CC BY
120
А. А. Моисеев1, А. В. Хрунин2, Е. М. Павлюшина3, Н. А. Пирогова1,
В. А. Горбунова1, С. А. Лимборская2 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ГЛУТАТИОН-Б-ТРАНСФЕРАЗ И РЕЗУЛЬТАТЫ ХИМИОТЕРАПИИ РАКА ЯИЧНИКОВ
1 НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Институт молекулярной генетики РАН, Москва 3 Кафедра оториноларингологии ММА им. И. М. Сеченова, Москва
Глутатион^-трансферазы участвуют в инактивации многих цитостатиков, включая цисплатин. Полиморфизм кодирующих их генов может влиять на эффективность и токсичность химиотерапии. Мы изучили полиморфизм генов GSTP1 (Пе105Уа1, А1аи^а1), GSTA1 (-69С / Т), GSTM1 и GSTT1 (делеции) у 80 больных раком яичников, получавших цисплатин и циклофосфамид. Отмечена ассоциация полиморфизма GSTP1 Пе10^а1 и времени до прогрессирования: при генотипе 11е / 11е оно было статистически значимо больше, чем при генотипах 11е / Val и Val / Val. Медиана продолжительности жизни не была достигнута ни в одной из групп, однако наблюдалась тенденция к ее увеличению в случае генотипа 11е / 11е. Кроме того, выявлено снижение риска развития клинически значимой анемии у больных с делецией гена GSTM1.
Ключевые слова: рак яичников, химиотерапия, цисплатин, глутатион^-трансфераза.
Одна из основных тенденций современной химиотерапии — выработка индивидуального подхода к подбору цитостатиков, направленного на повышение эффективности и ограничение токсичности лечения. Традиционные прогностические факторы не позволяют прогнозировать, какие препараты окажутся эффективными у данного больного, и их выбор носит в известной мере эмпирический характер, из-за чего может постепенно развиваться полирезистентность опухоли, а больной испытывает постоянно усиливающиеся побочные действия. При этом переносимость лечения варьирует в широких пределах. Расчеты показывают, что почти 95% индивидуальных различий в эффективности и токсичности цитостатиков могут быть генетически обусловленными [3].
Рак яичников относится к опухолям со сравнительно высокой чувствительностью к химиотерапии, особенно к препаратам платины. В то же время у многих больных стандартные схемы изначально оказываются неэффективными или вызывают тяжелые побочные эффекты. Настоящее исследование направлено на изучение генетических факторов, которые позволили бы прогнозировать чувствительность опухоли к цисплатину и риск развития тяжелых осложнений.
Один из ключевых факторов, влияющих на цито-токсическое действие цисплатина, — инактивация его активных метаболитов внутри клетки путем связыва-
© Моисеев А. А., Хрунин А. В., Павлюшина Е. М., Пирогова Н. А., Горбунова В. А., Лимборская С. А., 2008 УДК 618.11-006.6-085.277.3:577.21
ния с тиоловыми группами глутатиона, в результате чего образуется нетоксичный конъюгат, выводимый из клетки. Эти реакции катализируются глутатион^-трансферазами [14]. У человека описаны несколько изоформ этих ферментов (А1, М1, Р1, Т1 и др.), каждая из которых кодируется своим геном (соответственно GSTA1, GSTM1, GSTP1 и GSTT1).
Гены глутатион^-трансфераз характеризуются выраженным природным полиморфизмом, обусловленным различиями в последовательности нуклеотидов. Наиболее изучен делеционный полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1, при котором соответствующие белки не образуются. Полиморфизм других генов (GSTA1, GSTP1 и др.) представлен главным образом однонуклеотидными заменами. Примерно 50% лиц европеоидной расы — гомозиготы по делеции гена GSTM1, около 15% — по делеции гена GSTT1. Для гена GSTP1 описаны два распространенных полиморфизма: Пе10^а1 (замена изолейцина на валин в 105-м положении) и А1аи^а1 (замена аланина на валин в 114-м положении). Аллель GSTP1105Val достаточно распространен: он имеется почти у 50% лиц европеоидной расы, причем 10—15% составляют гомозиготы; аллель GSTP1114Val более редок. Полиморфизм гена GSTPA1 —69С / Т заключается в замене цитозина на тимин в промоторе, в результате чего снижается уровень экспрессии гена и образуется меньше белка, хотя его структура не меняется. За счет этих полиморфизмов детоксикационная способность глутатионтрансфераз у некоторых людей оказывается существенно сниженной, что может повышать чувствительность к химиотерапии и при этом ухудшать ее переносимость [9].
В представленной работе мы изучили влияние вариантов вышеописанного полиморфизма генов глутатион-S-трансфераз на токсичность и эффективность циспла-тина при лечении больных раком яичников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клиническая часть работы проходила в отделении химиотерапии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. В исследование включали женщин моложе 65 лет с верифицированным эпителиальным раком яичников, независимо от стадии. После подписания информированного согласия на лечение больные проходили обследование для оценки распространенности опухоли (осмотр гинеколога, УЗИ брюшной полости и малого таза и определение маркера CA-125; при необходимости — другие исследования).
Перед началом химиотерапии больные сдавали кровь для генетического анализа. Образцы доставляли в Институт молекулярной генетики РАН, где из цельной крови методом фенолхлороформной экстракции [10] выделяли ДНК. Полиморфные районы генов GSTA1, GSTM1, GSTP1 и GSTT1 амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием следующих праймеров: 5'-TGT TGA TTG TTT GCC TGA AAT T-3' и 5'-GTT AAA CGC TGT CAC CGT CCT-3' (GSTA1) [2]; 5'-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3' и 5'-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3' (GSTM1) [1]; 5'-GTA GTT TGC CCA AGG TCA AG-3' и 5'-AGC CAC CTG AGG GGT AAG-3' (GSTP1 Ile105Val) [5]; 5'-ACA GGA TTT GGT ACT AGC CT-3' и 5'-AGT GCC TTC ACA TAG TCA TCC TTG CGC-3' (GSTP1 A!a114Val) [13]; 5'-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3' и 5'-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3' ( GSTT1 ) [1].
Для амплификации фрагментов генов GSTT1 и GSTM1 проводили мультиплексную ПЦР, в которой в качестве внутреннего контроля использовали амплификацию участка 4-го экзона гена GTP-циклогидролазы 1 (праймеры: 5'-GTC CTT TTT GTT TTATGA GGA AGG C-3' и 5'-GGT GAT GCA CTC TTA TAA TCT CAG C-3'). Продукты мультиплексной ПЦР непосредственно использовали для анализа генотипов GSTT1 и GSTM1. Для генов GSTA1 и GSTP1 продукты ПЦР подвергали расщеплению с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции (Eam1104I [2], Alw26I [5] и Bsh1236I [13], «Fermentas AB», Вильнюс, Литва) с последующим генотипированием тестируемых полиморфных локусов, основанном на оценке различия длин рестрикционных фрагментов. Анализ продуктов амплификации и рестрикции проводили с помощью электрофореза в 2,5% агарозном геле.
Все больные получали одну и ту же стандартную химиотерапию по схеме цисплатин, 100 мг/м2, + циклофос-фамид, 600 мг/м2. После каждых 2 курсов назначали обследование для оценки эффекта (включая УЗИ брюшной полости и малого таза и определение CA-125, по показаниям — другие методы); во время каждого курса регистрировали побочные действия на основании клинических
данных, результатов анализов крови и аудиологического исследования. Аудиометрию проводили с помощью аппарата МА-31 фирмы «РгасПгошк» (Германия) по стандартной методике. Лечение завершали после 6 курсов, а также в случае тяжелой токсичности или прогрессирования заболевания (таким больным назначали химиотерапию 2-й линии вне рамок исследования). Больные, завершившие химиотерапию, переходили в период наблюдения для оценки времени до прогрессирования и продолжительности жизни.
Полученные данные были сопоставлены с результатами генетического анализа. Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия %2, для малых выборок рассчитывали точный критерий Фишера. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Кривые продолжительности жизни были построены по методу Каплана—Мейера, для сравнения между группами использовали логранговый критерий.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В течение 2003—2006 гг. в исследование были включены 80 больных в возрасте 23—65 лет (медиана 52 года). Исключены были 3 больные: у одной был выявлен сопутствующий хронический миелолейкоз, двое отказались от лечения после первого цикла. Таким образом, анализировали данные 77 больных.
Распределение по стадиям рака яичников было следующим: I стадия — 12 больных, II стадия — 5, III стадия — 50 и IV стадия — 10. Химиотерапию до операции получали 24 больных, после операции — 53. В последней группе у 19 больных химиотерапия была адъювантной (после радикальной операции), у 34 — лечебной (после операции сохранялась остаточная опухоль или повышенный уровень маркера СА-125). Соответственно эффект химиотерапии подлежал оценке у 58 больных.
Результаты генетического анализа представлены в таблице.
Сопоставление генетических данных с параметрами эффективности и токсичности химиотерапии позволило выявить ассоциацию полиморфизма гена GSTP1 Пе10^а1 с результатами химиотерапии. Статистически значимыми оказались различия по времени до прогрессирования между гомозиготами по аллелю GSTP1105Пе (генотип Пе / Пе), гетерозиготами (генотип Пе / Val) и гомозиготами по аллелю GSTP1105Val (генотип Val / Val) (%2, р = 0,029; рис. 1). Наиболее заметными были различия между группами Не / Пе и Пе / Val (логранговый критерий, р = 0,0016). При этом обращало на себя внимание расхождение кривых после 1-го года наблюдения. Медиана времени до прогрессирования в группе Пе / Пе не была достигнута, в группе Пе / Val составила лишь 9 мес, в группе Val / Val — 18 мес. Медиана продолжительности жизни не была достигнута ни в одной из групп, однако отмечалась тенденция к ее увеличению у женщин с генотипом Пе / Пе, у которых расхождение кривых начиналось через 2 года (рис. 2).
Таблица
Распределение обследованных больных по генотипам
Полиморфизм Генотип Число больных
GSTP1 ііе105Уаі ііе / ііе 33
ііе / Уаі 37
Уаі / Уаі 7
GSTP1 Аіа114Уаі Аіа / Аіа 60
Аіа / Уаі 17
Уаі / Уаі 0
GSTA1 -69С / Т С / С 36
С / Т 32
Т/Т 9
GSTM1 сіеі - / - 36
+ / -, + / + 41
GSTT1 Сеі - / - 15
+ / -, + / + 62
Зависимость между непосредственной эффективностью химиотерапии и тем или иным полиморфизмом отсутствовала.
При сопоставлении параметров токсичности (лейко-и нейтропении, тромбоцитопении, анемии, тошноты и рвоты, нейро-, ото- и нефротоксичности) с исследованными полиморфизмами гена GSTP1 статистически значимые корреляции не выявлены. В то же время отмечен повышенный риск ототоксичности у гомозигот по аллелю GSTP1105VaI: снижение слуха было выявлено у 4 из 7 женщин с таким генотипом (по данным аудиометрии, в одном случае — III степени, в 2 — II степени и в одном — I степени). При этом у гомозигот по аллелю GSTP1105Пе (генотип Пе / Пе) это осложнение наблюдалось в 7 случаях из 33, а при генотипе Не / VaI — в 5 случаях из 37.
Наконец, обнаружена связь клинически значимой анемии (II степени и более) с наличием нормального гена GSTM1, тогда как при делеции этого гена указанное осложнение встречалась реже (%2, р = 0,016). Полиморфизм генов GSTA1 и GSTT1 не коррелировал с исследованными параметрами токсичности и эффективности химиотерапии.
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные нами данные свидетельствуют о существенном сокращении времени до прогрессирования и,
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
6 12 18 24 30 36 42
Время от начала химиотерапии, мес
48
Рисунок 1. Время до прогрессирования в зависимости от полиморфизма гена ОЭТР1 Ile105Val. Черными квадратами отмечены больные с прогрессированием, белыми — больные без прогрессирования заболевания.
1 — 11е / 11е; 2 — Уа! / Уа!; 3 — Уа! / 11е.
возможно, продолжительности жизни у больных раком яичников при наличии аллеля GSTP1105Val. Этот результат может иметь большое практическое значение и поэтому заслуживает подробного обсуждения.
Среди глутатион^-трансфераз изофермент Р1 наиболее активен в нормальных и опухолевых тканях, поэтому полиморфизм гена GSTP1 способен заметно изменять суммарную активность этой ферментной системы.
Время от начала химиотерапии, мес
Рисунок 2. Продолжительность жизни в зависимости от полиморфизма гена ОЭТР1 Ile105Val. Черными квадратами отмечены умершие больные, белыми — больные, которые живы.
1 — 1!е / 1!е; 2 — Уа! / 1!е.
2
3
0
Однако конечный эффект зависит от варианта аминокислотной замены, которая может приводить к снижению активности фермента в отношении одних субстратов и ее увеличению в отношении других. В эксперименте in vitro аллель GSTP1105Val защищал Escherichia coli от действия цисплатина и карбоплатина лучше, чем аллель GSTP1105Ile, при использовании же алкилирующих средств результаты были противоположными [6]. Клинические исследования дали неоднозначные результаты. Показано, что аллель GSTP1105Val улучшал результаты химиотерапии рака молочной железы с использованием алкилирующих средств [16], в то же время он был сопряжен со снижением продолжительности жизни при раке пищевода и яичников у больных, получавших схемы с цисплатином [4; 8]. Кроме того, у носителей аллеля GSTP1105Val отмечалось снижение риска нейро- и ототоксичности на фоне схем с цисплатином и оксалиплатином [7; 11]. Указанные результаты согласуются с экспериментальными данными о повышенной способности фермента, кодируемого аллелем GSTP1105Val, к инактивации цисплатина [6]. Однако в ряде работ аллель GSTP1105Val увеличивал чувствительность к оксалиплатину и продолжительность жизни при раке толстой кишки [12; 15].
Данные, полученные в настоящем исследовании, указывают на отрицательное влияние аллеля GSTP1105Val на результаты химиотерапии при раке яичников. Кажущееся противоречие с некоторыми данными литературы [12; 15] может объясняться различиями в механизме цитотоксичности цисплатина и оксалиплатина. Можно предположить, что описанная в эксперименте [6] повышенная способность фермента, кодируемого аллелем GSTP1105Val, к инактивации цисплатина и карбоплатина не распространяется на оксалиплатин. В таком случае оксалиплатин может оказаться удачной альтернативой цисплатину у носителей аллеля GSTP1105Val. Несомненно, эта гипотеза нуждается в экспериментальной и клинической проверке.
Нам не удалось обнаружить защитного действия аллеля GSTP1105Val в отношении нейротоксичности и ото-токсичности, на которое указывали другие авторы [7; 11]. Более того, у гомозигот по этому аллелю нарушение слуха возникало даже чаще, чем при остальных генотипах, хотя различия не были статистически значимыми.
Снижение риска анемии при делеции GSTM1 оказалось несколько неожиданным: теоретически можно было ожидать усиления токсического действия цисплатина у таких больных. Мы не обнаружили данных литературы о влиянии гена GSTM1 на риск развития анемии. Так или иначе, прежде чем обсуждать клиническую значимость этой ассоциации, необходимо ее подтверждение в других работах.
Отсутствие корреляции результатов химиотерапии с полиморфизмом GSTP1 A!a114Val может объясняться низкой распространенностью аллеля GSTP1114Val: в изученной группе больных не было обнаружено ни одной гомо-
зиготы по нему. В то же время вклад других изоформ (A1 и T1) в суммарную активность глутатион-Я-трансфераз может быть не столь велик, чтобы отсутствие или снижение активности одного из них существенно влияло на способности организма к детоксикации цисплатина.
В любом случае в перспективе исследование системы глутатион-Я-трансфераз — наряду с другими генетическими факторами — может помочь при выборе оптимального режима химиотерапии, позволит достичь максимального противоопухолевого эффекта и снизить риск осложнений.
Работа выполнена при поддержке программ. «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки — медицине» Российской академии наук, грантов Президента РФ (МК-3955.2007.4) и РФФИ (№ 0704-00027).
ЛИТЕРАТУРА
1. Попов С. Н., Сломинский П. А., Галушкин С. Н. и др. Полиморфизм глутатион-Б-трансфераз М1 и Т1 в ряде популяций России // Генетика. — 2001. — Т. 38. — С. 281—284.
2. Coles B. F, Morel F, Rauch C. et al. Effect of polymorphism in the human glutathione S-transferase A1 promoter on hepatic GSTA1 and GSTA2 expression // Pharmacogenetics. — 2001. — Vol. 11. — P. 663—669.
3. Evans W. E., McLeod H. L. Pharmacogenomics — drug disposition, drug targets, and side effects // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 348. — P. 538—548.
4. Howells R. E., Dhar K. K., Hoban P. R. et al. Association between glutathione-S-transferase GSTP1 genotypes, GSTP1 over-expression, and outcome in epithelial ovarian cancer // Int. J. Gynecol. Cancer. —
2004. — Vol. 14. — P. 242—250.
5. Ishii T., Matsuse T., Teramoto S. et al. Glutathione S-transferase P1 (GSTP1) polymorphism in patients with chronic obstructive pulmonary disease // Thorax. — 1999. — Vol. 54. — P. 693—696.
6. Ishimoto T. M., Ali-Osman F. Allelic variants of the human glutathione S-transferase P1 gene confer differential cytoprotection against anticancer agents in E. coli // Pharmacogenetics. — 2002. — Vol. 12. — P. 543—553.
7. Lecomte T., Landi B., Beaune P. et al. Glutathione S-Transferase P1 polymorphism (Ile105Val) predicts cumulative neuropathy in patients receiving oxaliplatin-based chemotherapy // Clin. Cancer Res. — 2006. — Vol. 12. — P. 3050—3056.
8. Lee J. M., Wu T. M., Lee Y. C. et al. Association of GSTP1 Polymorphism and Survival for Esophageal Cancer // Clin. Cancer Res. —
2005. — Vol. 11. — P. 4749—4753.
9. Mcllwain C. C., Townsend D. M., Tew K. D. Glutathione S-trans-ferase polymorphisms: cancer incidence and therapy // Oncogene. —
2006. — Vol. 25. — P. 1639—1648.
10. Milligan B. G. Total DNA isolation / Hoelzel A. R. (ed.). Molecular genetic analysis of populations. — London: Oxford University Press, 1998. — P. 29—60.
11. Oldenburg J., Kraggerud S. M., Cvancarova M. et al. Cisplatin-in-duced long-term hearing impairment is associated with specific glutathione S-transferase genotypes in testicular cancer survivors // J. Clin. Oncol. — 2007. — Vol. 25. — P. 708—714.
12. Ruzzo A., Graziano F., Loupakis F. et al. Pharmacogenetic profiling in patients with advanced colorectal cancer treated with first-line FOLFOX4 chemotherapy // J. Clin. Oncol. — 2007. — Vol. 25. — P. 1247—1254.
13. Saarikoski S. T., Voho A., Reinikainen1 M. et al. Combined effect of polymorphic GST genes on individual susceptibility to lung cancer // Int. J. Cancer. — 1998. — Vol. 77. — P. 516—521.
14. Siddik Z. H. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance // Oncogene. — 2003. — Vol. 22. — P. 7265—7279.
15. Stoehlmacher J., Park D. J., Zhang W. et al. Association between glutathione S-transferase P1, T1, and M1 genetic polymorphism and survival of patients with metastatic colorectal cancer // J. Nal. Cancer. Inst. — 2GG2. — Vol. 94. — P. 9Зб—94З.
ferase P1 Ile105Val polymorphism // Cancer Res. — 2GGG. — Vol. б0. — P. 5б21—5б27.
16. Sweeney C., McClure G. Y., Fares M. Y. et al. Association between survival after treatment for breast cancer and glutathione S-trans-
Поступила 05.07.2007
A. A. Moiseyev1, A. V. Khrunin2, E. M. Pavlyushina3, N. A. Pirogova1,
V. A. Gorbunova1, S. A. Limborskaya2 POLYMORPHISM OF GLUTATHIONE-S-TRANSPHERASE GENES AND OUTCOMES OF CHEMOTHERAPY IN OVARIAN CANCER
1 Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow
2 Molecular Genetics Institute RAS, Moscow
3 Chair of Otorhinolaryngology, I. M. Sechenov MMA, Moscow
Glutathione-S-transpherases play a considerable role in activation of many cytostatics including cisplatin. Polymorphism of glutathione-S-transpherase encoding genes may have effect on chemotherapy efficacy and toxicity. We studied polymorphism of GSTP1 (Ile105Val, Ala114Val), GSTA1 (-69C/T), GSTM1 and GSTT1 (deletions) in 80 women with ovarian cancer receiving cisplatin and cyclophosphamide. GSTP1 Ile105Val polymorphism was associated with a shorter time to disease progression: patients with Ile/Ile had a significantly longer progression-free survival as compared to those with Ile/Val or Val/Val genotypes. Median overall survival was not reached in either group though there was a trend in favor of Ile/Ile carriers. Patients with GSTM1 deletion had a lower risk of clinically significant anemia.
Key words: ovarian cancer, chemotherapy, cisplatin, glutathione-S-transpherase.
бЗ
