CC BY
79
УДК 664.834.2
Д. Ш. Ягофаров, З. А. Канарская, Э. И. Семенов, Ф. К. Алимова
ПОЛУЧЕНИЕ БИОПРОДУКТОВ ИЗ ВТОРИЧНЫХ РЕСУРСОВ ПЕРЕРАБОТКИ КАРТОФЕЛЯ
Ключевые слова: крахмал, биопродукты, мицелиальный гриб, культивирование.
Показана целесообразность биотехнологической конверсии вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля мицелиальным грибом р. Trichoderma asperellum 302 с последующим получением из этого гриба адсорбента микотоксинов и белкового кормового продукта.
Keywords: starch, bioproducts, filamentous fungi cultivation.
The expediency of biotechnological conversion of secondary resources processing of GM potato mushroom mycelial p. Trichoderma asperellum 302 with the subsequent reception of this fungus mycotoxin adsorbent and protein feedstuff.
Актуальность. При переработке картофеля в крахмал получается смесь побочных продуктов, к которым, прежде всего, следует отнести мезгу и соковую воду (разбавленный клеточный сок картофеля, фактический объем которого увеличивается в 4 - 7 раз по сравнению с количеством перешедшего в них картофеля, вследствие разбавления водой). Извлечение сухих веществ из такой смеси весьма затруднительно [1].
К сожалению, перечисленные выше побочные продукты до сих пор не находят должного применения, при этом можно выделить следующие основные направления в области возможного использования картофельной мезги [2, 3, 4, 5]:
- обогащение мезги, содержащей картофельный белок, другими азотсодержащими компонентами в производстве кормов для крупного рогатого скота;
- приготовление пектиновых или пектин -крахмальных смесей на кормовые и другие технические цели;
- биоконверсия в сахара в производстве биоэтанола и экстракция сиропа для пропитки картофельных чипсов и картофеля-фри;
- экстракция азотсодержащих компаундов из жидких фаз для удобрения;
- в качестве стабилизирующего вещества в глубоком бурении (смазывающий материал);
- питательная среда для выращивания дрожжей в производстве витамина В12;
- питательный компонент ростового субстрата в производстве биогаза;
- производство пищевых волокон.
Наибольшую трудность представляет утилизация картофельного сока, изначальная концентрация сухих веществ в котором составляет всего 4 - 5 %. Современные технологии позволяют выделять из измельченного картофеля до 80 % картофельного сока такой концентрации и практически 100 % сока с несколько меньшей концентрацией сухих веществ - около 3 %, в том числе растворимый [6].
Уровень использования клеточного сока картофеля в настоящее время составляет около 33 %. Рекомендованы следующие способы утилизации картофельного сока [3]:
- накопление и применение его для удобрения полей и сельскохозяйственных угодий;
- совместное выделение мезги и сока с последующей тепловой обработкой и использованием смеси в качестве запаренного жидкого корма;
- термообработка картофельного сока с выделением коагулируемого белка и последующим увариванием углеводно-белкового гидролизата;
- концентрирование сока вымораживанием воды, а также с применением мембранной технологии;
- анаэробная обработка картофельного сока с получением биогаза и биоводорода с последующей аэробной очисткой культуральной жидкости;
- получение корма скота [7, 8, 9].
Наблюдается тенденция использования картофельной мезги и сока в качестве питательной среды при микробиологическом синтезе кормовых белков мицелиальными грибами. Однако содержание белков в мицелиальных грибах незначительно, поэтому перспективно выделение клеточной стенки мицелиальных грибов и их применение как адсорбента микотоксинов [10]. Мицелиальные грибы содержат значительное количество хитин-глюканов, обладающих высокими адсорбционными свойствами [11]. Следует отметить, что экономическая целесообразность применения подобных адсорбентов складывается из их адсорбционных свойств и затрат на изготовления. Существенная доля затрат при изготовлении адсорбентов из клеточных стенок микроорганизмов приходится на питательную среду для культивирования микроорганизмов в промышленных условиях. Поэтому актуальным является расширение сырьевой базы для производства рассматриваемых биопрепаратов за счет использования углеводосодержащих отходов, образующихся при переработке картофеля.
Методическая часть
В работе использовался штамм гриба р. Trichoderma asperellum 302 [12, 13]. Штамм гриба р. Trichoderma asperellum 302 нетоксичен по отношению к животным. Штамм характеризуется продуцированием протеолитических,
целлюлолитических, ксиланолитических и амилолитических ферментов.
Для получения инокулята - грибы р. Trichoderma asperellum 302 выращивали на
агаризованной среде Чапека при температуре 28 °С, в течение 5 суток.
Последующее культивирование биомассы гриба р. Trichoderma asperellum 302 проводили глубинным способом на питательной среде, приготовленной на основе картофельной мезги и сока. Содержание углеводов в питательной среде варьировалось от 20 до 50 г на один литр питательной среды. Для обогащения калием и фосфором в питательную среду вводили однозамещенный фосфат калия в количестве 0,1 % от общей массы СВ питательной среды. Для обогащения азотом вводили сернокислый аммоний в количестве 0,3 % от общей массы СВ питательной среды. pH питательной среды 4,5 - 5,0.
Культивирование осуществлялось в колбах объемом 500 мл на лабораторных качалках с интенсивностью встряхивания 200 об/мин при температуре 28 °С. Продолжительность культивирования 4 суток. Биомассу гриба отделяли от культуральной среды центрифугированием.
Разделение клеточной стенки и белка проводили ферментативной обработкой биомассы гриба р. Trichoderma asperellum 302 ферментным препаратом Protex 6L. Ферментный препарат Protex 6L (изготовитель Genencor International, USA), содержит щелочную сериновую протеазу субтилизин (К.Ф. 3.4.21.62), продуцент щелочной протеазы - Bacillus licheniformis, активность 580000 DU/g, внешний вид - жидкость, цвет - светло-коричневый, рН - 5,4, содержание субтилизина в препарате 5 - 10 %.
Расход фермента 0.05 % к абсолютно сухой биомассе гриба р. Trichoderma asperellum 302. Ферментативную обработку проводили в колбе объемом 500 мл с объемом субстрата 250 мл. при концентрации биомассы 10 % на встряхивателе с режимом термостатирования 60 °С в течение 12 часов при рН 8,5.
Для определения D-глюкозамина
использовался колориметрический метод Эльсона-Моргана.
Расчет количества D-глюкозамина (АХ) определяли по разности содержания D-глюкозамина в пробах, полученных при гидролизе в 6 н (Х1) и 2 н (Х2) соляной кислоте, которые определялись по формуле:
С * V * V * 100 (1)
X
1,2
С * V1 * V3 * 100
V 2 * V 4 *
где С - количество й-глюкозамина по калибровочной кривой, мг/см3; VI - объем, взятый на гидролиз, см3; V2 - объем, взятый на очистку после нейтрализации, см3; V - объем после очистки от артефактов, см3; V4 - объем, взятый на определение Б-глюкозамина, см3; п - навеска биомассы, мг.
Расчет количества азота, принадлежащего D-глюкозамина, производили по формуле:
А = (АХ*5,6) /100,
(2)
где 5.6 - коэффициент, отражающий содержание азота в молекуле D-глюкозамина.
В основу определения адсорбционной способности in vitro, положили методику, описанную Крюковым B.C. и соавторами [14]. Адсорбцию Т-2 микотоксина проводили при концентрации его в растворе 50 мкг, соотношении микотоксин : адсорбент 1 : 1000, при рН среды 7,0 и 2,0, при температуре 37 - 39 °С, затем раствор центрифугировали, из фугата микотоксин переэкстрагировали в хлороформ трижды по 20 мл, хлороформенные экстракты объединяли и упаривали досуха на ротационном испарителе. Количественное определение остаточных количеств Т-2 микотоксина в сухом остатке проводили методом тонкослойной хроматографии с биоавтографическим завершением с
использованием культуры Candida pseudotropicalis штамм 44 ПК [15].
Результаты и обсуждение
Ниже представлена характеристика картофельной мезги и картофельного сока ГМ картофеля сорта Луговской плюс урожая 2009 года.
Характеристика картофельной мезги: Цвет серо-коричневая
Консистенция густая масса
Массовая доля углеводов, % СВ 65
Массовая доля протеина, % СВ 17
Массовая доля минеральных веществ, % СВ 13 Массовая доля клетчатки, % СВ (в сушеной мезге) 13
Крахмалистость сушеной мезги, % СВ 7,55
Содержание свободных сахаров, % СВ (в сушеной мезге) 0,55
Содержание крахмала, % СВ (в сушеной мезге) 7 Массовая доля влаги сушеной мезги, % СВ 12
Активная кислотность, pH 4,0-4,5
Характеристика картофельного сока:
Цвет темно-серый
Консистенция жидкость
Массовая доля сухих веществ, % 5
Массовая доля протеина, мг/кг 30
Массовая доля азота, мг/кг 4
Массовая доля калия, мг/кг 5
Массовая доля магния, мг/кг 300
Массовая доля фосфора, мг/кг 500
Активная кислотность, pH 4,5-5,0
Культивирование гриба р. Trichoderma asperellum 302 на питательной среде, приготовленной на основе картофельной мезги и сока, показало целесообразность использования их в составе питательной среды в соотношении 1:1 с массовой долей СВ 3,5 % : из них 65 % углеводов, 17 % протеина, 13 % минеральных веществ. Для обогащения калием и фосфором в питательную среду вводили однозамещенный фосфат калия в количестве 0,1 % от общей массы СВ питательной среды. Для обогащения азотом вводили сернокислый аммоний в количестве 0,3 % от общей
n
массы СВ питательной среды.
Установлено, что оптимальная
продолжительность культивирования гриба р. Trichoderma asperellum 302 при температуре 28 °С составляет 4 суток. В этих условиях гриб р. Trichoderma asperellum 302 продуцирует ферменты гидролазы, под действием которых увеличивается содержание простых сахаров. Затем содержание простых сахаров снижается и к концу ферментации гриб ассимилирует до 95 % углеводов, присутствующих в питательной среде. Выход биомассы гриба р. Trichoderma asperellum 302 составляет 55 %. Концентрация биомассы гриба в культуральной жидкости достигала до 20 г/л.
Содержание белка в биомассе составляло 25 %. Биомасса гриба р. Trichoderma asperellum 302 отделялась от культуральной жидкости и обрабатывалась ферментом PROTEX 6L для гидролиза белков. Затем гидролизованные белки и клеточная стенка мицелиального гриба разделялись центрифугированием. Данная обработка позволяла придать высокое адсорбционное свойство клеточных стенок по отношению к Т-2 микотоксину.
Ниже в таблице 1 представлены результаты исследований, отражающие взаимосвязь адсорбционных свойств клеточных стенок мицелиального гриба р. Trichoderma asperellum 302 по отношению к Т-2 микотоксину от содержания белка.
Анализ представленных результатов позволяет сделать вывод о том, что адсорбция Т-2 микотоксина клеточными стенками мицелиального гриба р. Trichoderma asperellum 302 находится во взаимосвязи с содержанием в них белка. В общем случае снижение содержания белка в клеточной стенке гриба приводит к увеличению эффективности адсорбции Т-2 микотоксина. Высокая эффективность адсорбции Т-2 микотоксина клеточной стенки гриба можно объяснить присутствием в ней хитин-глюканового комплекса [11].
Таблица 1 - Адсорбционные свойства клеточных стенок гриба р. Trichoderma asperellum 302
Проведенные выше исследования взяты за основу при разработки технологии адсорбента микотоксинов и белковой кормовой добавки из биомассы гриба р. Trichoderma а8ргге11ыт 302,
культивируемой на питательной среде, полученной из картофельной мезги и сока, образующихся при выделении крахмала из ГМ картофеля.
Выбранные параметры процесса и оборудование для его проведения позволяют изготовить адсорбент микотоксинов из клеточной стенки гриба р. Trichoderma а8реге1Ыт 302 с выходом адсорбента 60 - 65 % от сухой биомассы гриба. Характеристика полученного адсорбента микотоксинов представлена в таблице 2.
Другим преимуществом разработанной технологии является получение белковой кормовой добавки из экстракта, свойства которой представлены ниже в таблице 3. Кормовая ценность данного продукта повышается присутствием в ней ферментов гидролаз, которые продуцировались грибом р. Trichoderma asperellum 302 при ферментации [4, 5, 7, 16]. Выход белковой кормовой добавки от биомассы гриба р. Trichoderma asperellum 302 составил 20 - 25 %.
Таблица 3 - Характеристика белковой кормовой добавки
Наименование показателя Норма
Внешний вид Порошок
Цвет От светло-желтого до коричневого
Массовая доля сырого протеина, %, не более 55,0
Массовая доля белка по Барнштейну, %, не менее 50,0
Насыпная масса, г/см3, не менее 0,6
Массовая доля влаги, %, не более 10,0
Таблица 2 - Характеристика адсорбента микотоксинов
Наименование показателя Норма
Массовая доля сырого протеина, %, не более 10,0
Массовая доля белка по Барнштейну, %, не более 8,5
Насыпная масса, г/см3, не менее 0,7
Массовая доля влаги, %, не более 10,0
Адсорбция Т-2 микотоксина, %, не менее 72,0
Содержание белка Содержание ДТА* Адсорбция Т-2 мико- токсина, % Десорбция Т-2 мико-токсина, % Истинная адсорбция, %
pH 7 pH2 pH 8 pH 2
16,80 19,50 52,00 61,36 5.93 55,43
5,18 26,10 70,72 76,96 10,05 66,91
8,22 27,30 76,96 76,96 4,14 72,82
10,33 20,80 70,72 70,72 10,94 59,78
* ДТА - D-глюкозамин
Полученный адсорбент микотоксинов протестирован на лабораторных животных в ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». Проверена эффективность действия адсорбента при остром Т-2 микотоксикозе, а также в условиях поедания крысами корма, естественно контаминированного Т-2 микотоксином. Исследования показали, что адсорбент микотоксинов пригоден к применению в эфферентной терапии профилактики
микотоксикозов.
Литература
1. Whistler R.L., Be Miller J.N. Starch chemistry and technology. 3rd Ed. New York: Academic Press. 894 p. (2009).
2. MayerF. Potato pulp: Properties, physical modification and applications// Polymer Degrad Stab 59. p 231-235. (1998).
3. Официальный сайт Международного института крахмала. Дания [Электронный ресурс] // Режим доступа: http://www.starch.dk
4. Scheper T. Enzymatic hydrolysis and peptide mapping of potato pulp protein: Авт. докт. дис., Ганновер. 97 c. (2006).
5. Stevens C. A., Gregory K.F. Production of Microbial Biomass Protein from potato processing wastes by Cephalosporium eichhorniae //Applied and environmental microbiology. v. 53. № 2. p. 284-291. (1987).
6. Singh J., Kaur L., McCarthy O. Potato starch and its modification // Advances in Potato Chemistry and Technology. Academic Press. Inc. p.273-312. (2009).
7. Xue L., Li P., Zhang R., Piao X., Han R., Wang D. Use of Fermented Potato Pulp in Diets Fed to Lactating Sows// Journal of Animal and Veterinary Advances.v. 10 (15). p. 2032-2037. (2011).
8. Chong M.-L. Biohydrogen production from biomass and industrial wastes by dark fermentation// International Journal of Hydrogen energy. 34. p. 3277-3287. (2009).
9. Kapdan I. K., Kargi F. Bio-hydrogen production from
waste materials// Enzyme and Microbial technology. 38. p. 569-582. (2006).
10 Ахмадышин Р.А., Канарский А.В., Канарская З.А. Микотоксины - контаминанты кормов. Вестник Казан. технол. ун. №2. С. 88 - 102. (2007).
11. Ахмадышин Р.А., Канарский А.В., Тремасов М.Я., Канарская З.А. Эффективность адсорбции микотоксинов. Комбикорма. № 4. С. 64 - 65. (2006).
12. Алимова Ф.К., Скворцов Е.В., Мельникова Т.А., Шишкин А.В., Тазетдинова Д.И., Тухбатова Р.И. Использование гриба p.Trichoderma в процессе переработки послеспиртовой барды. Биотехнология. № 4. с. 78 - 81. (2009).
13. Алимова Ф.К., Скворцов Е.В., Мельникова Т.А., Тухбатова Р.И., Тазетдинова Д.И. Использование гриба р. Trichoderma в процессе переработки отходов спиртового производства. Вестник биотехнологии. № 3. с. 22-26. (2007).
14. Крюков B.C., Крупин В.В., Котик А.Н. Применение клиноптилолита для профилактики микотоксикозов. Ветеринария. № 9-12. С. 28 - 29. (1992).
15. Антонова Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические. М.: «Агропромиздат». 287 с. (1991).
16. Скворцов Е.В., Морозова Ю.А., Пушик А.В., Алимова Ф.К., Гаврилов С.В. Вестник Казан. технол. ун. Т. 17. № 9. С. 201 - 204. (2014).
© Д. Ш. Ягофаров - канд. тех наук, доц. каф. ПИМП КНИТУ, [email protected]; З. А. Канарская - канд. тех наук, доц. каф. Пищевой биотехнологии КНИТУ, [email protected]; Э. И. Семенов - зав. лабораторией микотоксинов, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», [email protected]; Ф. К. Алимова - докт. биол. наук, Казанский федеральный университет, заведующая кафедрой биохимии.
© D. Sh. Yagofarov - Ph.D, Associate Professor, KNITU, [email protected]; Z. A. Kanarskaya - Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnology, KNITU, [email protected]; E. I. Semenov - Head. laboratory mycotoxins FGBI "FTSTRB-VNIVI", [email protected]; F. K. Alimova - Doctor. biol. Sciences, Kazan Federal University, Head of the Department of Biochemistry.
