CC BY
33
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭВОЛЮЦИИ ЭКОСИСТЕМ
https://doi.org/l0.17816/ecogenl725-19
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ НИЗКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ЛИНОЛЕНОВОЙ КИСЛОТЫ, У ЛИНИЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ ЛЬНА ВИР
© E.A. Пороховинова ', Т.В.Шеленга ', Т.В. Матвеева 2, А.В.Павлов ', Е.А. Григорьева ', Н.Б. Брач 1
1 Федеральный исследовательский центр «Всероссийский институт генетических ресурсов растений
им. Н.И. Вавилова (ВИР)», Санкт-Петербург;
2 ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург
Для цитирования: Пороховинова Е.А., Шеленга Т.В., Матвеева Т.В., и др. Полиморфизм генов, контролирующих низкое содержание лино-
леновой кислоты, у линий генетической коллекции льна ВИР // Экологическая генетика. — 2019. — Т. 17. — № 2. — С. 5 — 19. https:// doi.
org/l0.17816/ecogen1725-19.
Поступила: 30.11.2018 Одобрена: 15.02.2019 Принята: 17.06.2019
С использованием шести поколений инцухта из 26 гетерогенных образцов льна получены 40 линий, среди которых 19 высоко- (ВЛ), 7 средне- (СЛ) и 14 низколиноленовых (НЛ). Эти линии оценены по содержанию пяти основных жирных кислот (ЖК): пальмитиновой (PAL), стеариновой, олеиновой (OLE), линолевой (LIO), линоленовой (LIN); соотношению LIO/LIN, йодному числу масла (IOD), фазам вегетационного периода (ВП) и размерам растения. Дисперсионный анализ показал достоверные отличия ВЛ-, СЛ-, НЛ-групп по PAL, OLE, LIO, LIN, LIO/LIN, IOD. Резкое снижение LIN вызывает несимметричные изменения в соотношении ЖК, корреляциях между ними и остальными признаками. Благодаря факторному анализу было обнаружено влияние двух факторов: первый — разделил линии по уровню LIN и связанных с ним признаков, второй — по ВП и OLE. Образование LIN контролируют два комплементарных гена LuFAD3A и LuFAD3B. Секвенирование первого экзона гена LuFAD3A у шести линий выявило мутацию (G255 ^ A255), приводящую к образованию стоп-кодона. Разработанный CAPS-маркер подтвердил гомозиготность потомков гибридов от скрещивания НЛ- (гк-391) и ВЛ-линий (гк-65, -109, -121). Показано, что потомки гибридов с линией гк-109 созревали на 8—10 дней раньше родительской НЛ-линии гк-391. С помощью CAPS-маркеров гена LuFAD3B удалось установить различия между ВЛ-, СЛ- и НЛ-линиями. В результате секвенирования первого и начала второго экзонов этого гена у трех линий (1 ВЛ, 2 НЛ) была выявлена мутация во втором сайте рестрикции, находящаяся во втором экзоне (С6 ^ T6) и приводящая к замене Hys ^ Tyr.
^ Ключевые слова: CAPS-маркеры; Linum usitatissimum; solin; биологическое разнообразие; генетическая коллекция; гены LuFAD3A и LuFAD3B; жирнокислотный состав масла семян; морфологические признаки.
POLYMORPHISM OF GENES CONTROLLING LOW LEVEL OF LINOLENIC ACID
IN LINES FROM VIR FLAX GENETIC COLLECTION
© E.A. Porokhovinova ', T.V. Shelenga ', T.V. Matveeva 2, A.V. Pavlov ', E.A. Grigorieva ', N.B. Brutch 1
1 Federal Research Centre N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), Saint Petersburg, Russia;
2 Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia
For citation: Porohovinova EA, Shelenga TV, Matveeva TV et al.
Polymorphism of genes controlling low level of linolenic acid in lines from VIR flax genetic collection.
Ecological genetics. 2019;17(2):5-19. https://doi.org/10.17816/ecogen1725-19.
Received: 30.11.2018 Revised: 15.02.2019 Accepted: 17.06.2019
^ Background. Linseed solin varieties were created for nutrition, but the effect of oil fatty acid (FA) composition on other characters is not clear. Materials and methods. Using 6 inbreeding generations from 26 heterogeneous flax accessions were generated 19 high (HL), 7 medium (ML) and 14 low linolenic (LL) lines. For each lines contents of 5 basic FA: palmitic, stearic, oleic (OLE), linoleic (LIO) and linolenic (LIN); the ratio LIO/LIN, oil iodine number, vegetative period (VP) phases and plants size were evaluated. Development of CAPS marker for LuFAD3A gene was performed using idtdna.com. Sequencing of LIN genes sites was done in the Centre MCT SPBGU and Eurogen. Results. ANOVA showed significant differences HL, ML and LL groups for PAL, OLE, LIO, LIN, LIO/LIN, IOD. Considerable decrease of LIN, causes asymmetric changes in FA ratio and correlations between them and other traits. Factor analysis revealed the influence of two factors. The first one divided lines according to their LIN level and characters associated with it, the second one — according to the VP and OLE. LIN synthesis is controlled by two complementary genes LuFAD3A and LuFAD3B. Sequencing of LuFAD3A gene 1 exon of 6 lines revealed a mutation (G255 ^ A^5), resulting in formation of stop codon. Developed developed CAPS-marker confirmed the homozygosity of hybrids between LL (gc-391) and HL lines (gc-65,
109, 121). Descendants of hybrid between gc-109 and gc-391 ripened 8-10 days earlier than gc-391. CAPS markers of LuFAD3B gene revealed differences between HL, ML, LL lines. Sequencing of this gene first exon and the beginning of the second one in 3 lines (1HL, 2LL) showed that this method reveals a mutation in the second restriction site, located in the 2 exon (C6 ^ T6), and causing the replacement Hys ^ Tyr. Conclusion. Lines from GC have wide variability of FA and other agronomic characters, combination of which will expand the cultivation of solin.
& Keywords: biological diversity; CAPS markers; genetic collection; Linum usitatissimum; solin; LuFAD3A and LuFAD3B genes; morphological characteristics; seed oil fatty acid composition.
ВВЕДЕНИЕ
Площади масличного льна в мире составляют 2,8 млн га. Сейчас РФ является основным производителем этой культуры (7О9 тыс. га в 2О16 г.), так как Евросоюз, Бразилия и Япония запретили ввоз трансгенного льна, возделываемого в Канаде [1]. Однако по продуктивности льна Россия уступает Канаде, США и Франции [2]. В РФ лен занимает четвертое место по доходности среди масличных культур после подсолнечника, сои и рапса и может служить резервной культурой для восполнения дефицита сырья в случае неурожая подсолнечника и сои не только на Юге, но и в других регионах РФ [3].
Масло льна содержит пять основных жирных кислот (ЖК): две насыщенные — пальмитиновую (PAL, 16 : О) и стеариновую (STE, 18 : О) и три ненасыщенные — олеиновую (OLE, 18 : 1), линолевую (LIO, 18 : 2) и линоленовую (LIN, 18 : 3). По положению последней двойной связи LIO относится к w6-, а LIN — к ш3-кислотам. Льняное масло обычно содержит около 5О % LIN, благодаря чему его применяют во многих отраслях, но оно быстро прогоркает, что затрудняет его пищевое использование [4].
Сорта льна по своему назначению делятся на высо-колиноленовые (ВЛ) и низколиноленовые (НЛ). В РФ районировано 33 сорта, из них четыре НЛ [5].
Высоколиноленовое льняное масло незаменимо в фармацевтической, парфюмерной, косметической, мыловаренной, лакокрасочной промышленности [6]. Для производства олиф и красок необходимо, чтобы масло быстро высыхало, что связано с его ненасыщенностью, которую оценивают по йодному числу. В норме оно колеблется от 18О до 19О [7].
При использовании льна как основного продукта питания при цилиакии и других алиментарных заболеваниях для замещения муки злаков рекомендуют соблюдать соотношение ш6/ш3-кислот 5—1О/1 для обычного питания и 3—5/1 — для лечебного. Большинство сортов имеют соотношение ~О,25/1 [8], поэтому для производства полножирновой муки надо уменьшать содержание LIN.
Первые НЛ-сорта Linola"™ были созданы в 197О-х гг. в Канаде [9]. Они содержат около 2 % линоленовой кислоты и являются двойными рецессивными гомозиготами по комплементарным генам ln1 и ln2. Другие сорта — потомки сорта Linola или получены незави-
симо от него. Все они запатентованы и недоступны для научных исследований.
Содержание разных ЖК взаимосвязано. На их соотношение оказывают влияние как генотип растения, так и условия окружающей среды [10]. У льна биосинтез ЖК хорошо изучен. Гены стеароил-АСР-деса-туразы (18 : 0 ^ 18 : 1) sad1 и sad2 секвенированы в 1994 г. (Singh et al., 1994, цит. по [11]), гены деса-туразы-2 fad2a и fad2a — в 2007 г. (18 : 1 ^ 18 : 2) (Khadake et al., 2009, цит. по [11]; [12]), гены десату-разы-3 fad3a и fadSb (18 : 2 ^ 18 : 3) — в 2005 г. [13]. Гены начала биосинтеза жирных кислот — кетоацил-CoA-синтазы (AAS) секвенированы в 2004 г. [14], но их функция определена в 2014 г. — KASIII (Acetyl-CoA+Malonil-CoA ^ 4 : 0), KASI (4 : 0 ^ 16 : 0), KASII (16 : 0 ^ 18 : 0) [15].
Ценными для селекции льна считают гены fadSa и fadSb (они же Inl и ln2), так как они кодируют деса-туразы, превращающие линолевую кислоту в линоленовую, необходимую для технического масла, но нежелательную для пищевого [15].
Гены fadSa и fadSb имеют размер 3280 и 3002 п. н. соответственно и содержат по 6 экзонов и 5 интронов, кодируя белки длиной 391 и 392 аминокислоты. Сходство генов на уровне ДНК составляет 85 %, сходство аминокислотных последовательностей — 94 %. По размеру гены различаются из-за инделей от 1 до 29 п. н., локализованных в интронах. Для Fad3a известно шесть изоформ, четыре из которых не приводят к инактивации фермента. Первая, A (8 аллелей с синонимичными заменами) — самая распространенная, изоформы B, C, E (по 1—2 аллели) встречаются редко. Изоформы D и E потеряли функциональность из-за нонсенс-мутации. Для Fad3b известно семь изоформ, пять из которых не приводят к инактивации фермента. Это изоформы A (4 аллели), D (8 аллелей), G (7 аллелей), E, F (по 2 аллели). Только две изоформы не дают полноценного продукта: B — из-за нонсенс-мутации в первом экзоне и С — в связи с заменой гистидина на тирозин в первом His-box активного центра десатуразы [11].
Таким образом, селекционное изменение жирно-кислотного состава (ЖКС) масла льна должно основываться на поиске спонтанных или индуцированных мутаций в генах fadSa и fadSb, оценке различных комбинаций аллелей и генов и обязательном биохимическом подтверждении изменения состава масла.
Желтосемянность важна для производства льна пищевого назначения. Ее контролируют несколько генов: si — ингибитор антоциановой окраски, помимо желтой окраски пыльников и семян обусловливает белый деформированный цветок, pf-ad — помимо желтого цвета семян контролирует розовую окраску венчика, f — определяет светло-голубой венчик и пятнистые семена, oral — определяет крапчатые семена и оранжевые пыльники. Три органоспецифичных гена отвечают только за светлую окраску семян — YSEDl и ysed2 (желтую), rsl (светло-желто-коричневую) [16].
В мире создано большое количество НЛ-сортов, но не ясно, как изменение ЖКС масла повлияло на другие признаки. Авторы большинства сортов не акцентируют внимание на донорах генов НЛ, а также способах их отбора и проверки сортовой чистоты, поэтому в задачи работы входило: 1) выявление полиморфизма ЖКС масла семян среди линий и сортов льна; 2) изучение систем связей между ЖКС, высотой растения и скороспелостью групп льна, контрастных и по уровню LIN; 3) разработка CAPS-маркеров на аллели генов НЛ; 4) проверка гомозиготности НЛ-линий, созданных вслепую.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для выявления полиморфизма по ЖКС было изучено 19 ВЛ-, 8 СЛ- и 16 НЛ-линий (табл. 1). В качест-
ве «дикого типа» использовали линию гк-2 из образца стародавней селекции (л-1 из к-48) с красно-коричневыми семенами (рис. 1).
По нескольку линий получено от каждого из двух НЛ-сортов — Linola и Eyre, они имеют различный габитус и отличаются по уровню линоленовой кислоты и соотношению ЖК. Часть линий получена в результате гибридизации НЛ-линии гк-391 (л-2-1 из и-601679, Eyre, Австралия), также гомозиготной по генам YSED1, sfbsl (ингибирование синтеза антоци-анов в гипокотиле и цветке) с ВЛ-линиями, несущими другие гены светлой окраски семян или гены хозяйственных признаков, и последующего отбора стабильных форм, но без контроля ЖКС. Среди ВЛ-родителей гк-65 (л-3 из к-3178, Тверская губерния) гомозиготна по гену oral, скороспела, с ней созданы две линии (ВЛ и СЛ); гк-109 (л-3-2 из к-6099, Аргентина) гомозиготна по гену wfl (белые лепестки), связанному с ранним цветением [17], с ней созданы пять линий (1 ВЛ, 2 СЛ, 2 НЛ); гк-121 (л-1-1 из к-6272, Северная Ирландия) гомозиготна по гену rsl, задействована в создании двух линий (ВЛ и СЛ); гк-173 гомозиготна по гену ysed2, с ее участием созданы две ВЛ-ли-нии; гк-392 (гк-132 * гк-103) гомозиготна по генам sl и sfbsl, из гибрида с ней отобрана НЛ-линия.
В 1995—2016 гг. на базе Пушкинских лабораторий ВИР линии оценивали по продолжительности фаз ве-
3х
Сорт Eyre
(Австралия)
и-601679 НЛ
л-3 (ВЛ)
6х(
Зх6
л-3-1 (ВЛ) гк-472 • г 6хС
л-3-2(ВЛ) гк-498
Местный (Тверская губ.) к-3178 ВЛ
x6
л-4 (НЛ) гк-441
x6
л-5 (НЛ) гк-420
2
л-1-2 (НЛ) гк-391
6
S
л-3 (ВЛ) гк-65
X
Makovi MAG (Аргентина) к-6099 ВЛ
6
S
л-3-2 (ВЛ) гк-109
X
L.Dominion, (Сев. Ирландия) к-6272 ВЛ Ottawa 2152, (Германия) и-548145 ВЛ Сорт Currong (Австралия) к-6608 ВЛ Lin 225 (Нидерланды) к-5896 ВЛ
6X5
6х
S
л-1-1 (ВЛ)
гк-121
S
л-1 (ВЛ) гк-173
J X
X X
6х
6х
л-1 (ВЛ) л-4 (ВЛ)
гк-132 1 гк-103
х6
S
л-1 (ВЛ) 132x103 гк-392
л-2 (СЛ) л-2 (СЛ) л-3 (СЛ)
391x65 391x109 391x109
л-2 (СЛ) 391x121
л-1 (НЛ) 391x109
л-4 (НЛ) 391x109
X
х6
л-1 (НЛ) 391x392
Рис. 1. Родословная линий гибридного происхождения, участвующих в исследовании
F
F
Таблица 1
Характеристика линий генетической коллекции льна ВИР и сортов, использованных в исследовании
Номер по каталогу ВИР или родословная Поколение инцухта, линия Название и происхождение родителя(ей) LIN Окраска семян Идентифицированные гены
гк-2 л-1 к-48 (сел. Альтгаузена, Россия) ВЛ красно-коричневая «дикий тип»
гк-483 л-1 к-3713 (Китай, к северу от Кашагара) ВЛ желтая pf-ad?
гк-448 л-1 к-3730 (Западный Китай) ВЛ желтая si
гк-136 л-1 к-6634 (Mermilloid, Чехословакия) ВЛ желтая si
гк-210 л-1 и-588294 (Б-125, Литва, ЛитНИИЗ) ВЛ красно-коричневая -
гк-1631 л-2-1 к-726 (Солецкий кряж, Псковская губ.) СЛ красно-коричневая -
гк-119 л-2-3 к-6210 (NP (RR) 38, Индия) СЛ красно-коричневая -
гк-395 л-1 и-601680 (Walaga, Австралия) НЛ желтая YSED1
гк-474 л-1 и-612949 (Amon, Чехия, Agritec) НЛ желтая YSED1?2
гк-512 л-1 и-620803 (N852, неизвестно) НЛ желтая sfbsi?, YSED1?
гк-513 л-2 и-620804 (N853, неизвестно) НЛ желтая sfbsi?, YSED1?
гк-514 л-3 и-620805 (N854, неизвестно) НЛ желтая sfbsi?, YSED1?
гк-515 л-4 и-620806 (N858, неизвестно) НЛ желтая pf-ad?
гк-516 л-5 и-620807 (N864, неизвестно) НЛ желтая sfbsi?, YSED1?
к-86771 сорт Исток, Россия, Пензенский НИИСХ НЛ желтая YSED1?
к-88711 сорт ЛМ98, Россия, ВНИИЛ НЛ желтая YSED1?
гк-390 л-1 и-595808 (Linola, Канада); НЛ СЛ желтая YSED1
гк-393 л-2 ВЛ красно-коричневая
гк-394 л-3 СЛ красно-коричневая
гк-523 л-8-1 НЛ желтая YSED1
гк-391 л-1-2 и-601679 (Eyre, Австралия); НЛ НЛ желтая sfbs1, YSED1
гк-472 л-3-1 ВЛ желтая YSED1
гк-498 л-3-2 ВЛ желтая YSED1
гк-441 л-4 НЛ желтая sfbsi, YSED1
гк-420 л-5 НЛ желтая sfbsi, YSEDi
ВЛ-линии, присутствующие в родословной гибридов, использованных в исследовании
гк-65 л-3 к-3178 (местный, Тверская губ.) ВЛ крапчатая orai
гк-103 л-4 к-5896 (Lin 225, Нидерланды) ВЛ желтая si
гк-109 л-3-2 к-6099 (Makovi M.A.G., Аргентина) ВЛ красно-коричневая wfi
гк-121 л-1-1 к-6272 (L. Dominion, Северная Ирландия) ВЛ светло-желто-коричневая rsi
гк-173 л-1 и-548145 (48254, Ottawa 2152, Германия) ВЛ желтая ysed2
гк-392 л-1 гк-132 (л-1 из к-6608, Currong, Австралия) гк-103 ВЛ желтая
Окончание табл. l
Номер по каталогу BИP или родословная Поколение инцухта, линия Название и происхождение родителя(ей) LIN Окраска семян Идентифицированные гены
Линии из гибридов от скрещивания линий, контрастных по уровню LIN
391 x 65-1 I43 л-1 гк-391 г -6 Ol BЛ желтая oral, sfbsl, YSEDl
391 x 65-2 I4 л-2 СЛ желтая oral, sfbsl, YSEDl
391 x 109-1 I4 л-1 гк-109 НЛ желтая wfl, YSEDl
391 x 109-2 I4 л-2 СЛ желтая wfl, YSEDl
391 x 109-3 I4 л-3 СЛ желтая sfbsl, wfl, YSEDl
391 x 109-4 I4 л-4 НЛ желтая sfbsl, wfl, YSEDl
391 x 109-5 I4 л-5 BЛ желтая sfbsl, wfl, YSEDl
391 x 121-1 л-1 гк-121 BЛ светло-желто-коричневая sfbsl, sfcl, rsl
391 x 121-2 л-2 СЛ светло-желто-коричневая sfbsl, sfcl, rsl
391 x 173-1 л-1 гк-173 BЛ желтая sfbsl, sfc3-2, ysed2
391 x 173-2 л-2 BЛ желтая sfbsl, sfc3-2, ysed2
391 x 392-1 л-1 гк-392 НЛ желтая sl, sfbsl, YSEDl
Примечание. 'Образцы не участвуют в статистическом анализе; 2исходя из фенотипа линии, тест на аллелизм не проводили; 3поколение инбридинга для создающихся линий, где не отмечено 6 и более. LIN — линоленовая кислота. ВЛ — высоколино-леновый, СЛ — среднелиноленовый, НЛ — низколиноленовый.
гетационного периода (Bn): всходы — цветение первого цветка (T1), цветение первого цветка — созревание первой коробочки (T2); всходы — созревание первой коробочки (Т3), учитывали также общую (Ho) и техническую (Ht) высоту и длину соцветия (Inf). Так как погодные условия в годы изучения различались, данные выравнивали методом приведенного среднего [18] к раннеспелому стандарту. Затем для каждой линии вычисляли среднее значение за все время изучения.
ЖКС масла оценивали с помощью газожидкостной хроматографии с масспектрометрией метиловых эфи-ров ЖК на хроматографе Agilent 6850. Определяли процентный состав пяти ЖК в масле: PAL, STE, OLE, LIO, LIN, а также соотношение LIO/LIN.
Основной характеристикой технического масла является его йодное число (IOD). Это показатель ненасыщенности масла ЖК, чем он выше, тем быстрее масло высыхает.
IOD вычисляли по формуле (AOCS Method Cd lc-85, цит. по [11]):
IOD = 0,86-OLE + 1,732-LIO + 2,616-LIN,
где IOD — йодное число масла; OLE, LIO, LIN — доля олеиновой, линолевой и линоленовой кислот в масле соответственно.
Данные анализировали с помощью программ Statistica 7.0 for Windows и пакета анализа Excel 2007 for Windows [19, 20].
Интервал для минимального и максимального значений для каждого признака рассчитывали как min + НСР (наименьшая существенная разница, по Фишеру) [21].
Для определения влияния группы льна по LIN (ВЛ, СЛ, НЛ) на высоту растения, скороспелость и ЖКС масла использовали однофакторный дисперсионный анализ (Analysis of Variation, ANOVA). Долю влияния фактора (п2, %) вычисляли по Фишеру [21].
Различия между группами льна по уровню LIN оценивали по критерию достоверной значимой разницы Тьюки (ДЗР, HSD — Honestly significant difference Tukey) для неравных выборок с апостериорным попарным сравнением средних после отклонения гипотезы Н0 об отсутствии различий по результатам ANOVA [19, 20].
Для каждой группы льна проводили анализ систем корреляций между признаками (по Пирсону) с построением корреляционных плеяд. Для оценки сходства систем связей вычисляли коэффициенты корреляции между z-преобразованными матрицами корреляций для каждой из трех групп. Эти показатели отображают сходство матриц по структуре [22].
Для каждой линии выделяли ДНК из 10 двухдневных корешков проростков льна по стандартной методике [23].
ПЦР проводили в объеме 20 мкл. В состав смеси входили: DreamTaq™ Green Master Mix (2X) (ThermoScientific), по 5 пикомолей каждого прайме-ра и 1 мкл препарата ДНК. Праймеры синтезированы компанией «Евроген» [24]. Праймеры, флан-
кирующие участок с предположительной мутацией в гене LuFAD3A, подбирали с использованием программы idtdna.com [25]. Для выявления мутаций в гене LuFAD3B использовали опубликованные ранее прайме-ры и протокол [13].
Секвенировали ДНК на базе РЦ СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» и компании «Евроген». В работе использовали референсные последовательности для гена LuFAD3A: HM991829.1, HM991830.1, HM991831.1, JQ963128.1.
Последовательности генов выравнивали с помощью программы tcoffee [26]. Нуклеотидные последовательности анализировали при помощи программ MEGA 7.0.21 [27] и UGENE1.290 [28].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С использованием шести поколений инцухта из 26 гетерогенных образцов льна получены 40 линий,
среди которых 19 высоко-, 7 средне- и 14 низколино-леновых.
Признаки изученных линий варьировали слабо (CV< 10 %, Ti, TS) или умеренно (CV< 26 %, Ho, Ht, Inf, T2, PAL, STE, OLE, IOD), и только те из них, которые были связаны с синтезом линоленовой кислоты (CV = 26-146 %, LIO, LIN, LIO/LIN), были сильно варьирующими (табл. 2).
Общая высота растения была от 52 см у некоторых НЛ-линий (re-S91, -512, -514, -516) до 95 см у гк-2 (стандарта), техническая длина — от SS см (ВЛ re-48S; СЛ гк-119; НЛ гк^91) до 75 см (гк-2). ANOVA показал достоверные различия групп льна по всем трем признакам. Различия в 10 см по ним между ВЛ и НЛ по критерию Тьюки были достоверны. Длина соцветия колебалась от 1S см (ВЛ гк-mS, -121, -Ш) до 26 см (ВЛ re-48S, -109, -17S; НЛ rc-52S) и практически не различалась между группами льна (см. табл. 2, рис. 2).
Таблица 2
Параметры высоты растения, продолжительность фаз вегетационного периода и жирнокислотного состава масла семян у образцов льна, различающихся по уровню синтеза линоленовой кислоты
Номер каталога ВИР Ho Ht Inf Ti T2 TS PAL STE OLE LIO LIN LIO/ LIN IOD
Линии с высоким содержанием линоленовой кислоты
гк-2 93 75 18 40 2ß 64 4 S 19 15 6G 0,25 198
гк-65 70 52 17 З9 26 65 4 S 21 17 55 0,З0 192
re-48S 59 ЗЗ 25 47 S8 85 6 S 1S 11 67 0,17 2G5
гк-448 64 42 22 40 41 81 6 2 14 12 67 0,17 2G9
re-10S 75 62 1З 49 S6 85 5 4 14 12 65 0,19 20S
гк-109 75 49 26 4S 40 82 4 S 2S 15 55 0,27 190
гк-121 62 48 14 4S SS 76 5 S 16 18 59 0,З0 198
гк-Ш 72 59 14 47 S6 84 5 5 15 14 62 0,22 198
гк-Ш 78 52 26 45 S8 8S 5 5 18 20 5S 0,З7 187
гк-210 84 6S 20 4S S2 75 5 5 2S 19 48 0,40 180
гк-Э9Э 79 60 19 55 48 1G3 6 S 21 1З 57 0,22 189
гк-472 57 S8 20 45 41 85 7 5 15 20 52 0,З9 185
гк-498 56 S7 19 45 41 86 З 2 1S 20 61 0,ЗЗ 2G6
гк-Э92 6S 41 22 42 S8 80 5 5 20 15 54 0,28 186
S91 X 65-1 74 57 17 5S 28 81 6 S 2S 16 51 0,З1 Ш
S91 109-5 64 47 18 41 S4 75 5 S 27 17 49 0,З4 179
S91 121-1 68 5S 15 46 S6 82 5 4 25 21 46 0,45 177
S91 17S-1 64 44 20 46 40 86 4 2 9 18 66 0,27 212
S91 17S-2 72 50 22 48 40 88 6 5 17 19 5S 0,З5 187
Среднее 70 i 2 51 i 2 19 i i 45 i i S6 i i 81 i 2 5 i 0 4 i 0 18 i 1 16 i i 57 i 1 0,29 i 0,02 19S i 2
CV 14 21 21 10 16 10 19 29 26 19 11 27 6
Окончание табл. г
Номер каталога ВИР Ho Ht Inf Ti T2 T3 PAL STE OLE LIO LIN LIO/ LIN IOD
Линии с пониженным содержанием линоленовой кислоты
гк-163 7 3 28 19 43 0,44 169
гк-119 59 36 22 41 36 77 5 4 34 17 39 0,44 161
гк-390 74 55 19 47 31 78 5 3 17 32 44 0,72 184
гк-394 80 59 21 48 32 80 5 4 20 37 34 1,08 170
391 65-2 76 60 16 54 27 81 6 4 19 35 36 0,96 171
391 109-2 64 46 17 41 34 75 5 4 29 48 14 3,46 144
391 109-3 60 45 15 45 34 78 5 4 25 29 37 0,78 168
391 121-2 67 46 20 45 38 83 5 5 29 21 41 0,51 167
Среднее 68 i 3 50 i 3 19 i i 46 i 2 33 i 1 79 i i 5 i 0 4 i 0 25 i 2 31 i 4 35 i 4 1,14 i 0,40 166 i 5
CV 12 18 15 10 10 3 8 15 26 33 28 92 7
Низколиноленовые линии и сорта
гк-523 74 48 25 49 32 81 6 4 17 67 6 12,00 146
гк-391 53 35 18 42 42 85 6 4 23 60 7 9,07 142
гк-441 59 42 17 41 44 85 7 3 27 62 г 29,27 135
гк-420 56 37 19 42 41 83 7 4 18 69 3 22,78 142
гк-395 58 38 20 45 40 85 7 3 19 69 г 31,26 141
гк-474 74 52 22 53 41 94 7 4 16 72 1 49,33 142
гк-512 37 15 43 41 84 7 5 24 61 3 23,51 134
гк-513 57 38 18 43 40 82 7 6 27 58 г 31,99 129
гк-514 55 38 17 43 40 84 7 4 19 69 г 34,74 140
гк-515 62 40 22 48 38 86 6 4 18 68 3 26,07 141
гк-516 37 15 43 39 82 6 4 22 66 г 37,31 138
391 109-1 58 42 16 41 33 74 6 4 26 62 1 42,66 135
391 109-4 64 45 19 42 34 76 4 4 24 62 6 10,18 145
391 392-1 61 40 21 43 39 82 3 2 16 75 4 19,60 154
к-8677 6 4 13 75 г 47,18 145
к-8871 7 3 19 69 г 33,84 141
Среднее 60 i 2 41 i 1 19 i i 44 i i 39 i 1 83 i i 6 i 0 4 i 0 21 i 1 66 i i 3 i 0 27 i 3 140 i 2
CV 12 12 16 8 9 6 19 24 20 8 57 44 4
Все среднее 66 i 2 47 i 2 19 i i 45 i i 37 i 1 82 i i 5 i 0 4 i 0 20 i 1 36 i 4 34 i 4 10 i 2 170 i 4
НСР 3 3 1 1 2 2 0,3 0,3 2 7 8 5 8
CV 15 20 18 9 14 8 20 25 26 64 74 149 15
Примечание. Ho — общая высота соцветия; Ht — техническая высота соцветия; Inf — длина соцветия; T1 — продолжительность фазы всходы—цветение первого цветка; T2 — продолжительность фазы цветение первого цветка—созревание первой коробочки; Т3 — продолжительность фазы всходы—созревание первой коробочки; PAL — пальмитиновая кислота; STE — стеариновая кислота; OLE — олеиновая кислота; LIO — линолевая кислота; LIN — линоленовая кислота; IOD — йодное число. Курсивом обозначены минимальные, а полужирным шрифтом — максимальные значения выделившиеся по критерию Тьюки для всей выборки. Гк-390 не участвует в дисперсионном анализе высоколиноленовых образцов.
%
100 90 80 70 60 50 40 — 30 — 20 ю 0
ррщ
|в|вр|
|в|в|в| |в|в|в| |в|вр1
з s а
■ в|в|
■ вш®
|ВРШ|В|
|в|в|в|в| |в|в|в|в| |в|в|в|в| |в|в|в|в| |в|в|в|в| |в|в|в|в|
в|в в|в
V
*Но
F p
различия вл-нл
*Ht
5,87 0,01 вл-нл
Inf
TI *Т2 ТЗ *PAL STE »OLE *LIO *LlN »LIO/UN *IOD
0,09 0,47 3,69 0,92 5,54 0,69 5,03 333,6 312,0 63,4 120,7 0,91 0,63 0,03 0.41 0,01 0,51 0,01 0,000 0,000 0,000 0,000 нет вл-нл вл-сл все все нл от др. все
■ Группа образцов по уровню линоленовой кислоты □ случайное варьирование
Рис. 2. Доля влияния (n2) степени линоленовости (ВЛ — высоколиноленовый, СЛ — среднелиноленовый, НЛ — низколинолено-вый) и случайного варьирования по результатам однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). *различия между группами достоверны; Ho — общая высота соцветия; Ht — техническая высота соцветия; Inf — длина соцветия; Ti — продолжительность фазы всходы—цветение первого цветка; T2 — продолжительность фазы цветение первого цветка—созревание первой коробочки; TS — продолжительность фазы всходы—созревание первой коробочки; PAL — пальмитиновая кислота; STE — стеариновая кислота; OLE — олеиновая кислота; LIO — линолевая кислота; LIN — линоленовая кислота; IOD — йодное число; F — значение критерия Фишера; p — вероятность сходства классов (ВЛ, СЛ, НЛ); различия — достоверные различия этих классов по результатам апостериорного сравнения по критерию ^юки для неравных выборок
Самые скороспелые ВЛ-линии гк-2 и гк-65, у которых все три периода вегетации были короткими (T1 = 39, T2 = 25, T3 = 64 сут), а позднеспелая — ВЛ гк-393, мутант из НЛ-линий сорта Linola (T1 = 55, T2 = 48, T3 = 103 сут). Только по продолжительности периода всходы — цветение выделялись ВЛ гк-448 (40 сут) и СЛ л-2 из гк-391 * гк-65 (54 сут). По результатам ANOVA не было выявлено различий между группами льна по T1 и T3, но обнаружены достоверные отличия по T2. Однако максимальные различия в 6 сут между группами льна для T2 по критерию Тьюки были недостоверны (см. табл. 2, рис. 2).
Содержание PAL в масле колебалось от 3 % (ВЛ гк-2, -65, -498, л-1 из гк-391 * гк-173; НЛ л-1 из гк-391 * гк-392) до 7 % (ВЛ гк-472; СЛ гк-163; НЛ гк-441, -420, -395, -474, -512, -513, -514, к-8871). ANOVA показал достоверные различия для групп льна по этому признаку. Различия в 1 % между ВЛ и НЛ по критерию Тьюки были достоверны, а из-за небольшой выборки те же различия между ВЛ и СЛ выявлены не были (см. табл. 2, рис. 2).
Содержание STE в масле колебалось от 2 % (ВЛ гк-498, л-1 из гк-391 * гк-173; НЛ л-1 из гк-391 * гк-392) до 6 % (НЛ гк-513) и достоверно не различалось у групп льна (см. табл. 2, рис. 2).
Содержание OLE в масле колебалось от 9 % (ВЛ л-1 из гк-391 * гк-173) до 34 % (СЛ гк-119). ANOVA продемонстрировал достоверные различия для групп льна по этому признаку, обусловленные разницей
в 7 % между СЛ и ВЛ, достоверной по критерию Тьюки (см. табл. 2, рис. 2).
Доля влияния группы льна (п2) на описанные выше признаки при достоверных различиях составляла от 17 до 25 %. Для групп льна по всем признакам, связанным с уровнем LIN, ANOVA показал достоверные различия, доля влияния составляла от 77 до 95 %, что было вызвано принципом разделения на группы (см. рис. 2).
Содержание LIO в масле колебалось от 11 до 75 % (у ВЛ 11-21 %, у СЛ 17-48 %, у НЛ 58-75 %). Наименьший процент LIO имели почти все ВЛ-линии (гк-483, -448, -103 и др.), а наибольший — почти все НЛ (л-1 из гк-391 х гк-392, к-8677, гк-474 и др.) (см. табл. 2). Критерий Тьюки показал достоверные различия для всех трех групп льна.
Содержание LIN в масле колебалось от 1 до 67 % (у ВЛ 46-67 %, у СЛ 14-44 %, у НЛ 1-7 %). Наименьший процент LIN имели все НЛ-образцы, а наибольший — ВЛ гк-483, -448 и др. (см. табл. 2). Критерий Тьюки указывал на достоверные различия для всех трех групп льна (см. рис. 2).
Соотношение LIO/LIN колебалось от 0,17 до 49,33 (у ВЛ 0,17-0,45, у СЛ 0,44-3,46, у НЛ 9,07-49,33). Минимальные значения имели все ВЛ-льны, а максимальное — НЛ. LIO/LIN — очень сильно варьирующий признак (CV = 149). Однако у ВЛ-форм он был более постоянен (CV = 27 %), чем у СЛ (CV = 92 %) и НЛ (CV = 44 %).
ANOVA продемонстрировал достоверные различия для групп льна по этому признаку (см. табл. 2), но по критерию Тьюки достоверно отличались только НЛ- от ВЛ- и СЛ-форм (см. рис. 2).
Из всех изученных образцов «в чистом виде» для лечебного питания может быть использовано масло лишь л-2 из гк-391 х гк-109, а при диетическом — двух линий из коммерческих сортов гк-391 и гк-523, а также линии гибридного происхождения л-4 из гк-391 х гк-109. Остальным маслам необходим купаж.
Йодное число масла колебалось от 129 до 212 (у ВЛ 177-212, у СЛ 161-184, у НЛ 129-154). Наименьшим оно было у НЛ гк-441, -512, -513, л-1 из гк-391 х гк-109, наибольшим — у ВЛ гк-483, -448, -472, л-1 из гк-391 х гк-121 (см. табл. 2). Критерий Тьюки показал достоверные различия для всех трех групп льна (см. табл. 2, рис. 2).
Содержание ЖК в семенах иногда коррелируют с фазами ВП и высотами. Как мы и предполагали ранее [10], изменения, происходящие в семенах при снижении синтеза LIN, вызывают несимметричные изменения в соотношении ЖК, что сказывается на корреляциях между ними. Во всех трех группах льна было выявлено две плеяды скоррелированных признаков. И только несколько корреляций совпало в каждой
из них: в первой — высоты тесно связаны друг с другом, так как Ht составляет около 90 % от Ho; в центре второй — содержание LIN в масле, отрицательно коррелирующее с соотношением LIO/LIN и положительно с IOD. Как и в первом случае, это следствие арифметических закономерностей вычисления последних двух признаков (рис. 3).
У ВЛ-линий первую плеяду образуют длительность вегетационного периода (T3), тесно положительно связанная с ее фазами — T1 и T2, а также умеренно положительно — с PAL, образующейся в начале биосинтеза ЖК. T2 отрицательно коррелирует с Ht, которая в свою очередь очень сильно положительно связана с Ho. Вторую плеяду, помимо очень сильной положительной корреляции LIN с IOD и сильной отрицательной с LIO/LIN, а также сильной отрицательной между последними, дополняет сильная отрицательная корреляция OLE с LIN и IOD, а также умеренная отрицательная последних со STE. LIO очень сильно положительно связана с LIO/LIN и умеренно отрицательно с LIN. Негативно коррелирующие с LIN ЖК являются ее предшественниками. Inf независима от других признаков (см. рис. 3).
Группа СЛ-линий малочисленна, корреляции между ее признаками достоверны при r > 0,75, и многие силь-
PAL
T1
T2
OLE
А
.-STE
IOD
LIN
Inf
Ht
Ho
LIO/ LIN
LIO
Inf
T3
T1
T2
OLE
Ho
IOD
OLE
Ht
LIO
IOD
T2
T3
STE
/ \
LIN
Tir III PAL
LIO/
LIN
: r г G.9 ■G.9 > r г G.7 - G.7 > r г G.5 r < G
Рис. 3. Корреляционные плеяды признаков высоты растения, продолжительности фаз вегетационного периода и жирнокислот-ного состава масла семян у образцов льна, различающихся по уровню синтеза линоленовой кислоты: а — высоко-линоленовые; б — среднелиноленовые; в — низколиноленовые. Ho — общая высота соцветия; Ht — техническая высота соцветия; Inf — длина соцветия; T1 — продолжительность фазы всходы—цветение первого цветка; T2 — продолжительность фазы цветение первого цветка—созревание первой коробочки; T3 — продолжительность фазы всходы—созревание первой коробочки; PAL — пальмитиновая кислота; STE — стеариновая кислота; OLE — олеиновая кислота; LIO — линолевая кислота; LIN — линоленовая кислота; IOD — йодное число
а
б
в
ные и все умеренные корреляции не могут быть приняты во внимание. Здесь первую плеяду помимо высот образует T1, сильно положительно связанная с Ht, и обе они отрицательно коррелируют с T2. С первыми двумя признаками сильно отрицательно коррелирует содержание OLE. Bторую плеяду образуют попарно положительно сильно коррелирующие между собой LIO и IOD, а также LIO и соотношение LIO/LIN. Эти две группы отрицательно коррелируют друг с другом. Inf, T3, содержание насыщенных кислот не зависят от других признаков (см. рис. З).
У Кл-линий первую плеяду вместе с высотами образуют T1 и Inf, положительно связанные друг с другом. С T1 положительно коррелирует T3, а с ней положительно связана T2. Центр второй плеяды смещается на IOD, которое положительно связано с LIO (сильно) и LIN (умеренно) и отрицательно с OLE, STE и PAL. LIO также очень сильно отрицательно коррелирует с OLE и умеренно со STE, последняя в свою очередь положительно связана с PAL. LIN очень сильно отрицательно коррелирует с LIO/LIN, так как именно изменчивостью LIN в основном определяется варьирование этого соотношения. Плеяды связаны между собой умеренными отрицательными корреляциями OLE с T1 и Inf, а также положительной корреляцией последней с IOD (см. рис. З).
Корреляции между z-преобразованными матрицами корреляций для групп льна показали их умеренное
сходство (^л_Сл = 0,Б0, ^л = 0,42 ^л = 0,54Х которое в основном обусловлено арифметическими закономерностями измерения/вычисления признаков.
При помощи факторного анализа (метод главных компонент) было выявлено два основных фактора, влияющих на исследуемые признаки (рис. 4).
Первый фактор определяет соотношение LIO и LIN. Он указывает на антагонизм LIN, IOD и высот растения (Ho, Ht), с одной стороны, и LIO, PAL, LIO/LIN — с другой, и характеризует около 40 % общей изменчивости.
Этот фактор с небольшим захождением отделил НЛ-линии от ВЛ. СЛ-линии заняли промежуточное положение. Интересно, что «захождение» в сторону НЛ вызвано наличием СЛ-гетерозиготы в выборке (л-2 из гк-391 х гк-109), а также ревертанта к ВЛ из НЛ-сорта (гк-472).
Второй фактор определяет скороспелость и показывает антагонизм длительности всех трех фаз ВП, с одной стороны, и OLE — с другой. Он объясняет около 20 % общей изменчивости.
Этот фактор выделил раннеспелые, как правило, высокоолеиновые гк-2, -65 и л-1, -2, -4, -5 из гк-391 х гк-109, и экстремально позднеспелую гк-393, а также позднеспелые низкоолеиновые -483, -472, л-1 и -2 из гк-391 х 173.
В системе двух факторов выделяют три группы линий: 1) НЛ гк-391, -441, -420, -395, -512, -513, -514, -515, -516 — с наименьшим количеством LIN и наибольшим LIO; 2) наиболее скороспелые и высоколино-леновые гк-2 и -65; 3) родственные НЛ л-2 и СЛ л-4 из гк-391 х гк-109 как скороспелые. Отдельно от других находятся экстремально позднеспелая ВЛ гк-393 и позднеспелая гк-474 — НЛ и низкоолеиновая.
Таким образом, факторный анализ позволил сгруппировать линии по скоррелированным признакам и комплексно охарактеризовать их.
Для поиска различий линий НЛ и СЛ по генам биосинтеза линоленовой кислоты разработан новый метод идентификации аллели гена LuFAD3A, контр-
OLE ' J
А
uo üd/UN STE A A
Ht *Ho
А Ж Inf ДО' А
PAL ▲
T2 Т1
▲ А
ТЗ А
-0,2 0.0 0,2 Фактор 1 а
0.4
1-0
...........&.......*>' A А ■ 391X109L5 А 210
"У" щя& : • 119
391 51%16 441 391x3921.1 39 •514*™ 391 • C10SL3 А » 121 300 ^ббВД351-1
515 • 472 .......' 474 # А136 17348 A391X121L1 4Ä8* ж А 391x17312 391x173L1 А483 А
А ВЛ 393 ■ сл : А • НЛ
0,0 0,5
Фактор 1 б
Рис. 4. Распределение 13 изученных признаков (а) и 40 линий льна (б) в системе двух факторов. Ho — общая высота соцветия; Ht — техническая высота соцветия; Inf — длина соцветия; T1 — продолжительность фазы всходы—цветение первого цветка; T2 — продолжительность фазы цветение первого цветка—созревание первой коробочки; ТЗ — продолжительность фазы всходы—созревание первой коробочки; PAL — пальмитиновая кислота; STE — стеариновая кислота; OLE — олеиновая кислота; LIO — линолевая кислота; LIN — линоленовая кислота; IOD — йодное число
олирующего ее образование. Анализ имеющихся в базе данных NCBI-последовательностей аллелей гена LuFADSA показал, что в большинстве НЛ-сортов мутация, ингибирующая синтез LIN, находится в первом экзоне этого гена. Были сконструированы прай-меры FAD3Ae1F (acttggcatcctgcattactt) и FAD3Ae1R (ccagaaagataatgtgaaattacc), фланкирующие этот участок. Продукт амплификации имеет длину 526 п. н. При его секвенировании у каждой из мутантных аллелей LuFADSA линий гк-391 и гк-515 обнаружены одинаковые замены в положениях 28 (G ^ A), 255 (G ^ A) и 309 (A ^ G) первого экзона, что говорит об идентичности аллелей между собой и полном сходстве с последовательностью из NCBI для генотипа SP2047
(НМ881831). Замена в положении 255 (в ^ А) приводит к образованию стоп-кодона.
Использование рестриктазы НавШ позволяет идентифицировать мутантную аллель, содержащую замену 0255 ^ А255. В пределах амплифициро-ванного фрагмента аллели дикого типа присутствует два сайта рестрикции (рис. 5). При его расщеплении образуются фрагменты 85, 90 и 351 п. н. Указанная выше мутация находится в положении 442 продукта амплификации и затрагивает один из двух сайтов рестрикции, в результате чего образуются фрагменты 90 и 436 (351 + 85) п. н. Таким образом, нами предложен новый вариант САРБ-маркера. С его помощью установлено, что сорта ЛМ98 и Исток, а так-
р-4.
1247
1337
1434
V -h
1750 ' 1668 1773
ВЛ 90 330 1 104
НЛ 90 434
G
V -h
815
1006
:0 Joa Mi« .
V H-
1155 1240 " " 1329
1246 1283
ВЛ 191 240 1 37
НЛ 191 277
DuOQuODuOuCuOQOOÜuQDoQüpDODOGüDuüQuppc
^fc-fe
ΫI о «.[gira^ :
'□□DCCQOaOOQODBOGDnCCoOaaDOODnaODDOODÇO
СЛ ВЛ НЛ
Рис. 5. Молекулярное маркирование генов ЬиЕЛЮЗА (а—в) и ЬиИАОЗБ (г—е): а, г — рестрикционная карта фрагмента гена; в, д — хроматограммы дикого типа (гк-2) и мутанта (гк-391), БЫР отмечены стрелками; в, е — электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР-фрагментов. ВЛ — высоколиноленовый, СЛ — среднелиноленовый, НЛ — низколиноленовый
а
б
в
г
д
е
2
же линии из НЛ-сортов Linola (гк-390, -523), Eyre (гк-391, -441, -420), Walaga (гк-395), Amon (гк-474) и образцов 852, 853, 854, 858, 864 (гк-512-гк-516) гомозиготны по мутации в этом участке гена (табл. 3).
Для второго гена LuFAD3B был использован опубликованный ранее протокол для обнаружения мутации в первом экзоне [13]. Продукт амплификации имеет длину 468 п. н. При его секвенировании у мутантных аллелей линий гк-391 и гк-515 обнаружена замена в положении 6 (С ^ T) второго экзона, приводящая к замене Hys ^ Tyr. Показано, что использование рестриктазы BsaJl позволяет идентифицировать мутантную аллель. В пределах амплифицированного фрагмента аллели дикого типа присутствует два сайта для рестриктазы (рис. 5). При его расщеплении образуются фрагменты длиной 191, 240 и 37 п. н. Указанная выше мутация находится
в положении 431 продукта амплификации и затрагивает один из трех сайтов рестрикции, в результате чего образуются фрагменты длиной 191 и 277 (240 + 37) п. н. Так как продукт рестрикции 37 п. н. ВЛ-форм сливается с низкомолекулярными неспецифическими продуктами амплификации, создается ложное впечатление о различии ВЛ- и НЛ-форм по размеру большего продукта амплификации. Таким образом, CAPS-маркер, предложенный ранее для генотипа 593—708, может быть использован и для гк-391. С его помощью выяснено, что линии из НЛ-сортов Linola (гк-394), Eyre (гк-391, 420), Walaga (гк-395) и образца 858 (гк-515) гомозиготны по мутации в этом участке гена (табл. 4). На основе имеющихся в базе данных NCBI-последовательностей аллели гена LuFAD3B (KF026416) установлено, что сорт Amon имеет ту же точковую мутацию, что и гк-391.
Таблица 3
Полиморфизм линий льна по длине рестрикционных фрагментов (CAPS-маркеров) для гена ЬиГАОЗА
Номер каталога ВИР LIN, % Длина фрагмента (п. н.) Аллель Номер каталога ВИР LIN, % Длина фрагмента (п. н.) Аллель
1 2 1 2
Высоколиноленовые линии Среднелиноленовые линии
гк-2 58 330 100 д. т. гк-163 43 330 100 д. т.
гк-65 50 330 100 д. т. гк-119 33 330 100 д. т.
гк-483 66 330 100 д. т. гк-390 41 430 100 мут.
гк-448 67 330 100 д. т. гк-394 34 330 100 д. т.
гк-103 61 330 100 д. т. 391 х 65-2 36 430 100 мут.
гк-109 46 330 100 д. т. 391 х 109-2 14 430+330 100 д. т. + мут.
гк-121 58 330 100 д. т. 391 х 109-3 37 430 100 мут.
гк-136 61 330 100 д. т. 391 х 121-2 41 330 100 д. т.
гк-173 55 330 100 д. т. Низколиноленовые линии
гк-210 48 330 100 д. т. гк-523 6 430 100 мут.
гк-393 57 330 100 д. т. гк-391 5 430 100 мут.
гк-472 52 330 100 д. т. гк-441 2 430 100 мут.
гк-498 61 330 100 д. т. гк-420 3 430 100 мут.
гк-392 54 330 100 д. т. гк-395 2 430 100 мут.
391 х 65-1 51 330 100 д. т. гк-474 2 430 100 мут.
391 х 109-5 49 330 100 д. т. гк-512 3 430 100 мут.
391 х 121-1 46 430 100 мут. гк-513 2 430 100 мут.
391 х 173-1 66 330 100 д. т. гк-514 2 430 100 мут.
391 х 173-2 53 330 100 д. т. гк-515 3 430 100 мут.
гк-516 2 430 100 мут.
391 х 109-1 1 430 100 мут.
391 х 109-4 6 430 100 мут.
391 х 392-1 4 430 100 мут.
к-8677 2 430 100 мут.
к-8871 2 430 100 мут.
Таблица 4
Полиморфизм линий льна по длине рестрикционных фрагментов (CAPS-маркеров) для гена LuFAD3B
Номер каталога ВИР LIN, % Длина фрагмента (п. н.) Аллель Номер каталога ВИР LIN, % Длина фрагмента (п. н.) Аллель
1 2 1 2
Высоколиноленовые линии Среднелиноленовые линии
гк-2 58 240 191 д. т. гк-119 33 240 191 д. т.
гк-65 50 240 191 д. т. гк-390 41 240 191 д. т.
гк-109 46 240 191 д. т. гк-394 34 277 191 мут.
гк-136 61 240 191 д. т. Низколиноленовые линии
гк-173 55 240 191 д. т. гк-391 5 277 191 мут.
гк-393 57 240 191 д. т. гк-420 3 277 191 мут.
гк-395 2 277 191 мут.
гк-515 3 277 191 мут.
Одним из первых в ВИР поступил НЛ-сорт Eyre (Австралия), который был гетерогенен по генам НЛ. На его основе было получено несколько линий, но используется в гибридизации только одна (гк-391). С помощью полученных маркеров была подтверждена гомозиготность гибридов от скрещивания НЛ- (гк-391) и ВЛ-линий (см. табл. 3, рис. 5) по гену LuFAD3A. Гибриды F7 от скрещивания гк-391 х гк-109 (л-1, -3, -4), гк-391 х гк-65 (л-2) и Fg от скрещивания гк-391 х гк-392 (л-1) гомозиготны по рецессивной аллели гена LuFAD3A. Гибриды F9 гк-391 х гк-121 (л-1, 2), гк-391 х гк-121 (л-1) и F7 гк-391 х гк-65 (л-1), гк-391 х гк-109 (л-5) гомозиготны по доминантной аллели этого гена. Гибрид F7 л-2 (гк-391 х гк-109) оказался гетерозиготен по этому гену. Интересна линия л-2 из гк-391 х гк-121: по результатам анализа ДНК она гомозиготна по рецессивной аллели гена НЛ, но имеет пограничное содержание линоленовой кислоты, поэтому была отнесена нами к ВЛ, а не к СЛ. Таким образом, у родительской линии гк-121 существует какой-то другой способ незначительно повысить уровень линоленовой кислоты. Хотя в литературе описаны только два гена, отвечающие за синтез LIN, по нашим данным, генетическое окружение не менее важно.
НЛ-сорта, находящиеся в нашем распоряжении, позднеспелые и не адаптированы к условиям России, поэтому в задачу исследования входил отбор перспективных раннеспелых форм. Было показано, что гибриды, в родословной которых была линия гк-109, созревали на 8—10 дней раньше родительской НЛ-линии гк-391. Наиболее перспективны СЛ-линии л-3 и НЛ-линии л-1 и л-4 от скрещивания гк-391 х гк-109.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Линии генколлекции льна ВИР обладают широким разнообразием ЖКС масла. Резкое снижение синтеза линоленовой кислоты вызывает несимметричные изменения в соотношении ЖК, что сказывается на корре-
ляциях между ними и другими признаками. Факторный анализ четко разделил линии по уровню линоленовой кислоты и связанных с ним признакам. Были сконструированы праймеры, подобраны рестриктазы и разработан протокол эксперимента для идентификации аллелей гена LuFAD3A. Установлено, что все имеющиеся в коллекции ВИР НЛ-формы несут мутацию в первом экзоне (G255 х A255) этого гена. Тест-система [13], разработанная для идентификации мутации в первом экзоне гена LuFAD3B генотипа 593—708, может быть использована и для мутации во втором экзоне у гк-391 и др.
Четырех поколений инбридинга в большинстве случаев достаточно для отбора гомозиготных форм.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке программы ВИР № 0662-2018-0005 АААА-А16-116040710366-3 «Идентификация и картирование генофонда важнейших сельскохозяйственных культур, формирование генетических коллекций с ценными для селекции аллелями генов и локусами количественных признаков».
Авторы благодарят РЦ СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» и лично Е.Ю. Горо-дилову и А.Э. Машарского за содействие в проведении секвенирования ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Viju C, Yeung MT, Kerr WA. Post-moratorium EU regulation of genetically modified products: triffid flax. CATPRN Commissioned Paper. 2011;(3):1-30.
2. ФАОСТАТ. Сельскохозяйственные культуры: "crops processed", element: "Area harvested", "Yield" crops: linseed, flax [cited 2017 Dec 15]. Available from: http://www.fao.org/faostat/ru/#data/QC. Ссылка активна на 15.12.2017.
3. Лукомец В.М., Зеленцов С.В., Кривошлыков К.М. Перспективы и резервы расширения производства
масличных культур в Российской Федерации // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - 2015. - № 4. - С. 81-102. [Luko-mets VM, Zelentsov SV, Krivoshlykov KM. Outlook and reserves the expansion of oil crops production in the Russian Federation. Oil crops. Scientific and Technical Bulletin VNIIMK. 2015;(4):81-102. (In Russ.)]
4. Кутузова С.Н. Лен // Генетика культурных растений. - СПб.: ВИР, 1998. - C. 6-52. [Kutuzova SN. Len. In: Genetika kul'turnykh rastenii. St. Petersburg: VIR; 1998. P. 6-52. (In Russ.)]
5. Сорта растений, включенные в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию Сорта культуры «Лен-долгунец». [Sorta rasteniy, vklyuchennye v Gosudarstvennyy reestr selektsionnykh dostizheniy, dopushchennykh k ispol'zovaniyu Sorta kul'tury "Len-dolgunets" (In Russ.)]. Доступно по: http://reestr.gossort.com/ reestr/ culture/133. Ссылка активна на 28.01.2018.
6. Рожмина Т.А., Лошакова Н.И. Образцы прядильного и масличного льна (Linum usitatissimum L.) — источники эффективных генов устойчивости к фузариозному увяданию и ее зависимость от температуры // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. - № 3. - С. 310-317. [Ro-zhmina TA, Loshakova NI. New sources of effective resistance genes to fusarium wilt in flax (Linum usitatissimum L.) depending on temperature. Agricultural biology. 2016;51(3):310-317. (In Russ.)]
7. Каталог мировой коллекции ВИР. Лен (характеристика образцов по биохимическим показателям). -Вып. 775. - СПб.: ВИР; 2006. - 80 с. [Katalog mirovoi kollektsii VIR. Len (kharakteristika obraztsov po biokhimicheskim pokazatelyam). Issue 775. Saint Petersburg: VIR; 2006. 80 p. (In Russ.)]
8. Тутельян В.А., Батурин А.К., Гаппаров М.Г., и др. Рациональное питание, нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации: Методические рекомендации. - М., 2008. -39 с. [Tutel'yan VA, Baturin AK, Gapparov MG, et al. Ratsional'noye pitaniye, normy fiziologicheskikh potrebnostei v energii i pishchevykh veshchestvakh dlya razlichnykh grupp naseleniya Rossiiskoi Feder-atsii. Metodicheskiye rekomendatsii. Moscow; 2008. 39 p. (In Russ.)]
9. Green AG. Genetic control of polyunsaturated fatty acid biosynthesis in flax (Linum usitatissimum) seed oil. Theor Appl Genet. 1986;72(5):654-661. https:// doi.org/10.1007/BF00289004.
10. Porokhovinova E, Shelenga T, Kosykh L, et al. Biochemical diversity of fatty acid composition in flax from VIR's genetic collection and effect of environment on its development. Russ J Genet Appl Res. 2017;7(6):626-639. https://doi.org/10.1134/S2079059717060107.
11 .Thambugala D, Duguid S, Loewen E, et al. Genetic variation of six desaturase genes in flax and their impact on fatty acid composition. Theor Appl Genet. 2013; 126( 10):2627-2641. https://doi.org/l0.1007/ s00122-013-2161-2.
12. Krasowska A, Dziadkowiec D, Polinceusz A, et al. Cloning of flax oleic fatty acid desaturase and its expression in yeast. J Am Oil Chem Soc. 2007;84(9):809-816. https://doi.org/10.1007/s11746-007-1106-9.
13.Vrinten P, Hu Z, Munchinsky MA, et al. Two FAD3 desaturase genes control the level of linolenic acid in flax seed. Plant Physiol. 2005;139(1):79-87. https:// doi.org/10.1104/pp.105.064451.
14.Fofana B, Duguid S, Cloutier S. Cloning of fatty acid biosynthetic genes — ketoacyl CoA synthase, fatty acid elongase, stearoyl-ACP desaturase, and fatty acid desaturase and analysis of expression in the early developmental stages of flax (Linum usitatissimum L.) seeds. Plant Sci. 2004;166(6):1487-1496. https://doi. org/10.1016/j.plantsci.2004.01.025.
15. You FM, Li P, Kumar S, et al. Genome-wide identification and characterization of the gene families controlling fatty acid biosynthesis in flax (Linum usitatissimum L.). J Proteomics Bioinform. 2014;7(10):310-326. https:// doi.org/10.4172/jpb.1000334.
16. Пороховинова Е.А. Генетический контроль морфологических признаков проростков, плода и семян у льна (Linum usitatissimum) // Вавиловский журнал генетики и селекции. — 2012. — Т. 16. — № 4—2. — С. 936—947. [Porokhovinova EA. Genetic control of morphological characters of seedlings, bolls, and seed in flax (Linum usitatissimum). Vavilov journal of genetics and breeding. 2012;16(4-2):936-947. (In Russ.)]
17. Пороховинова Е.А. Изучение наследования окраски и формы цветка и семян, а также ее связи с продолжительностью фазы всходы — цветение у льна (Linum usitatissimum L.) // Научно-технический бюллетень ВНИИР им. Н.И. Вавилова. - 2000. -№ 239. - С. 56-58. [Porokhovinova EA. Izuche-nie nasledovaniya okraski i formy tsvetka i semyan, a takzhe ee svyazi s prodolzhitel'nost'yu fazy vskhody-tsvetenie u l'na (Linum usitatissimum L.). Nauchno-tekhnicheskiy byulleten' VNIIR im. N.I. Vavilova. 2000;(239):56-58. (In Russ.)]
18. Брач Н.Б., Пороховинова Е.А. Метод сравнительного анализа результатов изучения количественных признаков образцов, выращенных в различные годы (метод приведенных средних) // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 2011. -Т. 167. - С. 36-40. [Brutch NB, Porokhovinova EA. Method of comparative analysis used to access the results of evaluating quantitative characters of plant accessions grown in different years (method of reduced average values). Proceedings of applied botany, genetics and breeding. 2011;167:36-40. (In Russ.)]
19. StatSoft, Inc. (2013) Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK: StatSoft. Available at: http://www.statsoft. com/textbook/. Accessed November 14, 2018.
20. Наследов А.Д. Математические методы психологического исследования. Анализ и интерпретация данных. - СПб.: Речь, 2012. - 392 с. [Nasledov AD. Matematicheskiye metody psikhologicheskogo issle-dovaniya. Analiz i interpretatsiya dannykh. St. Petersburg: Rech'; 2012. 392 p. (In Russ.)]
21. Ивантер Э.В., Коросов А.В. Введение в количественную биологию. — Петрозаводск: Изд-во Петрозаводского ун-та, 2003. — 203 с. [Ivanter EV, Korosov AV. Vvedeniye v kolichestvennuyu biologiyu. Petrozavodsk: Izdatel'stvo Petrozavodskogo universite-ta; 2003. 203 p. (In Russ.)]
22. Ростова Н.С. Корреляции: структура и изменчивость. — СПб.: Изд-во СПбГУ, 2002. — 307 с. [Rostova NS. Korrelyatsii: struktura i izmenchivost'. Saint Petersburg: Izdatel'stvo SPBGU; 2002. 307 p. (In Russ.)]
23. Злотина М.М., Киселева А.А., Потокина Е.К. Использование аллель-специфичных маркеров генов Vrn и Ppd для экспресс-диагностики фотопериодической чувствительности и потребности в яровизации мягкой пшеницы и ячменя: Методические указания. — СПб.: ВИР, 2012. — 29 с. [Zlotina MM, Kiseleva AA, Po-tokina EK. Ispol'zovaniye allel'-spetsifichnykh markerov
& Информация об авторах
Елизавета Александровна Пороховинова — канд. биол. наук, старший научный сотрудник, отдел ГР масличных и прядильных культур. ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)», Санкт-Петербург. SPIN: 5033-3263. E-mail: e.porohovinova@mail.ru.
Татьяна Васильевна Шеленга — канд. биол. наук, старший научный сотрудник, отдел биохимии. ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)», Санкт-Петербург. E-mail: tatianashelenga@yandex.ru.
Татьяна Валерьевна Матвеева — д-р биол. наук, профессор, кафедра генетики и биотехнологии. ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. SPIN: 3877-6598. E-mail: radishlet@gmail.com.
Андрей Валерьевич Павлов — канд. с-х. наук, старший научный сотрудник, отдел ГР масличных и прядильных культур. ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)», Санкт-Петербург. E-mail: avpavlov77@yandex.ru.
Елизавета Александровна Григорьева — магистрант, лаборатория мониторинга генетической эрозии растительных ресурсов. ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)», Санкт-Петербург. E-mail: e.grigoreva@vir.nw.ru.
Нина Борисовна Брач — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, отдел ГР масличных и прядильных культур. ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)», Санкт-Петербург. SPIN: 1753-4382. E-mail: n.brutch@vir.nw.ru.
genov Vrn i Ppd dlya ekspress-diagnostiki fotoperiod-icheskoi chuvstvitel'nosti i potrebnosti v yarovizatsii my-agkoi pshenitsy i yachmenya. Metodicheskie ukazaniya. Saint Petersburg: VIR; 2012. 29 p. (In Russ.)]
24. Сокорнова С.В., Гасич Е.Л., Бемова В.Д., Матвеева Т.В. Поиск и видовая идентификация патогенов природно-трансгенного вида Linaria vulgaris // Экологическая генетика. — 2018. — Т. 16. — № 1. — С. 27—34. [Sokornova SV, Gasich EL, Bemova VD, Matveeva TV. Characterization and identification of naturally transgenic species Linaria vulgaris pathogenic mycromycetes. Ecological genetics. 2018;16(2):27-34. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/ecogen16127-34.
25. Integrated DNA technologies. Available at: https:// eu.idtdna.com. Accessed November 14, 2018.
26. Notredame C, Higgins DG, Heringa J. T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J Mol Biol. 2000;302(1):205-217. https:// doi.org/10.1006/jmbi.2000.4042.
27. Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol. 2016;33(7): 1870-1874. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054.
28. Okonechnikov K, Golosova O, Fursov M, the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012;28(8):1166-1167. https://doi. org/10.1093/bioinformatics/bts091.
•Ш Information about the authors
Elizaveta A. Porokhovinova — PhD, Senior Researcher, Oil and Fibre Crops Department. Federal Research Centre the N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), St. Petersburg, Russia. SPIN: 5033-3263. E-mail: e.porohovinova@mail.ru.
Tatyana V. Shelenga — PhD, Leader Researcher, Department of Biochemistry and Molecular Biology. Federal Research Centre the N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), St. Petersburg, Russia. E-mail: tatianashelenga@ yandex.ru.
Tatyana V. Matveeva — Doctor of science, Professor, Chair of Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University, St. Petersburg, Russia. SPIN: 3877-6598. E-mail: radishlet@gmail.com.
Andrey V. Pavlov — PhD, Senior Researcher, Oil and Fibre Crops Department. Federal Research Centre the N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), St. Petersburg, Russia. E-mail: avpavlov77@yandex.ru.
Elizaveta A. Grigorieva — Master Student, Laboratory of Monitoring Genetic Erosion. Federal Research Centre the N.I. Vavilov All -Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), St. Petersburg, Russia. E-mail: e.grigoreva@vir.nw.ru.
Nina B. Brutch — Doctor of Science, Main Researcher, Oil and Fibre Crops Department. Federal Research Centre the N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), St. Petersburg, Russia. SPIN: 1753-4382. E-mail: n.brutch@vir.nw.ru.
