CC BY
33
'РЕПАРАТЫ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ «УЛИЧНОГО» ВИРУСА БЕШЕНСТВА ИЗ БИОПРОБ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПОГИБШЕГО РЕБЕНКА
Юнищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Максимов В. А., Писцов М.Н., Степанов H.H., Борисевич С В Ручко С.В., Евстигнеев О.В., Хамитов P.A., Зверев А.Ю., Меркулов В.А., Ионов С.Н., Марков В.И., 2Мовсесянц A.A.
Министерство здравоохранения Российской Федерации, Москва;
Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний, Москва;
2Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва
л \
Исследованию на выявление и идентификацию возбудителя «уличного» вируса бешенства подвергнуты пробы головного мозга (кора, гиппокамп, мозжечок, продолговатый мозг) умершего ребенка. Исследования проведены с использованием вирусологических, иммунохими-ческих и молекулярно-биологических методов.
При интрацеребральном инфицировании мышей-сосунков объединенной биопробой головного мозга погибшего ребенка выделен возбудитель вирусной природы, амплифицирован-ный фрагмент кДНК которого идентифицирован как «уличный» вирус бешенства. ТФ ИФА в исследуемой пробе выявлен антиген вируса бешенства в разведении 1:64. Временные сроки гибели белых мышах массой 6-8 г, инфицированных интрацеребрально 20% вируссодержа-щей суспензией, также подтверждают принадлежность выделенного возбудителя к «уличному» вирусу бешенства. Концентрация возбудителя в объединенной биологической пробе составила 2,81дЛД50МИЦ/мл. V_/
Эпидемическая и эпизоотическая ситуация по бешенству в Российской Федерации в настоящее время остается неблагополучной. Природные очаги этой летальной нейровирусной инфекции существуют на всей территории России [3].
За последние 5-7 лет ветеринарной службой ежегодно регистрируются несколько тысяч случаев заболевания бешенством среди диких, сельскохозяйственных и домашних животных. Особенное беспокойство вызывает рост заболеваемости бешенством собак, кошек и сельскохозяйственных животных по сравнению с дикими животными [1, 5].
Одновременно с увеличением частоты случаев ра-бической инфекции у животных отмечается рост заболевания бешенством среди людей. Всего на территории России с 1993 по 2002 гг. зарегистрировано 103 случая заболевания гидрофобией. Наименьший уровень заболеваемости (6 случаев) наблюдался в 1996 г., а наибольший (22 случая) — в 2001 г. При этом в 2001 г. наблюдалось увеличение заболеваемости более чем в 2,5 раза по сравнению с 2000 г. [7-14].
Ухудшение эпидемической и эпизоотической ситуации наблюдается и в граничащих с Россией государствах Белоруссии и Украины. Об этом свидетельствуют принятые руководством этих государств Комплексные
программы по профилактике и борьбе с бешенством [18, 19].
В настоящее время диагностика гидрофобии у человека проводится на основе эпидемиологических и эпизоотических данных, клинических, патологоанатоми-ческих и лабораторных методов исследования. Но, учитывая степень опасности этого заболевания, окончательный диагноз может быть поставлен только лабораторными методами. Результаты лабораторных исследований являются основным критерием постановки диагноза и выбора тактики профилактики и лечения людей, пострадавших от укусов [17, 22]. При этом использование одновременно нескольких лабораторных методов позволяет наиболее точно и достоверно ставить посмертный диагноз заболевания [16, 17, 22].
Рязанская область до недавнего времени характеризовалась как область, в которой отмечалась средняя интенсивность эпизоотического процесса [6]. Однако в последние годы отмечено влияние антропогенных факторов в эпизоотии бешенства в Рязанской области, так как более 70% случаев заболевания связаны с домашними животными (собаки, кошки). Кроме того, обращает на себя внимание наличие в Рязанской области случаев бешенства у серых крыс, комнатных хомячков и мышей [5], хотя до настоящего времени их роль в со-
€
^ Март-июнь 2009 г.
Результаты определения биологической активности возбудителя в биопробе на белых мышах
Таблица
3
Л
В и
rti Г9
I»
Наблюдение, сут
1-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22-30
1
10'
Ю-2 103 104 105
ю-6
Контроль
к
6 7
9 10
11 1
12 13
14
Количество павших животных, шт.
15 3/6 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
Биологическая активность, 1&ЛД50 МИЦ/мл
16
2,8
Примечание. Гибель животных регистрировали на 13, 14, 16, 19 сут после их интрацеребрального инфицирования. Срок наблюдения за животными — 30 сут. В качестве разводящей жидкости использовали забуференный физиологический раствор.
хранении и поддержании природных очагов бешенства не вполне ясна.
28 июля 2002 г. в с. Слобода Рыбновского района Рязанской области ребенок До-ч Л. был укушен за левую щеку собакой соседа. За медицинской помощью мать ребенка не обращалась. Собака на пятый день после контакта пала, однако труп ее был доставлен в областную ветеринарную лабораторию только 12 сентября 2002 г. и не был пригоден к лабораторным исследованиям.
9 сентября 2002 г. на 43 сут с момента укуса собакой у ребенка отмечалось повышение температуры тела и бессонница. 11 сентября 2002 г. в 19 ч 40 мин ребенок поступил в областную детскую клиническую больницу с жалобами на повышение температуры тела до 38,6 °С, вялость, бессонницу, нарушение проглатывания твердой и жидкой пищи, пошатывание при ходьбе.
Несмотря на предпринимаемые меры, 2 октября 2002 г. в 3 ч 15 мин ребенок скончался. В 13 ч этого же дня проведено патологоанатомическое вскрытие и выставлен предварительный патологоанатомический диагноз (без данных гистологического исследования): бешенство ? клещевой энцефалит.
Учитывая, что мать ребенка, находясь на поздних сроках беременности, была в прямом контакте со своим больным ребенком (в том числе слизывала слюну собаки с рваной раны щеки ребенка) ей была назначен курс экстренной профилактики. Для принятия дальнейшей врачебной тактики в отношении матери погибшего ребенка требовалось вирусологическое исследование структур его головного мозга.
В связи со сложившейся ситуацией, на основании распоряжения Первого заместителя министра здравоохранения РФ — Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г. Онищенко у погибшего ребенка патологоанатомами были отобраны кусочки коры,
гиппокампа, мозжечка, продолговатого мозга и доставлены 7 октября 2002 г. в ЦСДЛ.
Материалы и методы_
Использовали лабораторные образцы ИФА-тест-сис-тем для выявления антигенов вирусов клещевого энцефалита и бешенства, а также тест-систему для выявления фрагментов РНК вируса бешенства методом обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ЦПР), разработанные и изготовленные в ВЦ НИИМ МО РФ.
Для сравнительного изучения разработанных тест-систем использовали коммерческую тест-систему для выявления антигена вируса клещевого энцефалита методом ТФ ИФА (Хромоген-ТМБ) «ВектоВКЭ-антиген-стрип», производства ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово, Новосибирской области, серия № 18, контрольный № 1015, срок годности до 01.11.02п ПЦР проводили в Nested-варианте с использованием двух пар праймеров: внешней — U647, L1273 и внутренней — U726, L1082.
Результаты и обсуждение_
Отобранные на секции материалы (фрагменты коры, гиппокампа, мозжечка, продолговатого мозга) были помещены в один флакон для анализа. В связи с этим, была приготовлена одна объединенная биопроба (БП), представляющая собой 10%-ю суспензию головного мозга на забуференном физиологическом растворе с 2% сыворотки крупного рогатого скота. Исследование проводили по следующей схеме. 1. Выделение возбудителя из БП на новорожденных белых мышах-сосунках и определение биологической активности возбудителя в БП на белых мышах массой 6-8 г.
И)
3
4
ПРЕПАРАТЫ
2. Идентификация возбудителя методами ТФ ИФА и
ПЦР.
Для выделения возбудителя из БП использовали трех кормящих белых мышей с новорожденными мышами-сосунками в количестве 19 шт., из которых7 особей пало (37%) на 13-19 сут после их интрацеребраль-ного инфицирования. У павших животных был отобран головной мозг и на его основе приготовлена 20% суспензия для определения биологической активности возбудителя.
Белых мышей массой 6-8 г заражали интрацереб-рально по 0,04 мл исследуемой пробы последо-ватель-ными десятикратными разведениями с 101 до 106. Срок наблюдения за инфицированными животными составил 30 сут. Гибель в течение первых суток после инфицирования считали неспецифической.
Результаты титрования БП представлены в таблице. Анализ данных, представленных в таблице, свидетельствует, что специфическая гибель белых мышей массой 6-8 г наблюдалась в те же сроки, что и у новорожденных белых мышей, т.е. на 13-19 сут. Временные сроки гибели белых мышей массой 6-8 г, инфицированных интрацеребрально 20%-й вируссодержащей суспензией, подтверждают принадлежность выделенного возбудителя к «уличному» вирусу бешенства [22].
Клинические проявления заболевания у животных характеризовались адинамией, отсутствием аппетита, парезами, параличами и последующей гибелью. Гибель животных в контрольных группах отсутствовала. Биологическая активность возбудителя в БП от погибшего ребенка составила 2,8 1дЛД50 МИЦ/мл.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1000 800 600 400
Рисунок.
Гель-электрофорез продуктов амплификации нуклеиновых кислот из гомогената ткани головного мозга погибшего человека.
Продукты первого этапа амплификации специфического фрагмента вируса бешенства в пробах: 1 — проба № 1 гомогената ткани головного мозга погибшего человека; 2 — проба № 2 гомогената ткани головного мозга погибшего ребенка; 3 — положительный контроль; 4 — отрицательный контроль. Продукты второго этапа амплификации специфического фрагмента вируса бешенства в пробах: 5 — проба № 1 гомогената ткани головного мозга погибшего ребенка; 6 — проба № 2 гомогената ткани головного мозга погибшего ребенка; 7 — положительный контроль; 8 — отрицательный контроль; 9 — ПЦР-маркер.
Результаты постановки ИФА с использованием лабораторных и коммерческой тест-систем свидетельствовали о наличии антигена вируса бешенства в головном мозге погибшего ребенка в разведении 1:64 и отсутствии антигена клещевого энцефалита в исследуемой БП.
Подготовку БП для исследования в ОТ-ПЦР проводили в соответствии с инструкцией по применению набора для выделения РНК SV Total RNA Isolation фирмы Promega. Направленную амплификацию фрагментов кДНК «уличного» вируса бешенства проводили с помощью ОТ-ПЦР стандартным методом. Конечный объем выделенных препаратов РНК — 25 мкл.
Направленную амплификацию фрагментов кДНК вируса бешенства проводили по следующей схеме:
• обратная транскрипция с использованием вспомогательного праймера U647 и обратной транс-крип-тазы M-MLV;
• первый этап ПЦР с использованием вспомогательного праймера L1273 и поступенчатого снижения температуры отжига в процессе амплификации;
• второй этап ПЦР с использование основных прай-меров U726 и L1082.
Результаты амплификации представлены на рисунке. Положительный и отрицательный контроли подтвердили чувствительность и специфичность экспериментального образца тест-системы.
При направленной амплификации нуклеиновых кислот, выделенных из анализируемых проб, получены следующие фрагменты: дорожки №№ 5-7 — примерно 387 п.о. В дорожках №№ 1, 2, 3, 4 и 8 амплификаты отсутствуют.
При этом размеры специфических продуктов в дорожках №№ 5-7 соответствуют ожидаемым размерам (387 п.о.) и совпадают с размером амплификата, полученного с положительного контрольного образца. В отрицательном контроле специфические фрагменты отсутствуют.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии амплифицированных кДНК фрагментов вируса бешенства в обеих исследованных пробах секционного материала головного мозга.
Таким образом, при интрацеребральном инфицировании мышей-сосунков объединенной БП головного мозга погибшего ребенка выделен возбудитель вирусной природы, амплифицированный фрагмент кДНК которого идентифицирован как «уличный» вирус бешенства. ТФ ИФА в исследуемой пробе (20% суспензии головного мозга погибшего ребенка) выявлен антиген вируса бешенства в разведении 1:64. Временные сроки гибели белых мышах массой 6-8 г, инфицированных интрацеребрально 20% вируссодержащей суспензией, также подтверждают принадлежность выделенного возбудителя к «уличному» вирусу бешенства. Концентрация возбудителя в объединенной биологической пробе составила 2,8 1дЛД50 МИЦ/мл.
Литература
1. Авилов В.М., Гусев A.A., Саввин А.В.//Вет. патология. — 2002. — № 1. — С. 72-77.
2. Авилов В.М., Седов В.А., Коломыцев С.А. и др.// Ветеринария. — 1998. — № 6. — С. 20-23.
<Е
£ Март-июнь 2009 г.
3. Бешенство. Информационный бюллетень Минздрава России и Минсельхоза России. — 1998.
4. Ведерников В.А., Юрик С.А.//Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных. — Новосибирск. — 1997. — С. 50-52.
5. Домский И.А.//Вет. патология. — 2002. — № 1. — С. 119-122.
6. Дудников С.А.//Вет. патология. — 2002. — № 1. — С. 78-91.
7. Здоровье населения и среда обитания. — 1995. — № 1.
8. Здоровье населения и среда обитания. — 1996. — № 1.
9. Здоровье населения и среда обитания. — 1997. — № 1.
10. Здоровье населения и среда обитания. — 1998. — № 1.
11. Здоровье населения и среда обитания. — 1999. — № 1.
12. Здоровье населения и среда обитания. — 2000. — № 12.
13. Здоровье населения и среда обитания. — 2001. — № 1.
14. Здоровье населения и среда обитания. — 2001. — № 1.
15. Кузьмин И.В., Сидоров Г.Н., Ботвинкин А.Д.,
Рехов Е.И., Полещук Е.М.//Вет. патология. — 2002. — № 1. —С. 92-100.
16. Макаров В.В.//Вет. патология. — 2002. — № 1. — С.12-20.
17. Недосеков В.В.//Вет. патология. — 2002. — № 1. — С.48-51.
18. Постановление Совета Министров Республики Беларусь № 483 от 06.04.2001 г. об утверждении Комплексной программы профилактики бешенства в Республике Беларусь на 2001-2003 г.
19. Приказ Первого заместителя Министерства здравоохранения Украины, Главного государственного санитарного врача Украины и Главы Государственного департамента ветеринарной медицины, Главного государственного инспектора ветеринарной медицины Украины № 43/315 от 01.12.01 г. об утверждении Комплексной программы основных мероприятий профилактики и борьбы с бешенством в Украине на 2000-2010 гг.
20. Хадарцев О.С., Старостина Н.В.// Акт. вопр. эпидемиол. инф. болезней. — 1997. — № 2. — С. 341-343.
21. Шестопалов A.M., Кисулина М.И.//Вопр. вирусол. — 2001. — № 2. — Р. 7-12.
22. Luekrajang Т. et al.//Laboratory techniques in rabies. 4rd ed. — 1996.
