/Cas9 системы) в пронуклеусы зигот и их культивирования на коммерческих средах.
Материал и методы
В качестве доноров эмбрионов были использованы самки мышей линии C57BL6/CBA в возрасте 6-9 недель, массой 14-16 г. У мышей была вызвана суперовуляция при помощи внутрибрюшинного введения 10 МЕ препарата «Фоллигон» (гонадотропин из сыворотки жеребых кобыл (СЖК), производитель - Московский эндокринный завод, РФ) с последующим (через 47 ч) введением 10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГч) (производитель - Московский эндокринный завод, РФ). После введения ХГч самки были помещены в клетку с самцами и на следующий день были проверены на наличие копулятивной пробки. Мыши с копулятивной пробкой были умерщвлены путём дислокации шейных позвонков через 70 ч после введения гонадотропина СЖК. Из яйцеводов с использованием коммерческой манипуляционной среды Global with Hepes® (производство LifeGlobal Group, США) с добавлением 10%-ным заменителем сывороточного белка (Quinn's Advantage™ SPS Serum Protein Substitute, производство SAGETM In Vitro Fertilization, Inc., США) были получены ооцит-кумулюсные комплексы, которые были очищены 0,1%-ным раствором гиалуронидазы (Sigma, США). Полученные эмбрионы были последовательно отмыты в трёх каплях манипуляционной среды, посчитаны и визуально оценены по качеству. Для последующих манипуляций были взяты только морфологически нормальные эмбрионы с видимыми пронуклеусами.
Как следует из табл. 1, не все полученные эмбрионы были с видимыми пронуклеусами, однако на одну самку-донора в среднем приходилось 18,8 морфологически нормальных эмбрионов, пригодных для микроинъекции, что является достаточным количеством для работы.
Таблица 1. Результаты индукции суперовуляции у мышей-доноров
Число самок-доноров
Т. .. „ Количество зигот
Количество извлеченных яйцеклеток
с пронуклеусами
С видимыми Без видимых
Всего пронуклеусами пронуклеусов n % n %
На одного донора n
20_437 377 86,3 60_13,7
18,8
Для микроинъекций готовили рабочий раствор ДНК (генно-инженерных конструкций) следующего состава: 1. Смесь плазмид pX330-g3 и pX330-g7, созданных на основе бицистронной плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene plasmid # 42230), как компоненты CRISPR/Cas9 системы (http://www.addgene.org/42230/); 2. Плазмида pWAPhLf, созданная в лаборатории клеточной и генной инженерии в качестве матрицы для сайт-специфического гомологичного встраивания в локус гена кислого сывороточного белка (Колоскова и др., 2018).
Все компоненты находились в буфере ТЕ для инъекций (10 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ EDTA, pH 7,4). Раствор центрифугировали 10 минут при 12000 об/мин. Супернатант стерилизовали с использованием 0,22 мкм фильтрующей колонки Millipore. Плазмиды pX330-g3 и pX330-g7 использовали по 2,5 нг/мкл, pWAPhLf - в концентрации 8 нг/мкл смеси. Общее содержание плазмидной ДНК составляло 13 нг/мкл рабочего раствора.
Микроинъекции осуществляли в поле видимости инвертированного микроскопа с интерференционной оптикой Номарского, оснащённом гидравлическими манипуляторами Narishige. Для удержания зигот использовали холдеры, которые подключали к микроинъекционному шприцу. Игла для микроинъекций заполнялась 2-3 мкл рабочего раствора смеси плазмидной ДНК при помощи пипетки с удлиненных носиком, после чего закреплялась в холдере. Присоска закреплялась в холдере аналогично игле и была размещена диаметрально противоположно в камере для манипуляций в поле видимости микроскопа (Мензоров и др., 2016).
Для удобства манипулирования целесообразно проводить микроинъекцию несколькими партиями по 20-30 зигот в каждой. Подготовленные к микроинъекции эмбрионы с видимыми пронуклеусами размещают в камере для микроинъекций в капле манипуляционной среды Global with Hepes® с 10% заменителем сывороточного белка под минеральным маслом и настраивают оптические системы микроскопа таким образом, чтобы отчетливо видеть пронуклеусы зигот. Затем в камеру помещают микроинструменты, перемещая их вверх и вниз до полной фокусировки кончика иглы и присоски, не меняя при этом настройку оптической системы микроскопа. После этого в присоске фиксируют эмбрион таким образом, чтобы пронуклеус находился в фокусе, и перемещением иглы осуществляют прокол блестящей оболочки, цитоплазматической мембраны и пронуклеуса.
Игла должна прокалывать блестящую оболочку и плазматическую мембрану достаточно легко. При микроинъекции в пронуклеус важно не повредить проядрышки и контролировать введение определенного объёма экзогенной ДНК, чтобы не вызвать разрыв пронуклеуса и, как следствие, - гибель эмбриона. Признаком успешной микроинъекции является увеличение объёма пронуклеуса и сохранение его целостности после излечения иглы. Микроинъецированные эмбрионы размещают в камере отдельно от эмбрионов, не прошедших микроинъекцию и при необходимости извлекают их из камеры в каплю с манипуляционной средой под слоем минерального масла. Количество микроинъецированных зигот, поставленных на культивирование, приведено в табл. 2.
Таблица 2. Влияние микроинъекции генно-инженерной конструкции на жизнеспособность мышиных эмбрионов
Количество: Микроинъециро- Развилось до стадии 2-х бластомеров Взято для трансплантации Взято для дальнейшего культивирования Развилось до стадии морулы Бласто-цисты
ванных зигот n % n % n % n % n %
187 158 84,5 49 31 109 68,9 57 52,2 48 92*
контроль (без микроинъекции)
187 37 100 - - - - - - 34 92**
Примечания: *от числа развившихся до стадии морулы; ** от числа вступивших в дробление
Микроинъецированные эмбрионы культивируют на среде Global® при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2 до стадии двух бластомеров, предварительно отмыв в трёх каплях с данной средой.
Как видно из табл. 2, число эмбрионов, развившихся до стадии двух бластомеров, составило 84,5% от количества микроинъецированных зигот. Далее эмбрионы были культивированы до стадии компактной морулы и бластоцисты.
Культивирование на коммерческой среде Global® эмбрионов мыши, микроинъецированных в пронуклеус эмбрионов и развившихся до стадии компактной морулы составило 52% от количества эмбрионов, вступивших в дробление и из них достигших стадии бластоцисты - 92%. В целом, выход бластоцист от числа микроинъецированных зигот составил 44%, что достаточно для выполнения дальнейших работ по получению геномно-редактированных животных, продуцирующих рекомбинантные белки с молоком.
Заключение
В ходе проведенных исследований выяснено, что использование коммерческих сред Global with Hepes® и Global® для культивирования зигот, не оказало значительного отрицательного воздействия на эмбрионы микроинъецированных генно-инженерной конструкцией (смесь плазмид для экспрессии компонентов CRISPR/Cas9 системы) мышей линии C57BL6/CBA, в ходе их развития от стадии морулы до бластоцисты. В целом, полученный выход бластоцист от числа микроинъецированных зигот на уровне 44% достаточен для выполнения дальнейших работ по получению геномно-редактированных животных, продуцирующих рекомбинантные белки с молоком.
ЛИТЕРАТУРА
1. Максименко О.Г., Дейкин А.В., Ходарович Ю.М., Георгиев П.Г. Использование трансгенных животных в биотехнологии: перспективы и проблемы // Acta naturae. - 2013. - Т. 5. - № 1. - C. 33-48.
2. Мензоров А.Г., Лукьянчикова В.А., Кораблев А.Н., Серова И.А., Фишман В.С. Практическое руководство по редактированию геномов системой CRISPR/Cas9 // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2016. - Т. 20. - № 6. - С. 930-944.
3. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas - инструменты открытий // Acta Naturae. - 2014. - Т. 6. - № 3. - С. 20-42.
4. Erwei Z., Yi-Jun C., Kui L. et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs // Cell Research. - 2017. - Vol. 27. - P. 933945.
5. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77. - P. 73807384.
6. Miguel A., Gama S., Rita G., Gregory A. Animal transgenesis: an overview // Brain Struct. Funct. - 2010. -Vol. 214. - P. 91-109.
7. Yang X. Applications of CRISPR-Cas9 mediated genome engineering // Military Medical Research. -2015. - Vol. 2. - P. 11. eCollection <http://www.addgene.org/42230/>
REFERENCES
1. Maksimenko O.G., Deikin A.V., Khodarovich Yu.M., Georgiev P.G. [The use of transgenic animals in biotechnology: perspectives and problems]. Acta naturae. 2013, 5(1): 33-48.
2. Menzorov A.G., Luk'yanchikova V.A., Korablev A.N., Serova I.A., Fishman V.S. [A practical guide to editing genomes by the CRISPR/Cas9 system]. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii - Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2016, 20(6): 930-944.
3. Nemudryi A.A., Valetdinova K.R., Medvedev S.P., Zakiyan S.M. [Genome editing systems TALEN and CRISPR/Cas - discovery tools]. Acta Naturae. 2014, 6(3): 20-42.
4. Erwei Z., Yi-Jun C., Kui L. et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Research. 2017, 27: 933-945.
5. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, 77: 7380-7384.
6. Miguel A., Gama S., Rita G., Gregory A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct. Funct. 2010, 214: 91-109.
7. Yang X. Applications of CRISPR-Cas9 mediated genome engineering. Military Medical Research. 2015, 2: 11. eCollection <http://www.addgene.org/42230/>
Production of mouse blastocists in culture media after microinjection into zygotic pronuclei of plasmid mixture for expressing components of CRISPR/Cas9 system
Maksimenko S.V., Trubitsina T.P., Belova N.V., Kutyin I.V., Ryabykh V.P.
Institute of Animal Physiology, Biochemistry and Nutrition, Borovsk, Kaluga oblast, Russian Federation
ABSTRACT. The aim of the study is to investigate the ability of the zygotes to develop to the blastocyst stage after microinjection into their pronuclei of a mixture of plasmids for expressing the components of CRISPR/Cas9 system and cultivation on commercial media. Cell donors were female C57BL6/CBA mice aged 6-9 weeks. As a manipulation medium, the Global with Hepes® commercial medium was used with the addition of 10% whey protein substitute, and as a culture medium - Global® with the addition of 10% whey protein substitute. As a result, data have been obtained that indicate that the media studied can be successfully used to produce blastocysts. During cultivation after microinjection, 84.5% of embryos entered the development within a day, reaching 52% before the stage of compact morula, of which up to the stage of blastocyst - 92%. It was concluded that the yield of blastocysts from the number of micro-injected zygotes at the level of 44% is sufficient to carry out further work on obtaining genomic-edited animals that produce recombinant proteins with milk.
Key words: mouse embryos, genetically engineered constructions, microinjections in pronuclei, in vitro culture
Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2018, 3: 106-110
Поступило в редакцию: 20.08.2018 Получено после доработки: 05.09.2018.
Максименко Сергей Васильевич, к.б.н., с.н.с., тел. 8(906)645-02-52; vx136@rambler.ru Трубицина Татьяна Петровна, к.б.н., с.н.с., тел. 8(906)641-15-72; trubitsina.tp@yandex.ru Белова Надежда Викторовна, м.н.с., тел. 9534682694 navikbel@mail.ru Кутьин Иван Владимирович, м.н.с., тел. (953)332-8647; kurookami@mail.ru Рябых Владимир Павлович, д.б.н., зав. лаб., тел. 8(960)515-79-60; vladimirryabykh@rambler.ru
