CC BY
249. Sharp poisonings with fosfororganichesky connections: the main clinical syndromes and mechanisms of their formation / O.A. Harchenko, G.M. Balan, N.N. Bubalo - the Text: direct//Modern problems of toxicology. - 2013. - No. 1-2. - Page 17-31.
УДК 619:616.98:578.824.11 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-5-26-33
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА МЕТОДОМ ТРЁХФАЗНОЙ ЭКСТРАКЦИИ
Ахмадеев Р.М. - кандидат ветеринарных наук, Мухамеджанова А.Г., Мифтахов Н.Р. -
кандидат биологических наук, Насыров Ш.М. - кандидат ветеринарных наук, Самерханов И.И. -кандидат биологических наук, Алеева З.З., Арутюнян Г.С., Яруллина Г.М.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, Казань, Научный городок-2, е-шаИ: vnivi@mail.ru)
Представлены результаты изыскания альтернативного способа выделения антигена вируса бешенства, основанного на методе трёхфазной экстракции исходной суспензии и озвучивания на диспергаторе, а также оценки иммунохимических свойств полученного продукта. Исходный вируссодержащий материал органно-тканевого происхождения подвергали экстрагированию путём последовательной обработки насыщенным раствором сульфата аммония (НСА) и бутанола. В целях более полной дезинтеграции экстрагированную взвесь подвергали озвучиванию на ультразвуковом диспергаторе УЗДН - 2Т, после чего антигенные образцы обрабатывали 96% этанолом в разных пропорциях. Антигенные свойства полученных фракций оценивали методами аналитического disc-электрофореза, вестерн - блоттинга и «сэндвич» - ИФА. Показано, что применение ультразвуковой обработки экстрагированной взвеси вируссодержащего материала и последующая обработка 96% этанолом в соотношении 1:1 позволяет более эффективно избавляться от балластных веществ и субвирусных компонентов. Полученный антигенный продукт является мономерным, содержит одну превалирующую белковую фракцию массой 67,2 кДа, что соответствует О-белку вируса бешенства, а также имеет титр в «сэндвич» - ИФА 1:40960. Данные характеристики подтверждают высокую диагностическую эффективность данного антигена и его пригодность для комплектации экспресс-тест-систем на основе ИФА. Описанный способ выделения антигена при помощи химических веществ и ультразвуковой обработки можно рассматривать в качестве доступной и экономичной альтернативы рассматриваемому ранее зональному ультрацентрифугированию в градиентах плотности.
Ключевые слова: гликопротеин вируса бешенства, иммуноферментный анализ, конструирование диагностикумов.
Ввиду того, что сложившаяся мест среди особо опасных инфекций [4,
эпизоотолого - эпидемиологическая 10]. В настоящее время одним из ключевых
ситуация по бешенству в мире не имеет звеньев существующей тактики пре-
тенденции к разрешению, бешенство по- дупреждения распространения инфекции
прежнему, согласно оценкам ВОЗ, является диагностика заболевания,
продолжает занимать одно из ведущих основанная на методах индикации
рабического антигена [3, 7]. Современные достижения биотехнологии позволяют совершенствовать методы иммуноанализа путём
комплектации различных диагности -кумов высокоспецифичными антигенными препаратами [1].
В контексте вышеизложенного объектом особого внимания являются вирусоподобные частицы (УЬР), содержащие гликопротеины (О-белки) вируса бешенства, являющиеся наиболее мощными видоспецифичными иммуно-генами [8], что позволяет рассматривать его как наиболее перспективный иммунореагент для конструирования диагностических тест-систем и использования в иммуногенных компо-зициях [6, 11]. Основными требованиями, предъявляемыми к рабическим антигенам как к компонентам диагностикумов, является отсутствие балластных субвирусных компонентов, что позволяет минимизировать проявление неспецифических реакций [2].
В отечественной и зарубежной литературе описаны способы получения очищенных рабических антигенов, основанные на различных методах дезинтеграции вирусных частиц, наиболее распространённым среди которых является зональное центрифугирование в градиентах плотности [5, 9], однако поиск доступных и экономичных альтернатив технологии выделения мономерного антигенного препарата является попрежнему акту -альным.
Известно, что получение высоко-очищенного антигенного препарата возможно только при повторном суспенди-ровании первичных осадков и их переосаждении. Оптимальной альтернативой ранее описанному модифицированному способу ультрацентрифугирования [5] является химический метод очистки, который способен обеспечить более полную седиментацию вирусных частиц, имеющих наименьшую плотность.
Целью работы явилось изыскание альтернативного способа выделения антигена вируса бешенства, основанного ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИ
на методе трёхфазной экстракции исходной суспензии и озвучивания на диспергаторе, а также оценка иммунохимических свойств полученного продукта.
Материал и методы. Исходным вируссодержащим материалом (ВСМ) послужил полученный предварительным низкоскоростным центрифугированием при 5000g в течение 50 мин и высокоско -ростным центрифугированием при (37000g) в течение 4 часов, выделением осадка с концентрацией белка 21,314 ± 0,76 мг/мл, из 20% мозговой суспензии на 0,01 М PBS 2-месячного ягнёнка, заражённого интрацеребрально вирусом бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ (5,25 ^ТЦИД50), с последующей обработкой этанолом и получением конечного продукта - высокоочищенного антира-бического антигена. Для создания экстракционной системы полученные осадки ресуспендировали в растворе НСА (pH 5,4) и бутаноле в соотношении 1:4:4, после чего подвергали инкубации при температуре + 4°С в течение 30 мин и низкоскоростному центрифугированию (5000 g) при температуре + 4 - 10°С в течение 50 мин.
Экстрагированную взвесь, представляющую наибольший интерес относительно концентрации преципити-рованных антигенов, отбирали путём последовательного удаления жидких фаз и ресуспендировали в 0,02 М трис-HCl буферном растворе в соотношении 1:4, после чего вновь подвергали низкоскоростному центрифугированию.
В целях более интенсивного разрушения остатков клеточного дебриса и высвобождения вирионов применяли метод трёхкратного озвучивания материала на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т (НПП «УкрРосПрибор», Россия) в следующем режиме: продол -жительность озвучивания - 40 с, интервал между обработками - 60 с, частота колебаний - 95 кГц.
После каждого цикла озвучивания обработанную суспензию подвергали центрифугированию при 5000 g при температуре + 4-10°С в течение 50
минут; осадки ресуспендировали и подвергали повторному озвучиванию. Для избавления конечных супер-натантов от метаболитов и иных низкомолекулярных соединений прибегали к осаждению белков из ВСМ посредством добавления к образцам охлаждённого 96% этанола в соотно-шении 1:0,5, 1:1, 1:2 и инкубации в течение 30 минут при -20°С. Осадок отделяли центрифугированием при 13000 g в течение 15 минут. Концентрацию белка в исследуемых образцах антигенсодержащего материала изме -ряли на спектрофотометре UV-5 («MettlerToledo») при длине волны 280 нм.
Определение молекулярных масс превалирующих белковых фракций, содержащихся в образцах, производили методом аналитического disc-электро-фореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу U. K. Laemmli [9]; для ранжирования использовали набор маркеров «BroadRange» («Bio-Rad»). Результаты электрофореза фиксировали при помощи системы гель документирования «GelDocXR+» («Bio-Rad») с использованием программы «ImageLabSoftware 6.0».
Серологическую активность антигенного материала определяли методом вестернблоттинга с использованием гипериммунных овечьих сывороток, а также методом непрямого иммунофер-ментного анализа (нИФА) посредством «Набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань). Инструментальный учёт результатов реакции производился фотометрически при длине волны 490 нм («Model 680 MicroplateReader», «Bio-Rad»). Критерием отбора диагностически значимых антигенных фракций являлся коэффициент ингибирования (Кинг), рассчитываемый как отношение показателя оптической плотности (ОП490) положительного
контрольного образца к показателю ОП49о опытного образца.
Статистический анализ
проводили с использованием пакета программ «^а^ка 6.0». Для выявления ста-тистической значимости различий результатов использовали 1-критерий Стьюдента; различия счита-лись достоверными при р<0,05.
Результаты исследований. На первом этапе исследований отобранные нами антигенные фракции были исследованы электрофоретически с целью установления диапазона локализации превалирующих полипептидных фракций. Наибольшая серологическая актив -ность группами белков с моле -кулярными массами 60,0-67,2 кДа и 50,0-55,0 кДа; дополнительная актив -ность прослеживалась в зоне 28,0-30,0 кДа. Последняя белковая группа присутствовала в образцах ВСМ, отобранных после первого и второго циклов озвучивания, однако белковый профиль ВСМ после третьего цикла озвучивания был представлен основным диапазоном 65,0-67,0 кДа, соответствующим молекулярной массе G-белка ВБ, и дополнительным - 53,0-55,0 кДа (рис. 1).
Также было установлено, что на данном этапе очистки на денситограмме регистрировалось порядка 15 - 1 7 пиков минорных фракций, однако их содержание в общем объёме образца не укладывалось в диапазон статис -тической значимости, что подтверждает значительную эффективность приме -нения озвучивания для очистки ВСМ от балластных веществ.
На следующем этапе исследования после повторного осаждения белков нами для сравнительного анализа были отобраны 5 основных антигенных фракций в зависимости от обработки различными объёмными долями (У) этанола. Их антигенная активность была подтверждена в «сэндвич» - ИФА (табл. 1).
Рисунок 1 - Белковый профиль вируссодержащего материала, полученного после трёхкратного озвучивания на УЗДН-2Т.
Таблица 1 - Специфичность антигенных фракций вируса бешенства, полученных методом трёхфазной экстракции с последующим озвучиванием на диспергаторе
Наименование образца Концентрация белка, мг/мл Титр антигена в ИФА, 1/n*
Супернатант мозговой суспензии, III озвучивание на УЗДН-2Т 2,387 ± 0,131 10240
Фракция АГ № 1, 0,25 V этанола 1,008 ± 0,056 20480
Фракция АГ № 2, 0,5 V этанола 1,046 ± 0,033 20480
Фракция АГ № 3, 1 V этанола 0,924 ± 0,049 40960
Фракция АГ № 4, 2 V этанола 0,485 ± 0,021 10240
Примечание:
V- объем этанола используемого при выделении и очистке антигенных фракций вируса бешенства;
* - указаны обратные значения титров антигенов.
Из таблицы видно, что наибольшую активность в «сэндвич» - ИФА проявила мономерная фракция, осаждённая этанолом: показатель её ОП с гипериммунной кроличьей сывороткой (коллекция ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») составил 1,687 ± 0,047 ОЕ, что превышает таковой исходной фракции, содержащей дополнительные минорные полипептиды, в 1,53 раза (р < 0,05); титр антигенной фракции составил 1:40960.
Для выявления истинно серопо-зитивных образцов среди антигенных фракций, отобранных нами на разных
этапах технологического процесса, они были исследованы методом вестерн-блоттинга (рис. 2).
Таким образом, результаты вестерн-блоттинга с гипериммунной кроличьей сывороткой подтверждают серологическую активность антигенной фракции, подвергнутой трёхкратному озвучиванию и осаждённой этанолом (трек 2).
Очевидно, что переосаждение позволило получить высокоочищенный мономерный продукт, содержащий единственную полипептидную фракцию молекулярной массой 67,2 кДа (рис. 3).
Рисунок 2 - Результаты иммуноблотаантигенных фракций вируса бешенства. Треки: 2 -фракция, полученная после переосаждения 1 V этанола; 7 - вакцина «NobivacRabies»; 8, 9 -фракции, полученные после переосаждения 1 V НСА; М - маркер молекулярных масс BroadRange («Bio-Rad»).
Рисунок 3 - Белковый профиль антигенной фракции, полученной путём трёхкратного озвучивания на УЗДН-2Т и последующего осаждения этанолом (1:1).
Также значительную активность в иммуноблоте проявила антиген вируса бешенства (АГ ВБ), переосаждён-ная НСА (1:1): молекулярная масса её мажорных полипептидов также варьируется в пределах 64,9-67,3 кДа, однако она сохраняет минорные фракции в зоне 54,059,4 кДа.
Исследование фракций АГ ВБ, переосаждённых этанолом либо НСА в соотношениях 1:0,25 - 1:0,5 не принесло удовлетворительных результатов, так как данные образцы при электрофоретическом анализе демонстрировали наличие значительного количества минорных ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИ
фракций. Антигенные фракции,
полученные при осаждении двойным объёмом этанола либо НСА, не проявляли должной активности в ИФА.
В результате проведённой серии экспериментов нами был разработан способ получения АГ ВБ, основанный на трёхфазном экстрагировании исходной 20% мозговой суспензии и переосаждении выделяемых фракций.
Полиметодическое исследование промежуточных антигенных фракций позволило получить представление о приоритетных структурах, определяющих антигенность препарата, и установить )В ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
порядок элиминации балластных веществ. Нами было установлено, что трёхкратное озвучивание ВСМ на ультразвуковом диспергаторе позволяет существенно сократить содержание остатков клеточного дебриса на этапе первичной обработки, и конечный супернатант, титр которого в ИФА составил 1:10240, содержит мажорные полипептидные фракции с молекулярными массами 65,0 - 67,0 кДа и 53,0 - 55,0 кДа, соответствующими таковым белков G и N вируса бешенства. Дальнейшее осаждение данной фракции этанолом и НСА позволило избавиться от побочного полипептида и добиться выхода очищенного мономерного препарата, содержащего единственную белковую
фракцию молекулярной массой 67,2 кДа. Показано, что конечный антигенсо-держащий материал с концентрацией белка 0,924 ± 0,049 мг/мл и рабочим титром в ИФА 1:40960 удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к производственному компоненту экспресс - тест -систем на основе ИФА.
Заключение. Всё вышеизложенное определяет последовательность стадий технологического процесса для получения высокоспецифичного антигена вируса бешенства в промышленных объёмах и использования его для производства компонентов экспресс - тест - системы ИФА, а также в качестве иммуногена для получения антирабического глобулина для МФА.
Литература
1. Результаты испытания «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом иммуноферментного анализа / В. В. Евстифеев - Текст: непосредственный // Учёные записки Казанской государственной ветеринарной академии имени Н. Э. Баумана. - 2015. - № 1. - С. 71-73.
2. Выделение, очистка и оценка серологической активности антигенных компонентов вируса бешенства / М. А. Ефимова, К. С. Хаертынов, А. Ф. Арсланова и др. - Текст: непосредственный // Проблемы особо опасных инфекций. - 2017. - № 4. - С. 27-31.
3. Оценка пригодности выделенных антирабических глобулинов для методов лабораторной диагностики: ИФА и МФА / М. А. Ефимова, А. Г. Мухамеджанова, А. Н. Чернов и др. - Текст: непосредственный // Ветеринарный врач. - 2018. - № 4. - С. 3-7.
4. Современные проблемы вакцинопрофилактики бешенства / А. А. Мовсесянц, Ю. В. Олефир - Текст: непосредственный // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2019. - № 19 (1). - С. 10-16.
5. Мухамеджанова, А. Г. Совершенствование способов получения высокоочищенного антигена вируса бешенства для экспресс-тест-систем на основе ИФА и МФА: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Мухамеджанова Антонина Глебовна - Казань, 2020. - 24 с.
6. Рахманин, П. В. Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Рахманин Петр Владимирович - Щёлково, 2009. - 29 с.
7. Патент RU 2575800C2 Российская Федерация Вирусоподобные частицы (VLP) из гликопротеина вируса бешенства: опубл. 20.02.2016 / Смит Г., Лю Е. - 2с - Текст: непосредственный. .
8. Выделение гликопротеида из фиксированного штамма вируса бешенства штамма «Москва 3253» и конструирование на его основе диагностикума для дот-иммуноанализа / Н. А. Шарапова, М. Н. Киреев, Е. Г. Абрамова и др. - Текст: непосредственный // ActaBiomedica Scientifica. - 2012. - № 5 (1). - С. 347-350.
9. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli - Text: direct // Nature. - 1970. - № 227 (5259). - P. 680-685.
10. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review / R. Singh, K. P. Singh, S. Cherian et al. - Text: direct // Veterinary Quarterly. - 2017. - № 37(1). - P. 212-251.
11. Zhao, R. Novel strategy for expression and characterization of rabies virus glycoprotein / R. Zhao, Y. Shan, M. et al. - Text: direct // Protein expression and purification. - 2020. -168:105567.
OBTAINING RABIES VIRUS ANTIGEN BY THREE-PHASE EXTRACTION
Akhmadeev R. M. - Candidate of Veterinary Sciences, Mukhamedzhanova A.G., Miftakhov N. R. -Candidate of Biological Sciences; Nasyrov Sh. M. - Candidate of Veterinary Sciences; Samerkhanov I. I. - Candidate of Biological Sciences; Aleeva Z. Z. , Arutunjan G. S., Yarullina G. M.
FSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety» (420075, Kazan, Nauchny gorodok-2, e-mail: vnivi@mail.ru)
Results of research of an alternative way of release of antigen of a virus of the rage based on a method of three-phase extraction of initial suspension and scoring on a dispergator and also estimates of immunochemical properties of the received product are presented. Initial virussoderzhashchy material of organ and fabric origin was subjected to extraction by serial processing by saturated solution of sulfate of ammonium (NSA) and a butanol. For fuller disintegration the extracted suspension was subjected to scoring on an ultrasonic dispergator of UZDN - 2T then anti-gene samples processed 96% ethanol in different proportions. Anti-gene properties of the received fractions estimated by methods of an analytical disk-electrophoresis, a western - a blotting and "sandwich" - IFA. It is shown that application of ultrasonic processing of the extracted suspension of virussoderzhashchy material and further processing of 96% ethanol in the ratio 1:1 allows to get rid of ballast substances and subvirus components more effectively. The received anti-gene product is monomeric, supports one prevailing proteinaceous fraction weighing 67.2 kd that corresponds to G-protein of a virus of rage and also has a caption in "sandwich " - IFA 1:40960. These characteristics confirm high diagnostic efficiency of this antigen and its suitability for a complete set of express test systems on the basis of IFA. The described way of release of antigen by means of chemicals and ultrasonic processing can be considered as an available and economic alternative to the considered earlier zone ultracentrifugation in density gradients.
Keywords: rage virus glycoprotein, immunofermental analysis, designing of diagnostikum. References
1. Results of test "A set of medicines for diagnosis of clamidiosis of pigs by method of the immunofermental analysis / V.V. Evstifeev - the Text: direct//Scientific notes of the Kazan state veterinary academy of N.E. Bauman. - 2015. - No. 1. - Page 71-73.
2. Allocation, cleaning and assessment of serological activity of anti-gene components of a virus of rage / M.A. Yefimova, K.S. Hayertynov, A.F. Arslanova, etc. - the Text: direct//Problems of especially dangerous infections. - 2017. - No. 4. - Page 27-31.
3. Assessment of suitability of the globulins emitted the antirabicheskikh for methods of laboratory diagnostics: IFA and MFA / M.A. Yefimova, A.G. Mukhamedzhanova, A.N. Chernov, etc. - the Text: direct//Veterinarian. - 2018. - No. 4. - Page 3-7.
4. Modern problems of vaccinal prevention of rage / A.A. Movsesyants, Yu.V. Olefir - the Text: direct//Biological products. Prevention, diagnostics, treatment. - 2019. - No. 19 (1). - Page 10 -16.
5. Mukhamedzhanova, A. G. Improvement of ways of receiving high cleaning antigen of a virus of rage for express test systems on the basis of IFA and MFA: the abstract of the thesis for a
degree of the candidate of veterinary sciences / Mukhamedzhanova Antonina Glebovna - Kazan, 2020. - 24 pages.
6. Rakhmanin, P. V. An immunofermental test system for determination of level the antirabicheskikh of antibodies in serums of blood of the cats imparted against rage and dogs: the abstract of the thesis for a degree of the candidate of veterinary sciences / Rakhmanin Pyotr Vladimirovich - Shchyolkovo, 2009. - 29 pages.
7. RU2575800C2 patent the Russian Federation Virus-like particles (VLP) from a rage virus glycoprotein: опубл. 20.02.2016/Smith G., Liu E. - 2s - the Text: direct.
8. Allocation of a glikoproteid from the fixed strain rage virus strain "Moscow 3253" and designing on its basis of a diagnostikum for a pillbox immunoanalysis / N.A. Sharapova, M.N. Kireev, E.G. Abramova, etc. - the Text: direct//ActaBiomedica Scientifica. - 2012. - No. 5 (1). -Page 347-350.
9. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli - Text: direct // Nature. - 1970. - № 227 (5259). - P. 680-685.
10. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review / R. Singh, K. P. Singh, S. Cherian et al. - Text: direct // Veterinary Quarterly. - 2017. - № 37(1). - P. 212-251.
11. Zhao, R. Novel strategy for expression and characterization of rabies virus glycoprotein /R. Zhao, Y. Shan, M. et al. - Text: direct // Protein expression and purification. - 2020. -168:105567.
УДК 616.918.51-085.37 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-5-33-39
ДИНАМИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ, ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
Иванова С.В. - кандидат биологических наук, Мельникова Л.А. - кандидат ветеринарных наук, Родионов А.П.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2, e-mail: vnivi@mail.ru)
Ведущая роль в элиминации инфекционных агентов из организма, таких как возбудитель сибирской язвы, принадлежит клеткам с фагоцитарными свойствами, иммуноглобулинам и белкам системы комплемента. В работе представлены материалы изучения динамики функциональной активности фагоцитов животных, вакцинированных против сибирской язвы. Функциональную активность фагоцитарных клеток оценивали по фагоцитарной активности лейкоцитов. Фагоцитарную активность (ФА) определяли при расчете отношения фагоцитирующих нейтрофилов к общему числу выявленных и их поглотительную способность по фагоцитарному индексу (ФИ) - числу микробных клеток в пересчете на один активный нейтрофил. В процессе исследования наблюдали увеличение значений фагоцитарной активности и фагоцитарного индекса, которые достигали своих максимальных значений на 14 сутки после иммунизации, что свидетельствует об активации факторов естественной резистентности организма. Высокие значения исследуемых показателей отмечали до 150 суток после введения вакцины. В дальнейшие сроки
