CC BY
60УДК 616.98:578.824.11/-036.1-078.33
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИРУСА БЕШЕНСТВА ВЫДЕЛЕННОГО ОТ ЧЕЛОВЕКА
И.И.Самерханов - соискатель, мл.научный сотрудник.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420074, г.Казань, Научный городок, 2, тел.(843)239-53-37, e-mail: vnivi@mail.ru).
Среди зооантропонозных болезней бешенство занимает особое место из-за всеобщей восприимчивости к нему теплокровных животных и абсолютной летальности человека. При планировании профилактических мероприятий, разработке антирабических препаратов необходимо учитывать биологические свойства штаммов возбудителя бешенства циркулирующих на территории региона. В связи с этим, целью исследований явилось изучить биологические свойства вируса бешенства, выделенного от человека в сравнении с вирусами 1,2,4, 5 и 6 генотипов. Материалы и методы. Обнаружение и идентификацию антигена рабического вируса проводили методами иммуноферментного анализа (ИФА), иммунофлуоресценции (ИФ), реакции нейтрализации (РН) с применением диагностических препаратов, разработанных в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань. Выделение и определение инфекционной активности вируса бешенства проводили на белых мышах. Анализ последовательности нуклеотидов фрагмента гена G вируса бешенства проводили методом ОТ-ПЦР. Результаты исследований. Гидрофобия у больного Г., укушенного бродячей собакой на о.Гоа в Индии, установлена при жизни пострадавшего обнаружением специфического антигена вируса бешенства в отпечатках с роговицы глаза по МФА, слюне по ИФА, а также генома вируса бешенства в слюне и слезной жидкости в ОТ-ПЦР и подтверждена пост-мортально - в различных отделах головного мозга по МФА, ИФА, а также выделением возбудителя биопробой на белых мышах. В результате сравнительного анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена G вируса бешенства размером 238 н.о. установили незначительное отличие изучаемого изолята от RABVAY956319, составляющее 1,68%. Заключение. Результаты прижизненной диагностики больного гидрофобией подтверждены постмортально при исследовании различных отделов головного мозга по МФА, методом ИФА и биопробой. Результаты анализа последовательности нуклеотидов фрагмента гена G вируса бешенства показали, что выделенный вирус относится к первому серотипу.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гидрофобия; метод флюоресцирующих антител; иммуноферментный анализ; реакция нейтрализации; полимеразная цепная реакция.
В настоящее время на территории Российской Федерации сохраняется неблагополучная обстановка по бешенству, во многих регионах периодически отмечается активизация природных очагов бешенства, ежегодно регистрируются случаи гидро-фобии[1, 2, 3].
По данным ВОЗ, несмотря на то, что в мире ежегодно вакцинируется более 5 млн. человек против бешенства, регистрируется около 50 тысяч случаев гибели людей от этой болезни. Общепринятые меры борьбы с бешенством (упорядочение содержания собак, проведение их профилактической вакцинации) оказались недостаточными, поэтому сложность и опасность современной эпизоотической обстановки в РФ подтверждается ростом заболеваемости не только диких хищников, но и собак, кошек. В Российской Федерации за период с 2008 по 2012 годы зарегистрировано 61 летальных исходов заболеваний людей гидрофобией (бешенством). Более 86% всех заболеваний людей этой инфекцией приходится на субъекты Центрального, Южного, Северо-Кавказского и Приволжского федеральных округов Российской Федерации. В 2013 году зарегистрировано 6 случаев заболевания, в 2014 году - 3 случая. За медицинской помощью в
связи с нападением животных каждый год обращается от 250 до 450 тысяч человек. Более 200 тыс. человек получают назначения на проведение курса антираби-ческого лечения [4, 5, 6, 7].
В Республике Татарстан (РТ) эпизоотическая обстановка по бешенству также остается напряженной. За последние 15 лет за медицинской помощью обратились 11 990 - 16 065 человек, 2002 году и в 2014 году зарегистрировано два случая гидрофобии. При анализе случаев бешенства установлено, что основными причинами заболеваний людей гидрофобией, является укус бешенными животными, также несвоевременное обращение пострадавших за медицинской помощью, нарушение схемы иммунизации, отказ от назначенного курса вакцинации. Нарушение режима труда и отдыха в период проведения антирабических прививок. Факты не обращения людей за антирабиче-ской помощью даже при опасной локализации укусов свидетельствует о недостаточной санитарно-просве-тительской работе среди населения [6].
При планировании профилактических мероприятий, разработке антирабических препаратов необходимо учитывать биологические свойства штаммов возбудителя бешенства циркулирующих на террито-
рии региона. Учитывая изложенное целью исследований являлось изучить биологические свойства вируса бешенства, выделенного от человека в сравнении с вирусами 1, 2, 4, 5 и 6 генотипов.
Материалы и методы. В исследованиях использовали прижизненный клинический материал: слюну, слезную жидкость, отпечатки с роговицы и патологический материал: различные отделы головного мозга, слюнные железы умершего Г. от гидрофобии, укушенного бродячей собакой на о. Гоа в Индии.
Обнаружение и идентификацию антигена раби-ческого вируса проводили методами иммунофер-ментного анализа (ИФА), иммунофлуоресценции (ИФ), реакции нейтрализации (РН) с применением диагностических препаратов, разработанных в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань. Выделение и определение инфекционной активности вируса бешенства проводили на белых мышах.
ОТ-ПЦР проводили с помощью Thermo Scientific Maxima Reverse (Ferments) используя маркер молекулярного веса 100 - 3000 п.о. и набора Big Dye Terminator Cycle Sequencingkit (Applied Biosistems, США). Результаты ПЦР анализировали с помощью пакетов программ Bio Edit и программы Seq Man. Для сравнительного анализа использовали нукле-отидные последовательности гена G штаммов вируса бешенства 1, 2, 4, 5, 6-го генотипов из базы данных GenBank.
Результаты исследований. Ретроспективным эпидемиологическим анализом установлено, что в 2013 году в РТ зарегистрирован случай гидрофобии. В частности, гражданин Г. находясь в Индии на о. Гоа, был укушен бездомной собакой в правую нижнею конечность в области икроножных мышц. Пострадавший за антира-бической помощью не обратился и на 9-е сут болезни с признаками гидрофобии поступил в Республиканскую клиническую инфекционную больницу. Инкубационный период у заболевшего составило 55 дней, на 18-е сут болезни наступила смерть больного [8].
В отпечатках с роговицы глаза методом МФА, в пробах слюны больного методом ИФА выявлен антиген вируса бешенства, методом гнездовой ОТ-ПЦР в пробах слюны и слезы пациента определили геном вируса бешенства. В результате проведенных лабораторных исследований прижизненно был поставлен диагноз гидрофобии [1, 2, 3].
Постмортальный анализ различных отделов головного мозга методом МФА (рис.1), ИФА и гнездовой ОТ-ПЦР дал положительный результат по обнаружению специфического антигена вируса бешенства.
Возбудитель бешенства был выделен биопробой на белых мышах. Выделенный изолят вызывал заболевания белых мышей с летальным исходом как при интроцеребральном, так и при подкожном способах заражения. Продолжительность видимых проявлений болезни (взъерошенность шерсти, горбатость спины, тремор при поднятии на воздух пинцетом за кончик
хвоста, нарушение координации движении задних конечностей, паралич), составляла менее суток. Инфекционная активность на белых мышах составила 3,4 1д, Ш50/0,03 мл.
Рис.1. Постмортальное обнаружение антигена вируса бешенства в отпечатке головного мозга
у пациента Г. методом флюоресцирующих антител.
Молекулярно-генетическими исследованием был выделен фрагмент гена в вируса бешенства, полученный из патологического материала Г., который сравнивали со штаммами различных генотипов: 1-й генотип -ЯДВЧ БДЭВ19; 2-й генотип 0406БЕИ; 4-й генотип 86132БД; 94286БД; 5-й генотип 03002РЯД, 8918РЯД, Ш-1; 6-й генотип 9018Н0Ц №1333.Анали-зируемый участок гена гликопротеина вразмером 238 н.о. относительно вируса бешенства 1-го генотипа, ЯДВУДУ956319имел четыре нуклеотидные замены, что соответствует 1,68% отличий.
При сравнении изучаемого изолята и вакцинных штаммов «Внуково-32» обнаружили 25 нукле-отидных замен, что соответствует 10,5% отличий, БДЭВ19 - 26 нуклеотидных замен, что соответствует 10,9% отличий.
Нами также установлено, что нуклеотидная последовательность изучаемого изолята отличается на 32,7% от изолята 0406БЕЫ лиссаподобного вируса, относящегося ко 2-му генотипу (1_адс^ЬаЦ; на 27,7% от изолятов 86132БД и 94286БД лиссаподобных вирусов 4-го генотипа (ЭиуепИаде), от изолятов 03002РЯД, 8918РЯД, ЯУ9-1 летучих мышей лиссаподобных вирусов 5-го генотипа (ЕВ__У1) на 21-21,8%, от изолятов 9018Н01_ и ЯУ1333летучих мышей лиссаподобных вирусов 6-го генотипа(ЕВ|_У2) на23,5%.
Таким образом, в результате сравнительного анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена в вируса бешенства размером 238 н.о. установили незначительное отличие изучаемого изолята от ЯДВМУ956319, составляющее 1,68%.
Заключение. Гидрофобия у больного Г., укушенного бродячей собакой на о. Гоа в Индии, установлена при жизни пострадавшего обнаружением специфиче-
ского антигена вируса бешенства в отпечатках с роговицы глаза по МФА, слюне по ИФА, а также генома вируса бешенства в слюне и слезной жидкости в ОТ-ПЦР и подтверждена постмортально - в различных отделах головного мозга по мФа, ИФА, а также выделением возбудителя биопробой на белых мышах.
Анализ последовательности нуклеотидов фрагмента гена в вируса бешенства размером 238 н.о. показал на незначительное отличие изучаемого изолята
Литература
от RABVAY956319, составляющее 1,68%, отличие от вакцинных штаммов «Внуково-32» на 10,5% и SADB19 на 10,9%, которые относятся к вирусам бешенств 1-го генотипа; значительное отличие от лиссаподобных вирусов 2, 4, 5 и 6 генотипов, составляющее 2132,7%. Полученные результаты свидетельствуют о филогенетической близости изучаемого изолята со штаммом RABVAY956319 вируса бешенства, относящегося к 1-му генотипу.
1.Ковалев, Н.А. Иммунофлуоресцентное исследование отпечатков роговицы при бешенстве / Н.А.Ковалев, А.С.Ша-шенько // Ветеринария. - 1970. - № 9. - С. 44-46.
2. Прижизненная клинико-лабораторная диагностика гидрофобии / Д.К.Баширова [и др.] // Казанский медицинский журнал. - 2007. - Т. 88. - № 5. - С. 449-492.
3. Прижизненная диагностика гидрофобии / Н.А.Хисматуллина [и др.] // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: тр. Междун. науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию создания ВНИИВВиМ. - Покров, 2003. -С. 157-161.
4. Аналитический обзор мероприятий по профилактике и борьбе с бешенством животных в Российской Федерации / разработчики: В.А.Ведерников, А.А.Шабейкин, А.М.Гулюкин, А.В.Паршикова (ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко); С.Г.Дресвянникова, Н.А.Яременко, С.А.Коломыцев. (Департамент ветеринарии). - М., 2014. - 178 с.
5. Государственный стандарт Союза ССР. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81). - М, 1984. - 9 с.
6. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор за бешенством. Методическое руководство / А.В.Иванов [и др.]. -Казань: ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2007. - 95 с.
7. Шабейкин, А.А. Анализ Закономерностей эпизоотического процесса бешенства на территории Европейской части Российской Федерации / А.А.Шабейкин, А.М.Гулюкин А.В.Паршикова // Ветеринария и кормление. - 2015. -№ 1. - С. 29-34.
8. Хисматуллина, Н.А. Два случая гидрофобии в Республике Татарстан: прижизненная и постмортальная лабораторная диагностика / Н.А.Хисматуллина А.М.Гулюкин, М.И.Гулюкин // Вопросы вирусологии. - 2015. - Т. 60, № 2. -С. 18-24.
BIOLOGICAL PROPERTIESOF RABIES VIRUS ISOLATED IN HUMAN
Samerkhanov I.I. - research assistant.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
Among the animal and human diseases, rabies has a special place because of the common susceptibility to the disease of warm-blooded animals and the absolute mortality in human. At planning the prevention measures and developing anti-rabies drugs the biological properties of rabies strains circulating in the area should be taken into consideration. In this regard, the aim of the research was to study biological properties of rabies virus isolated in human in comparison with the virus genotypes 1,2,4,5 and 6. Materials and methods: the rabies virus antigen was detected and identified by ELISA, immunofluorescence test, neutralization test using diagnostic drugs developed in ARRVI, Kazan. Rabies virus was isolated and its infection rate was determined on white mice. G gene fragment of rabies virus was sequenced using RT-PCR. The investigation results: in patient G. bitten by a stray dog on Goa island hydrophobia was registered in-vivo by detection of specific antigen to rabies virus in smears of eye cornea using fluorescent antibody test, as well as rabies virus genome in saliva and lacrimal fluid using RT-PCR and later was confirmed in postmortem studies - in various parts of the brain by immunofluorescence test, ELISA, and isolation of the agent at biotest using white mice. As a result of comparative sequencing of rabies virus G gene fragment238 n.b. long showed a slight difference between the studied isolate and RABVAY956319 for 1.68%. Conclusion: the results of in-vivo detection of hydrophobia were confirmed at postmortem studies of various parts of the brain by IFA, ELISA and biotest. Sequencing of rabies virus G gene fragment showed that the isolated virus belongs to the first serotype.
KEYWORDS: hydrophobia; fluorescent antibody method; enzyme-linked immunosorbent assay; neutralization reaction; polymerase chain reaction.
References
1. Kovalev, N.A. Immunofluorestsentnoye issledovaniye otpechatkov rogovitsy pri beshenstve [Immunofluorescent studies of eye cornea smears at rabies] / N.A.Kovalev, A.S.Sashenko // Veterinariya. -1970. - Vol.9. -P 44-46
2. Prizhiznennaya kliniko-laboratornaya diagnostika gidrofobii [The in-vivo clinical and laboratory detection of hydrophobia]/ D.K. Bashirova [et al.] // Kazansky meditsinsky jurnal. - 2007. - Vol. 88. - No.5. - P. 449-492.
3. Prizhiznennaya diagnostika gidrofobii [The in-vivo detection of hydrophobia] /N.A.Khismatullina [et al.] // Veterinarniye i metsinskiye aspekty zooantroponozov - Veterinary and medical aspects of animal and human diseases: proceedings from the Int. scientific. - practical. Conf. dedicated to the 45th anniversary of VNIIVViM. - Pokrov, 2003. - P. 157-161.
4. Analitichesky obzor meropriyatiy po profilaktike i borbe s beshenstvom zhivotnyh v Rossiyskoy Federatsii [Analytical review of measures on rabies prevention and control in animal in the Russian Federation] / developed by V.A.Vedernikov, A.A.Sobakin, A.M.Gulyukin, A.V.Parshikov (Ya.R. Kovalenko Research Institute of Experimental Veterinary); S.G.Dresvyannikova, N.A.Yaremenko, A.S.Kolomytsev (Animal Health department). - Moscow, 2014. - 178p.
5. Gosudarstvenny standart Soyuza SSR. Zhivotniye selskohozyaystvenniye. Metody laboratornoy diagnostiki beshenstva [State standard of the USSR. Agricultural animals. Methods of rabies laboratory diagnostics]. State standard 26075-84 (ST SEV 3452-81). - Moscow, 1984. - 9p.
6. Epizootologo-epidemiologichesky nadzor za beshenstvom. Metodicheskoye rukovodstvo [Epizootical and epidemiological survey of rabies. A methodological guideline]. / A.V.Ivanov [et al.]. - Kazan: FCTRBS-ARRVI, 2007. - 95p.
7. Shabeykin, A.A. Analiz zakonomernostey epizooticheskogo protsessa beshenstva na territorii Yevropeyskoy chaste Rossiyskoy Federatsii [The analysis of laws in rabies epizooty in the European part of the Russian Federation] / A.A. Shabeykin, A.M. Gulyukin, A.V. Parshikova // Veterinariya i kormleniye. - 2015. -№1. - P. 29-34
8. Khismatullina, N.A. Dva sluchaya gidrofobii v Respublike Tatarstan: prizhiznennaya i postmortalnaya laboratornaya diagnostika [Two cases of hydrophobia in the Republic of Tatarstan: in-vivo and postmortem laboratory diagnosis] / N.A.Khismatullina A.M.Gulyukin, M.I.Gulyukin// Voprosy virusologii. - 2015. - Vol.60, No. 2. - P. 18-24.
