CC BY
17
ХЕМОСИСТЕМАТИКА И ХРОМОСОМНЫЕ ЧИСЛА УДК [575.22+577.112]:633.3
ПОЛИМОРФИЗМ ПОЛИПЕПТИДОВ СЕМЯН У БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ
HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. И H. NEGLECTUM LEDEB.
(FABACEAE)
POLYMORPHISM OF SEED POLYPEPTIDES IN CLOSELY RELATED SPECIES OF HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. AND H. NEGLECTUM LEDEB.
(FABACEAE)
Методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле изучена изменчивость и специфичность по полипептидным спектрам семян в популяциях близкородственных видов рода Hedysarum (сем. Fabaceae): H. theinum Krasnob. и H. neglectum Ledeb., собранных в различных эколого-географических зонах. Прослеживалась общая для видов картина в распределении компонентов полипептидов на спектрах, которые мы объединили в четыре зоны. В области 35 kD выявлена видоспецифичная для H. theinum группа компонентов. У представителей H. neglectum обнаружены различия по степени насыщенности электрофоретических спектров полипептидами и наличию более интенсивных компонентов в области 35 kD и 40 kD, последняя группа компонентов является видоспецифичной для H. neglectum. Таким образом, показана возможность идентификации близкородственных видов H. theinum и H. neglectum по электрофоретическим спектрам полипептидов семян.
Введение. Широкая морфологическая изменчивость, особенно у видов с перекрестным типом опыления, спонтанная межвидовая и межродовая гибридизация значительно затрудняют таксономическую классификацию внутри рода. Кроме того, без выявления генетической природы и характера наследования ряда диагностических признаков порою трудно разобраться в системе видовых и даже родовых комплексов.
Становится все более очевидной необходимость применения других, более адекватных методов для решения спорных вопросов, касающихся классификации близкородственных видов, образцов, отклоняющихся от типовых экземпляров и гибридных форм, возникающих при интрогрессии генетического материала.
Основываясь на исследованиях, проведенных А. А. Созиновым и В.Г. Кона-
М.А. Агафонова, О.В. Агафонова
M. Agafonova, O. Agafonova
ревым с сотрудниками на ряде культурных растений и их диких сородичах, можно заключить, что наиболее эффективными маркерами для выявления множественного аллелизма по одному или нескольким генам, обусловливающим полиморфизм по ряду признаков, являются белковые маркеры, что в полной мере показано на представителях трибы пшеницевые (Созинов, 1985; Конарев и др, 1993). Ранее нами было установлено, что запасные белки проламины и глютелины являются удобными маркерами для идентификации вида, рода, генотипа и целого генома у представителей рода Elymus (триба Triticeae) (Агафонов, Агафонова, 1990; Агафонова, 1996).
Однако остается малоизученным вопрос об использовании запасных белков для классификации и систематики природных видов бобовых растений. Копеечник чайный (Hedysarum theinum Krasnob.) - ценное лекарственное растение, относится к семейству Fabaceae и является высокогорным альпийским видом с дизъюнктивным центральноазиатско-южносибирским типом ареала (Алтай, Монголия, Тарбагатай, Джунгарский Алатау, Памир) (Красноборов и др., 1985; Ревушкин, 1988; Курбатский, 1994).
Как самостоятельный вид H. theinum был выделен в 1985 году по ряду морфологических и биохимических характеристик из состава H. neglectum Ledeb. (Красноборов и др., 1985). Вид включен в Красную книгу Республики Алтай (1996), так как его местообитания подвергаются существенной антропогенной нагрузке (выпас скота, вырубка леса, заготовка сырья). Один из основных диагностических признаков, характерных для вида H. theinum - это бурый корень. Тем не менее, идентификация от H. neglectum по-прежнему затруднена из-за отсутствия четких морфологических признаков, так как в природных популяциях одновременно встречаются растения с бурым (на изломе красным), белым и розовым корнями.
В данной работе мы предприняли попытку изучить внутривидовую изменчивость и охарактеризовать по электрофоретическим спектрам полипептидов семян внутривидовую изменчивость у близкородственных видов H. theinum и H. neglectum с целью уточнения их видовой специфичности и различия между этими видами.
Материалы и методы. В работе анализировались гербарные образцы растений и коллекция семян, представляющая собой выборки из 10 природных популяций H. theinum и 8 популяций H. neglectum, произрастающих в разных эколого-географических зонах Горного Алтая, Хакасии и Казахстана.
Для разделения запасных белков семян применили метод электрофореза в полиакриламидном геле, модифицированный нами ранее для изучения полиморфизма запасных белков эндосперма (проламинов) у представителей рода Elymus (Агафонова, Агафонов, 1991). Использовали трис-глициновую буферную систему для SDS-электрофореза в 10% полиакриламидном геле, в экстракты белков добавляли 0.2 М 2-меркаптоэтанол. В качестве маркеров были выбраны полипептидные спектры семян. Для оценки молекулярной массы полипептидных фракций использовался стандартный образец линии E. sibiricus ALT-1 -
эталонный спектр, состоящий из компонентов, промаркированных белками с известными молекулярными массами. Внутри-и межпопуляционную изменчивость по полипептидным спектрам у представителей трех видов оценивали с помощью коэффициентов сходства, вычисляемых по формуле (Ayala et al., 1970):
К =-----n— х 100%
сх m
где n - число одинаковых компонентов двух спектров, m - максимальное число компонентов одного из спектров. Вычисления проводили для каждой пары спектров внутри выборки и между выборками.
Результаты и обсуждение. Все изученные выборки из популяций видов H. theinum и H. neglectum характеризовались высокой степенью полиморфизма по электрофоретическим спектрам полипептидов, что, как правило, характерно для растений с преимущественно перекрестным типом опыления.
В результате анализа электрофоретических спектров этих видов было установлено, что у всех представителей изученных популяций они состоят из компонентов с молекулярными массами от 30 kD до 150 kD. На электрофоре-граммах исследованных образцов обоих видов можно выделить, по крайней мере, четыре зоны (I-IV) (рис.).
Несмотря на то, что спектры очень насыщены компонентами, распределение которых практически для каждой особи индивидуально, в зоне IV во всех изученных спектрах представителей вида H. theinum присутствует группа, состоящая из 1-3 компонентов с разной интенсивностью. Эта характерная для вида группа компонентов является видоспецифичной и располагается приблизительно в области 35 kD (рис.).
Как мы уже отмечали выше, изменчивость внутри изученных выборок из природных популяций H. theinum достаточно высока, и это подтверждается в основном низкими средними значениями внутрипопуляционных коэффициентов сходства (К ) для выборок (37.53-47.13). При этом крайние значения коэффициентов сходства для представителей выборок этого вида распределились между максимальной величиной 66.85 (выборка 3) и минимальной величиной 34.69 (выборка 2) (табл. 1).
Оценку межпопуляционной изменчивости с помощью коэффициентов сходства проводили, сравнивая попарно пять выборок из популяций H. theinum (табл. 2). Выяснилось, что в некоторых случаях значения Ксх, вычисленных для образцов одной выборки (оценка внутрипопуляционной изменчивости) и Ксх для образцов из разных выборок (оценка межпопуляционной изменчивости), примерно одинаковые. Это означает, что сходство образцов внутри одной популяции является таким же, что и сходство образцов между популяциями. Тем не менее, у пяти выборок H. theinum (16, 11, 9, 17, 3) Ксх больше величины верхней границы, характеризующей межпопуляционную изменчивость, и составляют 50.56; 52.79; 53.04; 64.35; 66.85 соответственно.
Полипептидные спектры у представителей из популяций H. neglectum характеризуются более высокой гетерогенностью. Кроме того, в популяциях
кО 81 Т N
Рис. Электрофоретические спектры полипептидов отдельных семян представителей видов Hedysarum Летит и Н. neglectum■ (8Б8-система, +Ме вариант), 81 - стандартный образец линии Е. ыЪтсив (АЕТ-1); Т - отдельные семена Н.Шешиш, N - отдельные семена Н. neglectum■
Н. neglectum обнаружено две зоны, состоящие из интенсивных компонентов: в области 35 кБ (видоспецифична для представителей Н. theinum) и в области около 40 кБ, которая видоспецифична для представителей Н. neglectum (рис.). Таким образом, основными отличительными особенностями вида H.neglectum от близкородственного Н. theinum является насыщенность электрофоретических спектров полипептидами и наличие более интенсивных компонентов в III и IV зонах.
Высокая гетерогенность полипептидных спектров у представителей этого вида подтверждается более низкими значениями коэффициентов сходства по сравнению с таковыми у представителей вида Н. theinum■ Так, крайние значения Ксх для представителей выборок Н. neglectum распределились между максимальной величиной 44.98 (выборка 5) и минимальной величиной 32.76 (выборка 17) (табл. 1).
Оценку межпопуляционной изменчивости для представителей вида Н. neglectum с помощью коэффициентов сходства проводили, сравнивая попарно
четыре выборки из популяций. Величины Ксх, как и следовало ожидать, вследствие большой гетерогенности спектров полипептидов, характеризовались меньшими значениями (25.70-32.96) по сравнению с таковыми у представителей Н. theinum и не превосходили по величине нижнюю границу (32.76), характеризующую внутрипопуляционные Ксх для представителей Н. neglectum (табл. 2).
Для оценки степени различий между видами Н. theinum и Н. neglectum сравнивались по четыре выборки из популяций этих видов. В результате было установлено, что Ксх характеризуются величинами, значения которых меньше нижней границы Ксх как для вида Н. theinum, так и для вида Н. neglectum (табл. 2). Наименьшее сходство было обнаружено между 16 популяцией Н. theinum и 23 популяцией Н. neglectum (Кср=19.88), а наибольшее - между 16 популяцией Н. theinum и 12 популяцией Н. neglectum (К=32,96). Нужно отметить,
Таблица 1
Средние значения внутрипопуляционных коэффициентов сходства для представителей Hedysarum theinum и Н. neglectum
Среднее значение коэффициента сходства для вы борки, %
Hedysarum theinum Hedysarum neglectum
Популяция Популяция
2 34.69 17 32.76
12 36.09 19 34.10
7 37.53 23 36.49
14 41.67 8 37.93
15 47.13 9 38.95
16 50.56 21 39.50
11 52.79 24 41.32
9 53.04 5 44.98
17 64.35
3 66.85
Таблица 2.
Средние значения межпопуляционных и межвидовых коэффициентов сходства для представителей Hedysarum theinum и Н. neglectum
Среднее значение коэффициента сходства м ежду выборками, %
Н.&етиш Н.пе§1ес1ит НАетит\Н.пе§1ес1ит
Популяции Популяции Популяции
7/14 33.56 5/17 25.70 16/23 19.88
2/9 33.98 8/9 28.76 5/4 24.24
11/12 42.74 23/24 30.92 18/26 27.56
15/16 46.37 19/21 32.96 16/12 32/96
3/17 47.89
что в целом величины коэффициентов сходства между видами (Кср от 19.88 до 32.96) заметно меньше, чем даже между популяциями каждого вида.
Таким образом, можно выявить некоторые особенности, характерные для представителей всех изученных популяций двух видов.
Высокая гетерогенность электрофоретических спектров полипептидов семян отражает преимущественно перекрестный тип опыления, характерный для многих представителей рода Hedysarum. Несмотря на небольшие в среднем величины коэффициентов сходства, прослеживается некоторая тенденция к уменьшению их значений от внутрипопуляционных до Ксх между видами. У обоих видов наблюдается сходство в распределении компонентов полипептидов (которые мы объединили в четыре зоны) на электрофоретических спектрах. Во всех спектрах образцов вида H. theinum в IV зоне присутствует видоспецифичная группа в области 35 kD, состоящая из 1-3 компонентов. Отличительными особен -ностями близкородственного вида H. neglectum является насыщенность электрофоретических спектров полипептидами, наличие более интенсивных компонентов в III и IV зонах и присутствие в области около 40 kD видоспецифичной группы компонентов.
В целом результаты нашего исследования показывают возможность идентификации близкородственных видов H. theinum и H. neglectum по полипептид-ным спектрам семян, что очень важно при уточнении видовой принадлежности образцов только по семенам.
ЛИТЕРАТУРА
Агафонов А.В., Агафонова О.В. Внутривидовая изменчивость проламинов пырейника сибирского, выявляемая методом одномерного электрофореза // Генетика, 1990. -Т. 26, №> 2. - С. 304-311.
Агафонова О. В., Агафонов А. В. Повышение разрешающей способности электрофоретического метода для таксономических и генетико-селекционных исследований многолетних злаков трибы Пшеницевые (Triticeae). Киев //Деп. ВИНИТИ, 1991, N°. 2467 -В91. - C. 2-11.
Агафонова О.В. Существует ли геномная специфичность в роде пырейник?// Докл. Акад. Наук, 1996. - Т. 353, №> 3. - С. 126-129.
Конарев В.Г., Гаврилюк И.П., Губарева Н.К. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции (Теор. осн. селекции Т.1). - М: Колос, 1993. - 447 с.
Красноборов И.М., Азовцев Г.Р., Орлов В.П. Новый вид рода Hedysarum (Fabaceae) из Южной Сибири // Бот. журн., 1985. - Т. 70, №9 7. - C. 968-973.
Курбатский В.И. Сем. Fabaceae (Leguminosae) // Флора Сибири. - Новосибирск: Наука, 1994. - Т. 9. - 277 с.
Ревушкин А.С. Высокогорная флора Алтая. - Томск: Изд-во ТГУ, 1988. - 320 с.
Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. - М. : Наука, 1985. - 217 с.
Ayala G. J., Maurao C. A., Perez-Salas S., RichmoundR., Dobzhansky Th. Enzyme variability in the Drosophilae Williston group. I. Genetic differentiation among species // Proc. nat. Acad. Sci. USA, 1970, №>. 67. - P. 225-232.
SUMMARY
The variability and the spesificity of related species of genus Hedysarum (Fabaceae family) H. theinum Krasnob. and H. neglectum Ledeb. from the different ecology-geographic areas using SDS polyacrylamide gel electrophoresis were investigated. As a marker we used electrophoretic spectra of seed polypeptides. The similar patterns of polypeptide components distribution were observed in both species accessions studied. On the electrophoretic spectra of H. theinum accessions there is a specific group of polypeptide components in the 35 kD range. The electrophoretic polypeptide spectra of H. neglectum accessions differ from H. teinum accessions in the saturation level of the components and component intensity in the 35 kD and 40 kD range. The group of components in the 40 kD range is specific for H. neglectum. So, the possibility of the related species H. theinum and H. neglectum identification by electrophoretic polypeptide spectra of seeds was demonstrated.
Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН г. Новосибирск
Получено 21.06.2002 г.
