CC BY
199
А.В. Ефремов, Е.Н. Березикова, С.Н. Шилов, И.Д. Сафронов, Е.Н. Самсонова, М.Г. Пустоветова
Полиморфизм генов ФНО-а, ИЛ-Iß , iNOS и особенности системной воспалительной реакции у больных с хронической сердечной недостаточностью
ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, 630091, Новосибирск, Красный просп., 52 patfiz_ngmu@mail.ru
УДК 616.12-008.46:575.174. 015.3
ВАК 14.01.05
Поступила в редакцию 15 июня 2011 г.
© А.В. Ефремов, Е.Н. Березикова, С.Н. Шилов, И.Д. Сафронов, Е.Н.Самсонова, М.Г. Пустоветова, 2011
В исследовании были изучены влияние полиморфных вариантов гена ФНО-а, ИЛ-1 в, индуцибельной N0-0/1^331=1 (iNOS) (ССТТТ)п на риск развития и тяжесть течения ХСН. У 226 пациентов с ХСН разной тяжести производился забор генетического материала (букальный эпителий) с последующим типи-рованием аллелей гена ФНО-а, ИЛ-1 в, (iNOS) (ССТТТ)п. Были выявлены ассоциации между аллелями и различных генотипов гена ФНО-а ^-308А), ИЛ-1 в (С+3953Т) и гена iNOS (ССТТТ)п как с повышенным риском развития и тяжестью течения ХСН, так и с индивиуально низким риском возникновения ХСН. Ключевые слова: хроническая сердечная недостаточность; полиморфизм генов.
Хорошо известно, что своевременная профилактика и ранняя диагностика различных заболеваний являются самыми актуальными проблемами современной медицины. Примечательно, что использование современных достижений в исследовании генома человека в клинической кардиологии сделали реальной раннюю, досимптомную диагностику не только генных, но и многих мультифакториальных заболеваний [1, 2].
В клинической практике такая цель достигается посредством молекулярного тестирования генов, получивших название генов «предрасположенности» или кандидат-ных генов [2, 12]. Последние можно определить как гены, наследственные полиморфизмы которых совместимы с жизнью, но в сочетании с неблагоприятными внешними факторами (например, лекарств, продуктов питания, вредных привычек, инфекции, загрязнений окружающей среды) могут послужить причиной различных, в том числе и таких частых патологических состояний и заболеваний, как атеросклероз, ИБС, сахарный диабет и т. д.
Таким образом, из приведенных данных следует, что такое направление в кардиологии подвергается интенсивному изучению и исследованию с целью выявления генетического риска и прогнозирования осложнений заболевания до появления клинических проявлений.
Недавно была предложена новая концепция развития хронической сердечной недостаточности (ХСН), в основе которой лежит парадигма о системном воспалении как об одном из важных независимых факторов высокого кардиоваскулярного риска [5, 7].
Согласно этой концепции, неспецифическая активация макрофагов и моноцитов, реализующаяся при тяжелых стрессорных нарушениях микроциркуляции, является индуктором синтеза провоспалительных цитокинов (в частности, фактора некроза опухоли-а (ФНО-а), а также интерлейкина-1а (ИЛ-1а), интерлейкина-1 в (ИЛ-1 в), интерлей-кина-6 (ИЛ-6) и др.), определяющих неблагоприятное развитие либо регресс ишеми-ческой и/или постинфарктной дисфункции сердца, ремоделирование левого желудочка (ЛЖ) и развитие ЛЖ-сердечной недостаточности [5, 7]. При этом повышение экспрессии провоспалительных цитокинов напрямую связано с ФК тяжести ХСН и тесно коррелирует с концентрацией предсерд-ного натрийуретического пептида, а также некоторых других нейрогормонов [7, 11].
Такие цитокины воспаления, как интер-лейкин-1, ФНО-а, интерфероны, стимулируют синтез оксида азота (N0) в кардиоми-оцитах путем индукции индуцибельной N0-синтазы (iN0S) [8]. Оксид азота, индуцированный цитокинами, оказывает отрицательный хронотропный эффект на кар-
диомиоциты [10]. Кроме того, показано, что оксид азота способствует развитию гипертрофии кардиомиоци-тов и вызывает их апоптоз [14], что приводит к прогрес-сированию ХСН. По данным литературы, имеются указания на более выраженное негативное влияние iNOS на инотропную функцию ремоделированного миокарда [3], хотя влияние структурного полиморфизма гена iNOS фактически не изучалось у больных ХСН.
В последние годы научные исследования механизмов инициации и прогрессирования ХСН направлены на оценку генетических факторов развития этого синдрома. Это перспективный подход в связи с тем, что выявляется генетический риск и прогнозируются осложнения заболевания до появления клинических проявлений. Учитывая современные достижения в изучении патогенеза ХСН, можно предположить влияние полиморфизмов генов, кодирующих провоспалительные цитокины, в частности цито-кинов ФНО-а и ИЛ-1, на развитие ХСН. Целью нашей работы было изучить влияние полиморфных вариантов гена ФНО-а (G308A), ИЛ-10 (C+3953T), iNOS (CCTTT)n на риск развития и тяжесть течения ХСН у больных с ИБС.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включено 226 больных ИБС со стенокардией напряжения I-III ФК (по классификации Канадской ассоциации кардиологов) (149 мужчин и 77 женщин, средний возраст 55,9±5,8 лет) с ХСН I-IV по NYHA. Фракция выброса (ФВ) левого желудочка колебалась в пределах 63-40% по данным эхокардиографии (ЭхоКГ). Диагноз верифицировался на основании тщательного анализа клинических данных, а также клинико-инстру-ментальных исследований, включавших ЭКГ и рентгенографию грудной клетки по общепринятым методикам, ЭхоКГ, тест 6-минутной ходьбы, общеклинических и биохимических исследований крови и мочи. Всех пациентов, включенных в исследование, разделили на 3 группы, сопоставимые по возрасту, длительности патологии и ФК ХСН. В 1-ю группу вошли 47 (20,8%) больных с I ФК ХСН, во 2-ю - 96 (42,5%) пациентов со II ФК ХСН, в 3-ю - 83 (36,7%) больных с III—IV ФК ХСН. Группу контроля составили 136 пациентов (63 мужчины и 73 женщины) в возрасте от 45 до 65 лет (в среднем возрасте 53,6±4,8 лет) без клинических проявлений ИБС и ХСН.
У всех пациентов забирался генетический материал (букальный эпителий) с последующим типированием аллелей гена ФНО-а (G-308A), ИЛ-1 в (С+3953Т) и гена iNOS (CCTTT)n. Для выделения ДНК использовали метод фенол-хлороформной экстракции [4]. Генотипирова-ние проводилось методом ПЦР; использовали прай-меры, синтезированные в Институте химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью стандартного статистического пакета программ SPSS 13,0. Сравнение частот встречаемости гено-
типов полиморфных локусов в различных популяциях проводили методом %2. Сравнение средних значений анализируемых показателей проводили с помощью t-кри-терия Стьюдента или U-критерия Манна - Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение частот встречаемости генотипов гена ФНО-а в 1-3 группах больных и в контрольной группе соответствовало ожидаемому при равновесии Харди -Вайнберга. Результаты исследования полиморфного локуса G-308A гена ФНО-а в целом в группе контроля и в группах больных представлены в табл. 1. Оказалось, что в целом у больных частота аллеля G и генотипа G/G была достоверно выше (соответственно на 11,7 и 13,6%), а частота аллеля A и генотипа А/А была достоверно ниже (соответственно на 11,7 и 9,7%) по сравнению с группой контроля. Следовательно, аллель G (p<0,05) и генотип G/G (p<0,05) являются факторами риска развития ХСН, а аллель A (p<0,05) и генотип A/A (p<0,05) проявили себя как протективный генетический фактор.
Распределение частот встречаемости генотипов гена ИЛ-1Р в группах больных с ХСН соответствовало ожидаемому при равновесии Харди - Вайнберга, а в контрольной группе наблюдалось значимое отклонение от ожидаемого распределения генотипов (р = 0,034 и р = 0,018 соответственно), что, вероятнее всего, было обусловлено тем, что группа контроля не являлась случайной выборкой. Результаты исследования полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1Р в целом в группе контроля и в группах больных с ХСН представлены в табл. 2. Установлено, что в целом у больных частота аллеля С и генотипа С/С была достоверно выше (соответственно на 13,6 и 22,5%), а частота аллеля Т и генотипов С/Т и Т/Т была достоверно ниже (соответственно на 13,6, 17,9% и 4,6%), чем в группе контроля. Следовательно, аллель С (p<0,05) и генотип С/С (p<0,05) являются факторами генетического риска развития ХСН, а аллель Т (p<0,05) и генотипы С/Т (p<0,05) и Т/Т (p<0,05) проявили себя как протективные факторы.
Распределение частот встречаемости количества повторов полиморфного пентануклеотида (CCTTT)n гена iNOS в группах больных и в контрольной группе соответствовало ожидаемому при равновесии Харди - Вайнберга. По данным распределения частот генотипов гена iNOS (CCTTT)n у больных ХСН установлены достоверные (р<0,05) различия с группой здоровых: частота повторов (CCTTT) 13 и (CCTTT) 14 п реобладала в груп пе бол ьн ых по сравнению с контролем (23,9 и 13,6% для (CCTTT)13, 9,1 и 2,1% для (CCTTT)14 соответственно), а количество повторов (CCTTT)10 чаще регистрировалось в группе контроля по сравнению с группой больных (6,3 против 3,1%, р<0,05).
Следовательно, увеличение количества повторов полиморфного локуса (CCTTT)n гена iNOS до 13-14 ассоциируется с проявлениями ХСН, в то время как количество
Патология кровообращения и кардиохирургия 3. 2011
65
повторов (CCTTT)10 проявляет себя как протективный фактор. Результаты исследования взаимосвязи генетических маркеров гена ФНО-а, гена ИЛ-1 в, гена iNOS со степенью тяжести ФК ХСН (по NYHA) представлены в табл. 3. Установлены достоверные различия по частоте встречаемости генетических маркеров генов ФНО-а ИЛ-1Р в зависимости от тяжести ФК ХСН. Частота генотипа G/G во 2-й (86,5%, р<0,05) и 3-й группе (89,2%, р<0,05) была достоверно выше, чем в 1-й группе (53,2%). Частота же генотипа G/A существенно преобладала в 1-й группе (42,6%, р<0,01) по сравнению со 2-й и 3-й группами (12,5 и 10,8%, соответственно). Различия по частоте аллеля G (I ФК - 74,5%, II ФК -92,7% и III—IV ФК - 94,6%), а также аллеля А (I ФК - 25,5%, II ФК - 9,3% и III—IV ФК - 5,4%) оказались достоверными.
Частота генотипа С/С в 3-й группе достоверно преобладала над таковыми во 2-й и в 1 -й группах (84,3, 57,3 и 29,8%, р<0,05 и p<0,01, соответственно), а во 2-й группе она значимо превышала ее по сравнению с 1-й группой (р<0,05). Вместе с тем генотипы, содержащие аллель Т, во 2-й группе встречались чаще, чем в 3-й (39,6 и 13,3%, р<0,01), но реже, чем в 1-й группе (39,6 против 63,8%, р<0,05). Различия по частоте аллеля С (I ФК - 61,7%, II ФК -
77,1% и Ш-М ФК - 91,0%) и аллеля Т (I ФК - 38,3%, II ФК
- 22,9% и Ш-1У ФК - 9,0%) также оказались достоверными. Количество повторов (ССТТТ)14 гена iN0S достоверно чаще встречалось в группе с III -IV ФК ХСН по сравнению с I ФК (14,5 и 4,3% соответственно, р<0,05)
и по сравнению с II ФК (14,5 и 6,8% соответственно, р<0,05), в то же время количество повторов (ССТТТ) 10 и (ССТТТ)11 было выше (р<0,05) в группе пациентов с 1 ФК по сравнению с группой больных с 111—IV ФК (5,3 и 0,6%
- (ССТТТ)10; 38,3 и 16,3% - (ССТТТ)11 соответственно).
ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярные механизмы, лежащие в основе цитокинин-дуцируемых нарушений инотропной способности и ремо-делирования ишемизированного миокарда, до конца не ясны. Предполагают, что провоспалительные цитокины играют важную роль в прогрессировании ХСН, опосредуя характер и интенсивность процессов ремоделирова-ния миокарда и сосудов уровнем апоптоза кардиомиоци-тов, который рассматривают в качестве фундаментального механизма, способного вызвать необратимые нарушения сократительной способности миокарда при ХСН [3].
Таблица 1
Аллели и генотипы полиморфного локуса G-308A гена ФНО-а * р<0,05
Таблица 2
Аллели и генотипы полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1& * р<0,05
Выборка Аллели, n (%) Генотипы, n (%)
G A G/G G/A A/A
Группа контроля, п = : 136 212 (77,9) 60 (22,1) 91 (66,9) 30 (22,1) 15 (11,0)
Группы больных, п = 226 405 (89,6)* 47 (10,4)* 182 (80,5)* 41 (18,2) 3(1,3)*
Выборка Аллели, n (%) Генотипы, n (%)
С Т С/С С/Т Т/Т
Группа контроля, п = : 136 178 (65,4) 94 (34,6) 53 (39,0) 72 (52,9) 11 (8,1)
Группы больных, п = 226 357 (79,0)* 95 (21,0)* 139 (61,5)* 79 (35,0)* 8 (3,5)*
Таблица 3 1ру.п.па..........................................................................................
Генотипы и аллели гена Генетический маркер 1 2 3
ФНО-а 308А), гена ИЛ-1в (С+3953Т), гена ¡NOS зависимости от ФК ХСН (ЫУНА)
* достоверность различий по сравнению с 1-й группой с I ФК, р<0,05; ** достоверность различий по сравнению с 1-й группой с I ФК, р<0,01; # достоверность различий по сравнению со 2-й группой с II ФК, р<0,05
(ест), 5 (5,3%) 8 (4,2%) 1 (0,6%)*
(CCTTT)11 36 (38,3%) 25 (13,0%)* 27 (16,3%)*
(CCTTT)12 27 (28,7%) 105 (54,7%)* 69 (41,6%)*
(CCTTT)13 22 (23,4%) 41 (21,3%) 45 (27,0%)
(CCTTT) 4 (4,3%) 13 (6,8%) 24 (14,5%)*#
(I ФК), n = 47 (II ФК), n = 96 (III—IV ФК), n = 83
Генотип G/G 25 (53,2%) 83 (86,5%)* 74 (89,2%)*
Генотип G/A 20 (42,6%) 12 (12,5%)** 9 (10,8%)**
Генотип A/A 2 (4,2%) 1 (1,0%) 0 (0%)
Аллель G 70 (74,5%) 178 (92,7%)* 157 (94,6%)*
Аллель A 24 (25,5%) 14 (9,3%)** 9 (5,4%)**
Генотип С/C 14 (29,8%) 55 (57,3%)* 70 (84,3%)**#
Генотип C/T 30 (63,8%) 38 (39,6%)* 11 (13,3%)**#
Генотип Т/Т 3 (6,4%) 3 (3,1%) 2 (2,4%)
Аллель С 58 (61,7%) 148 (77,1%)* 151 (91,0%)*
Аллель Т 36 (38,3%) 44 (22,9%)* 15 (9,0%)**#
Показано, что уровень ФНО-а в сыворотке больных с тяжелой сердечной недостаточностью (III-IV ФК по NYHA) на порядок выше, чем у здоровых лиц. Причем повышенное содержание ФНО-а регистрировалось у пациентов с более тяжелыми клиническими проявлениями декомпенсации, большей степенью кахексии (с массой тела 82% от идеального веса) и повышенной активностью ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [13]. В других работах обращено внимание на тесную корреляционную взаимосвязь высоких уровней ФНО-а, ИЛ-1 в и ИЛ-6 с тяжестью клинических проявлений и нейрогумораль-ной активацией у больных ХСН [9]. Отмечена положительная корреляция между увеличением уровня ФНО-а и эндотелийзависимой вазодилатацией, а также ФНО-а-зависимой гиперэкспрессией iNOS в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудистой стенки с проявлениями ХСН и снижением физической толерантности.
В литературе данных об исследованиях ассоциаций полиморфизмов генов цитокинов ФНО-а (G-308A), ИЛ-1 в (+3953) с сердечно-сосудистой патологией имеется относительно немного, а исследования о связи этих полиморфизмов с риском развития и характером прогрессирова-ния ХСН у больных с ИБС и АГ вообще отсутствуют. В ходе проведенного исследования установлено, что аллель G полиморфного локуса G-308A ФНО-а ассоциируется с индивидуально высоким риском развития ХСН, а также с ФК тяжести клинических проявлений ХСН. Аллель А полиморфного локуса G-308A ФНО-а, наоборот, ассоциируется с низким риском развития ХСН. Установлено также, что аллель С полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1 в ассоциируется с риском развития, тяжестью клинических проявлений ХСН у больных с ИБС, тогда как аллель Т полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1в ассоциировалась с низким риском развития данной патологии.
Данных литературы о связи полиморфных локусов гена iNOS с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний также не много. Исследования связи полиморфизмов с риском развития и характером прогрессирования ХСН в кардиологической практике единичны, но косвенно подтверждают наши данные. Так, в нашем исследовании точно установлено, что увеличение количества повторов полиморфного локуса (CCTTT)n гена iNOS до 14 является фактором индивидуального повышенного риска развития и тяжести течения ХСН у больных ХСН, в то время как при уменьшении количества повторов (CCTTT)10 уменьшался риск развития и тяжести течения ХСН. Возможно, это связано с уменьшением выработки количества NO кардиомиоцитами при уменьшении количества повторов полиморфного локуса (CCTTT) n гена iNOS, на что указал К.М. Warpeha [15], когда обнаружил взаимосвязь между выработкой NO и количеством повторов в гене iNOS (CCTTT)n: при числе повторов 8-9 выработка NO у них была достоверно ниже, чем при числе повторов 12-15. Выполненное исследование показало, что аллель G полиморфного локуса G-308A ФНО-а,
аллель С полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-1 ß и увеличение количества повторов полиморфного локуса (CCTTT)n гена iNOS до 14 является фактором индивидуального повышенного риска развития и тяжести течения ХСН. Напротив, аллель А полиморфного локуса G-308A ФНО-а, аллель Т полиморфного локуса С+3953Т гена ИЛ-Iß и уменьшение количества повторов (CCTTT)10 гена iNOS ассоциируется с низким риском развития ХСН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баранов В.С., Хавинсон В.Х. // Генетический паспорт. СПб., 2001.
2. Губаев К.И., Насибуллин Т.Р., Карамова И.М. и др. // Сердечная недостаточность 2007. № 8 (5). P. 236-238.
3. Макарков А.И., Салмаси Ж.М., Санина Н.П. // Сердечная недостаточность 2003. № 6. P. 312-314.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., 1984. 480 с.
5. Ольбинская Л.И., Игнатенко С.Б. // Сердечная недостаточность 2001. № 2. Р. 132-134.
6. Ребров А.П., Толстов С.Н. // Кардиология, 2007. № 5. Р. 14-18.
7. Тепляков А.Т., Дибиров М.М., Болотская Л.А. и др. // Кардиология, 2004. Т. 9. Р. 50-57.
8. Adams V. et al. // Cardiovasc. Res. 2002, V. 54 (1). Р. 95-104.
9. Comini L., Bachetti T., Agnoletti L. et al. // Eur. Heart. J. 1999. V. 20 (20). Р. 1503-1513.
10. Gealekman O. et al. // Circulation. 2002. V. 15 (2). Р. 236-243.
11. Henriksen P.A., Newby D.E. // Heart 2003. V. 89. Р. 14-18.
12. Le Convoisier P., Park H.Y., Carlson K.M et al. // Arch. Mal. Coeur. Vaiss. 2003. V. 96 (3). P. 197-206.
13. Levine B. et al. // N. Engl. J. Med. 1990. V. 323. P. 236-241.
14. Wollert K.C., Fiedler B. et al. // Hypertension 2002. V. 39. P. 87-92.
15. Zee R.Y. et al. // Thromb. Haemost. 2001. V. 86. P. 1136-1138.
Ефремов Анатолий Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, чл.-кор. РАМН, заведующий кафедрой патологической физиологии НГМУ Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Березикова Екатерина Николаевна - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры патологической физиологии НГМУ Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Шилов Сергей Николаевич - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры патологической физиологии НГМУ Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Сафронов Игорь Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии НГМУ Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Самсонова Елена Николаевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии НГМУ Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Пустоветова Мария Геннадьевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая центральной научно-исследовательской лабораторией НГМУ Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ молодым ученым
