CC BY
3УДК 575.174.015.3:616.62-006.6
Н.В. Савина1, Н.В. Никитченко1, Т.Д. Кужир1, С.Л. Поляков2, А.И. Ролевич2, С.А. Красный2,
Р.И. Гончарова1
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ эКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ДНК: ВЛИЯНИЕ НА РЕЦИДИВИРОВАНИЕ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
У БЕЛОРУССКИХ ПАЦИЕНТОВ
1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27; e-mail: [email protected] 2 РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова Республика Беларусь, 223040, Минский р-н, а/г Лесной
Представлены результаты генотипирования образцов ДНК, полученных от пациентов с установленным диагнозом рак мочевого пузыря (РМП), по полиморфизму генов эксцизионной репарации нуклеотидов XPD (As-p312Asn и Lys751Gln), ERCC6 (Met1097Val и Gly399Asp) и оснований XRCC1 (Arg399Gln), OGG1 (Ser326Cys). Проанализировано распределение частот генотипов и аллелей перечисленных генов у пациентов с первичным и рецидивным раком. Обнаружено влияние полиморфизма гена XPD Lys751Gln на рецидивирование РМП в группе курящих пациентов. У носителей гетерозиготного генотипа этого гена, курящих 30 и более лет, риск развития рецидивов повышался в 3-5 раз при его сочетании с гетерозиготами в других локусах: XRCC1 (ко-дон 399), ERCC6 (кодоны 1097 и 399). Выявлена ассоциация аллеляXPD 312Asn с рецидивными опухолями высокой степени злокачественности.
Ключевые слова: эксцизионная репарация ДНК; полиморфизм генов XPD, XRCC1, OGG1, ERCC6; рак мочевого пузыря, рецидивирование.
Введение
Рак мочевого пузыря (РМП) относится к распространенным онкологическим заболеваниям, ежегодно диагностируется примерно у 1200 жителей Республики Беларусь и уносит жизни более 400 человек [1]. Приблизительно 90% опухолей мочевого пузыря представлены уротелиальной карциномой. По клинико-морфологическим признакам РМП делится на 2 основные группы: без мышечной инвазии (РМП БМИ) и мышечно-инвазивный (МИ РМП) [2, 3]. Около 75% опухолей на момент постановки диагноза являются неинвазивными (Та/Т1). Мышечно-инвазивный рак (Т > 2) регистрируется у 25% пациентов, которые обычно подвергаются цистэктомии и для которых характерен неблагоприятный прогноз: 50%-я смертность в течение пяти лет вследствие прогрессии и метастазирования опухоли. У 70-80% пациентов с РМП БМИ в течение пяти лет развиваются рецидивные опухоли, которые в 10-20% случаев прогрессируют в мышечно-инвазивную форму.
В настоящее время уделяется большое внимание разработке критериев, позволяющих прогнозировать прогрессию и рецидивирова-ние рака у отдельного пациента. Выбор метода лечения и прогнозирование дальнейшего течения РМП базируются на его принадлежности к определенной классификационной категории, включающей стадию распространения (Т) и степень дифференцировки опухоли, а также ряд клинических и морфологических признаков [4, 5]. Однако отдаленные результаты лечения пациентов, относящихся к одним и тем же классификационным подгруппам и получавших одинаковое лечение, существенно различаются. Очевидно, что для полноценного прогноза клинического исхода необходима дополнительная информация, прежде всего, об индивидуальных генетически детерминированных факторах, определяющих как чувствительность клеток и организма к канцерогенезу, так и свойства самой опухоли.
Изучение молекулярной природы РМП привело к выделению ключевых мутаций, запускающих патогенез заболевания по двум аль-
тернативным путям [6]. Установлена также важная роль эпигенетической изменчивости некоторых генов [7]. Однако следует учитывать вклад в развитие РМП полиморфизма генов, участвующих в детоксикации ксенобиотиков и поддержании целостности и стабильности генома [8]. Среди таких - гены репарации ДНК [9]. Ранее нами изучено влияние полиморфизма некоторых генов эксцизионной репарации ДНК на чувствительность белорусских пациентов к РМП, а также выявлены ассоциации некоторых аллелей полиморфных локусов с клинико-патологическими характеристиками опухоли [10-13]. Обнаружено, что аллельные варианты гена XPD (кодоны 312 и 751) ассоциированы с риском развития заболевания и степенью злокачественности мышечно-инвазивных опухолей. Показана ассоциация ERCC61097 Val/Val генотипа с T > 2 опухолями, распространяющимися на мышечный слой, подлежащие ткани и органы малого таза. Гетерозиготный генотип гена OGG1 (кодон 326), наоборот, снижал риск развития РМП и был ассоциирован с неоплазмами с низким злокачественным потенциалом.
Цель данного исследования - изучить влияние полиморфизма генов эксцизионной репарации нуклеотидов XPD (rs1799793, rs13181), ERCC6 (rs2228526, rs2228528) и эксцизионной репарации оснований OGG1 (rs1052133), XRCC1 (rs25487) на рецидивирование РМП. Выбор генов обусловлен их функциями, и в первую очередь, участием соответствующих продуктов в репарации повреждений ДНК, вызванных окислительным стрессом, который расценивается как важнейший фактор инициации и прогрессии рака
[14, 15].
Материалы и методы
Группа обследования состояла из 418 пациентов, подлежащих диагностической или лечебной трансуретральной резекции мочевого пузыря на базе отделения онкоурологической патологии РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова. Отбор биологического материала (периферической венозной крови) проводился сотрудниками медицинского учреждения после подписания участниками исследования информированного согласия; всем участникам гарантирова-
лась конфиденциальность сведений личного характера. На каждого пациента оформлялся протокол, содержащий такие данные как пол, возраст, статус курильщика и длительность курения, а также клинические и морфологические данные, включая макроскопическое и микроскопическое описание опухоли. Стерильно взятые образцы цельной крови в количестве 3-5 мл хранились в вакутайнерах с распыленным ЭДТА при температуре -20 °С до начала молекулярно-генетических исследований.
Объект исследования - геномная ДНК, выделенная из образцов цельной венозной крови стандартным фенол-хлороформным методом.
Анализ полиморфизма генов репарации ДНК XPD (rsl799793, rsl3181), ERCC6 (rs2228526, rs2228528), OGG1 (rs1052133), XRCC1 (rs25487) проводили с помощью по-лимеразной цепной реакции с определением длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ-метод). Праймеры, рестрикционные эндонуклеазы, условия и продукты ПЦР подробно описаны ранее [10-13].
Для статистической обработки данных использован пакет стандартных программ Microsoft Excel 2000 и Statistica 6. Различия в частотах тех или иных генотипов (аллелей), так же, как и других альтернативных показателей, определяли по критерию х2, тогда как для выявления различий по количественным признакам применяли t-тест Стьюдента. Для определения вероятности (риска) развития рецидивов рака, а также более агрессивного течения заболевания вычисляли отношение шансов (OR) с доверительным интервалом (CI) в соответствии с известными рекомендациями.
Результаты и обсуждение
Характеристика группы пациентов с гистологически установленным РМП представлена в табл. 1. Эта группа состояла преимущественно из мужчин (82%) и пожилых людей (средний и медианный возраст - 67 лет). Курящие составляли 68% выборки. Эти особенности укладывались в известную демографическую картину РМП как болезни, зависимой от возраста, пола и курения [16].
По данным морфологического и гистологического исследования удаленных при трансуретральной резекции опухолей, наиболее часто выявлялась уротелиальная карцинома Ta/
T1 (около 70%); опухоли T2 составляли 17%; T3/T4 - 13%. По степени дифференцировки опухолей, в соответствии с классификацией 1973 г., 33% относились к G1, 45% - G2 и чуть более 20% - G3. В соответствии с классификацией 2004 г., 58% были представлены low grade, а 37% - high grade опухолями. CIS (карцинома in situ) занимала 0,2%; в 0,4% случаев не указана стадия T и в 1,4-2,2% - степень дифференцировки и злокачественности опухолевой ткани (G, low/high grade). Рецидивы РМП встречались примерно в 36% случаев.
Таким образом, в данной проспективной когорте пациентов, насчитывающей 418 человек, наиболее часто диагностировались опухоли на стадии Т1 G1-G2 (высоко- и умеренно дифференцированный рак без мышечной инвазии). Однако почти у трети пациентов выявлены опухоли на стадии Т2-Т4 (мышечно-инвазивный рак и опухоль, распространяющаяся на околопузырные ткани и органы малого таза), что свидетельствовало о необходимости совершенствования методов ранней диагностики и прогноза клинического течения заболевания.
Таблица 1
Характеристика группы пациентов с установленным диагнозом РМП; клинико-морфологические параметры опухоли
Признаки Пациенты
n Частота, %
Пол Мужской 344 82,3
Женский 74 17,7
Min 31 -
Возраст (лет) Max 93 -
Mean ± SD - 66,7±10,9
Median 67 -
Курит 283 67,7
Курение Не курит 117 28,0
Нет данных 18 4,3
TIS 1 0,2
Ta 91 21,8
Стадия опухоли T1 198 47,4
T2 72 17,2
T3 27 6,5
T4 27 6,5
Нет данных 2 0,4
CIS 1 0,2
Gl 139 33,3
1973 G2 186 44,5
а Л « G3 86 20,6
£ а § ^ пн Нет данных 6 1,4
ере S & и и PUNLMP 11 2,6
CIS 1 0,2
д 2004 Low 241 57,7
High 156 37,3
Нет данных 9 2,2
Первичные/ рецидивные опухоли Первичные 268 64,1
Рецидивные 150 35,9
Анализ полиморфизма генов репарации ДНК OGG1, ХЯСС1, XPD и ERCC6 при первичных и рецидивных опухолях. Функциональная характеристика генов и описание аллельных вариантов дана в предыдущих публикациях [10-13]. Результаты генотипи-рования представлены в табл. 2. Установлено, что генотипы по всем изученным вариантам распределены одинаково в группах пациентов с первичными и рецидивными опухолями. При учете таких этиологически важных факторов, как пол и курение, не обнаружено существенных различий между первичными и рецидивными опухолями у мужчин, тогда как у курящих пациентов с рецидивами РМП частоты гомозигот дикого типа и гетерозигот по гену XPD (кодон 751) существенно отли-
чались от этих показателей при первичных опухолях. Вероятность появления рецидивов на фоне гетерозиготного генотипа XPD 751 Lys/Gln почти удваивалась (OR [95%IC] = 1,77 [1,07-2,94] P = 0,026). Суммарная частота генотипов, содержащих вариант XPD 751 Gln, у пациентов с рецидивными опухолями также оказалась существенно выше: 80,4% по сравнению с 68% при первичных опухолях (P = 0,028) (данные представлены на рис. 1). Сходные, но статистически не доказанные ассоциации отмечены для полиморфизма XRCC1 Arg 399Gln. У носителей гетерозиготных комбинаций по этим двум локусам выражена тенденция к увеличению риска развития рецидивных опухолей: OR [95%IC] = 1,69 [0,99-2,91] (P = 0,055).
Таблица 2
Распределение генотипов по изученным генам репарации ДНК у пациентов с первичными
и рецидивными опухолями
Генотипы РМП (вся выборка) Пол (мужчины) Курение (вся выборка)
Первичные Рецидивные Первичные Рецидивные Первичные Рецидивные
OGG1 326 rs1052133 n = 269 n = 149 n = 222 n = 121 n = 180 n = 103
Ser/Ser, % 67,7 67,1 69,4 66,9 70,0 66,0
Ser/Cys, % 28,6 28,2 27,5 28,1 26,1 28,2
Cys/Cys, % 3,7 4,7 3,2 5,0 3,9 5,8
XRCCl 399 rs25487 n = 269 n = 150 n = 222 n = 121 n = 180 n = 103
Arg/Arg, % 42,0 40,0 41,0 36,4 41,7 35,9
Arg/Gln, % 46,8 48,7 48,2 52,1 45,6 53,4
Gln/Gln, % 11,2 11,3 10,8 11,6 12,8 10,7
XPD 312 rs1799793 n = 269 n = 149 n = 222 n = 121 n = 180 n = 103
Asp/Asp, % 30,5 31,5 31,0 30,6 28,9 27,2
Asp/Asn, % 52,8 51,7 52,3 50,4 53,9 52,4
Asn/Asn, % 16,7 16,8 16,7 19,0 17,2 20,4
XPD 751 rs13181 n = 265 n = 144 n = 220 n = 115 n = 178 n = 97
Lys/Lys, % 30,9 27,1 30,5 25,2 32,0 19,6*
Lys/Gln, % 50,6 56,9 51,8 58,3 47,75 61,9*
Gln/Gln, % 18,5 16,0 17,7 16,5 20,2 18,6
ERCC6 1097 rs2228526 n = 269 n = 150 n = 222 n = 121 n = 180 n = 103
Met/Met, % 49,5 49,3 48,2 46,3 50,0 45,6
Met/Val, % 43,1 44,0 44,1 46,3 42,2 46,6
Генотипы РМП (вся выборка) Пол (мужчины) Курение (вся выборка)
Первичные Рецидивные Первичные Рецидивные Первичные Рецидивные
Val/Val, % 7,4 6,7 7,7 7,4 7,8 7,8
ERCC6 399 rs2228528 n = 268 n = 145 n = 221 n = 118 n = 179 n = 102
Gly/Gly, % 65,7 73,1 67,4 72,0 67,0 73,5
Gly/Asp, % 30,6 25,5 29,4 26,3 29,6 24,5
Asp/Asp, % 3,7 1,4 3,2 1,7 3,4 2,0
Продолжение табл. 2
Генотипы
Первичные Рецидивные
Пол (мужчины)
Первичные Рецидивные
Курение (вся выборка)
Первичные Рецидивные
Val/Val, %
7,4
6,7
7,7
7,4
7,8
7,8
ERCC6 399
rs2228528
n = 268
n = 145
n = 221
n = 118
n = 179
n = 102
Gly/Gly, %
65,7
73,1
67,4
72,0
67,0
73,5
Gly/Asp, %
30,6
25,5
29,4
26,3
29,6
24,5
Asp/Asp, %
3,7
1,4
3,2
1,7
3,4
2,0
Примечание. Существенные различия между группами курящих пациентов с первичными и рецидивными опухолями при Р = 0,028 для гомозигот дикого типа и Р = 0,025 для гетерозигот по локусу ге13181.
Результаты дальнейшего исследования эффектов продолжительного курения на ре-цидивирование РМП на фоне тех или иных изученных генотипов показаны на рис. 2. У пациентов, курящих 30 и более лет, как и во всей
группе курящих, наблюдались существенные различия между рецидивными и первичными опухолями по гену XPD (кодон 751), и сходная тенденция намечалась по гену XRCC1 (кодон 399) (рис. 2 а).
Рис. 1. Распределение генотипов по генам ХРВ (кодон 751) и ХЯСС1 (кодон 399) у курящих пациентов
с первичными и рецидивными опухолями
р=0,017
□ первичные □ рецидивы
б
Lys/Gln Arg/Gin Lys/Gln Arg/Gin Lys/Gln Arg/Gin Met/Val Gly/Asp
Комбинации генотипов
Рис. 2. Распределение некоторых генотипов и их комбинаций у пациентов с первичными и рецидивными опухолями при курении более 30 лет: а - частоты генотипов ХРВ Lys751 Gln и ХЯСС1 Arg399Gln; б - комбинации гетерозигот ХРВ 751 Lys/Gln, ХЯСС1 399 АщЮЫ, ERCC6 1097Ме1/Уа1, ERCC6 399 Gly/Asp
Характерно, что комбинация, содержащая гетерозиготы по этим двум локусам (рис. 2 б), была ассоциирована с рецидивными опухолями при OR [95%CI] = 2,15 [1,14-4,05] (P = 0,018) - для Lys/Gln Arg/Gln. Значение OR значительно увеличивалось при сочетании этой комбинации с гетерозиготой ERCC6 1097 Met/Val: OR [95%CI] = 2,92 [1,18-7,23] (P = 0,02) - для Lys/Gln Arg/Gln Met/Val, и особенно - с гетерозиготой ERCC6 399 Gly/Asp: OR [95%CI] = 5,09 [1,53-16,91] (P = 0,008) - для Lys/Gln Arg/Gln Gly/Asp. Данные позволяют предположить, что полиморфизм гена ERCC6, который сам по себе не связан с рецидивными опухолями (в том числе и при курении), может увеличивать вероятность появления рецидивов у носителей двух других гетерозигот, курящих 30 и более лет.
Подтверждено определяющее влияние гетерозиготы XPD 751 Lys/Gln на опухолеобра-зование в мочевом пузыре, которое проявлялось не только в отношении инициации рака [13], но и возникновения рецидивов, как во всей группе курящих пациентов, так и при длительном (> 30 лет) курении. Рисковая значимость этого генотипа повышалась при его комбинации с гетерозиготами по некоторым другим локусам.
Распределение аллельных вариантов генов эксцизионной репарации ДНК у пациентов с первичными и рецидивными опухолями в зависимости от их распространенности и степени злокачественности. Принципиальное значение для прогноза имеет стадия заболевания, которая определяется в соответствии с международной системой TNM (Tumor, Nodulus, Metastasis). По этой классификации различают опухоли Ta (неинвазивная папиллярная карцинома), Т1 (опухоль распространяется на субэпителиальную соединительную ткань), T2 (опухолевая инвазия мышечного слоя), T3 (опухоль распространяется на паравезикальную клетчатку), T4 (опухоль распространяется на органы малого таза) [2]. Стадии Ta/T1 характеризуют РМП БМИ, тогда как стадии T > 2 свойственны ин-вазивному раку. Дифференциация опухолевой ткани отражает степень ее злокачественности. По классификации ВОЗ 1973 г., различают 3 степени (G1, G2, G3), соответствующие высоко-, умеренно- и низкодифференцированным
карциномам [2]. По классификации 2004 г., уротелиальные карциномы делятся на папиллярные опухоли с низким злокачественным потенциалом (PNLMP), опухоли низкой степени злокачественности (low grade), в категорию которых попадают все G1 и частично G2, и опухоли высокой степени злокачественности (high grade), поглощающие все G3 и частично G2 [2]. Мы проанализировали распределение генотипов/аллелей изученных генов в зависимости от этих категорий отдельно при первичных и рецидивных опухолях.
У пациентов с первичным РМП, так же, как и во всей выборке [13], существенные различия относительно инвазивности опухоли найдены только по гену ERCC6 1097: частота гомозигот по варианту ERCC6 1097Val при опухолях Т > 2 (12,9%) в 3 раза превосходила их частоту (4,2%) при неоплазмах Та/Т1 (P = 0,008). При стратификации выборки пациентов с первичным РМП на категории Ta/T1 low grade, Ta/T1 high grade, T > 2 low grade и T > 2 high grade подтверждена рисковая значимость гомозиготного генотипа ERCC6 1097 Val/Val, частота которого составляла 12,3% у пациентов с МИ РМП высокой степени злокачественности и 4,6% - при РМП БМИ низкой степени злокачественности (P = 0,037). Частота этого же генотипа была выше (но статистически не значимо) у пациентов с рецидивами РМП: 11,5% при инвазивных опухолях и 5,8% при РМП БМИ, соответственно. Возможно, наблюдаемые в этом случае различия не достигли статистической значимости из-за размера выборки (150 пациентов).
У пациентов с рецидивными опухолями гетерозиготы и генотипы, содержащие хотя бы один аллель XPD 312Asn, превалировали при высокой степени злокачественности (47,4% и 73,7%, соответственно) по сравнению с неоплазмами низкой степени злокачественности (27,7% и 49,2%, соответственно). Рис. 3 демонстрирует статистически значимые различия между low и high grade опухолями, касающиеся гена XPD (кодон 312), и сходные тенденции относительно другого полиморфного локуса этого гена (кодон 751), а также гена OGG1 (кодон 326).
Таким образом, вариант гена ERCC6 1097Val в гомозиготном состоянии влиял на инвазив-ность и степень злокачественности первичных
опухолей: OR [95%CI] = 3,40 [1,31-8,83] P = 0,012) при Т > 2 по сравнению с Та/Т1; OR [95%CI] = 2,93 [1,02-8,41] (P = 0,045) при Т > 2 high grade по сравнению с Та/Т1 low grade карциномами. Наличие полиморфного ал-леля Asn увеличивало вероятность развития рецидивных опухолей высокой степени злокачественности (high grade) по сравнению с опухолями низкой степени злокачественности (low grade): OR [95%CI] = 2,35 [1,02-5,43] (P = 0,045) для гетерозиготного генотипа XPD 312 Asp/Asn и OR [95%CI] = 1,83 [1,03-3,25] (P = 0,040) для варианта XPD 312Asn.
Влияние полиморфных вариантов некоторых генов эксцизионной репарации ДНК на клиническое течение рака мочевого пузыря. Ранее упоминалось, что существуют мутации, запускающие опухолевый процесс по альтернативным путям патогенеза. Обнаружено, что активирующие мутации в гене FGFR3 приводят к развитию РМП без мышечной инвазии, тогда как мутации гена-супрессора TP53 - к мышечно-инвазивному раку. Однако значительная часть опухолей (38%) имеет «дикий» генотип по этим мутациям, и, следовательно, может развиваться по иному молекулярно-генетическому пути [17]. С помощью полногеномного секвенирования установлена роль в развитии РМП мутационной изменчивости некоторых других генов (RB1, PIK3CA, KRAS, HRAS, NRAS, CDKN2A, TSC1) [18]. Известно
об определенном вкладе эпигенетической изменчивости в патогенез этого заболевания [7], что подтверждается высокой частотой метилирования промоторной области гена RUNX3 при РМП, а также наличием обратной корреляции между статусом метилирования этого гена и мутационной изменчивостью FGFR3 при отсутствии ассоциации с частотой мутаций в гене ТР53 [19]. Кроме того, показано, что эпигенетическая изменчивость RUNX3 является независимым фактором риска в отношении прогрессирования и онкоспецифи-ческой выживаемости пациентов с РМП без мышечной инвазии.
В отличие от известных ключевых мутаций, генетический полиморфизм не оказывает столь значительного и специфического действия на процесс канцерогенеза. Однако его существенная роль в онкопатологии доказывается многочисленными работами, в том числе и широкогеномным исследованием (GWAS), в ходе которого идентифицировано более 300 доказанных ассоциаций между генетическими вариациями и 70 общими болезнями [8]. Следует отметить, что функции генов, имеющих отношение к раку мочевого пузыря, сфокусированы на детоксикации ксенобиотиков, сохранении целостности и стабильности генома, контроле клеточного деления и апоп-тоза. Целостность и стабильность генома поддерживаются системами репарации ДНК и зависят от эффективности и точности этого
80
60
40
20
□ low □ high
OGG1 326
XPD 312
A
^=0,015
XPD 751
A
Л
p=0,025
n
n
Л
^ ^ ^ & 4cf # ^ / / / ^ ^ сГ of с/ с/
а
Рис. 3. Распределение генотипов/аллелей у пациентов с рецидивными опухолями в зависимости от дифференциации и степени злокачественности опухолевой ткани: а - частота гетерозигот XPD 312 Asp/Asn составляла 47,4% при низкодифференцированных (high grade) и 27,7% при высокодифференцированных (low grade) опухолях: OR [95%CI] = 2,35 [1,02-5,43] (P = 0,045); б - аллель XPD 312Asn при high grade опухолях встречался с частотой 50%, тогда как при low grade неоплазмах его частота составляла 35,4%: OR [95%CI] = 1,83 [1,03-3,25] (P = 0,040). Частоты аллеля XPD 751Gln составляли 51,4% и 41,4%, а OGG1 326Cys - 25,0% и 16,2%, соответственно
процесса. Поэтому изменчивость в полиморфных локусах генов эксцизионной репарации в связи с канцерогенезом и, в частности, с уроте-лиальной карциномой, представляет научный и практический интерес.
Наши предыдущие результаты подтверждают влияние полиморфизма генов ERCC2/XPD, ERCC6/CSB, OGG1 на инициацию и прогрес-сирование РМП [10-13]. Модификация функций и/или активности этих генов сказывается и на рецидивировании рака. Отмечается, что все известные однонуклеотидные замены (SNP) ассоциированы с онкологическими заболеваниями при отношении шансов не более 1,5 [8], что характерно и для наших исследований. Однако, взаимодействуя друг с другом, они могут повышать риск развития РМП, и, по-видимому, изменять его клиническое течение. Так, гетерозиготное носительство минорных аллелей гена ERCC6/CSB (кодоны 1097 и 399) существенно не влияло на рецидивирование РМП. Однако сочетание этих гетерозигот с комбинацией гетерозиготных генотипов ER-^2/ХРВ 751 Lys/Gln и ХШ^ 399 А^/Ш на фоне длительного курения увеличивало риск развития рецидивов в 3-5 раз.
Изучение прогностической значимости полиморфизма генов репарации ДНК другими авторами привело к неоднозначным (зачастую противоположным) результатам. При исследовании этой проблемы в связи с эффективностью химиотерапии и выживаемостью пациентов показано, что варианты генов ХРВ 75 Ш1п, XRCC1 399^п, OGG1 326Cys при определенных условиях улучшают эти показатели [20-24]. Однако анализ генетического полиморфизма в связи с клинико-патологическими параметрами выявил повышение частоты рецидивов РМП у пациентов-носителей хотя бы одного аллеля ERCC6 1097Уа1 [25] и влияние полиморфизма гена APE1 на инвазивность опухоли при нейтральности других изученных вариантов ^^1, XRCC3, ХРВ, XPG, hOGG1) [26]. Сравнение наших результатов с данными литературы позволяет предположить, что изменение репарационных функций благодаря полиморфизму генов эксцизионной репарации ДНК, с одной стороны, повышает чувствительность опухолевых клеток к хи-мио- или радиотерапии, но с другой, - может способствовать агрессивности РМП.
Полученные результаты дают основание полагать, что, хотя варианты изученных генов эксцизионной репарации ДНК не относятся к мутациям, ответственным за молекулярный патогенез РМП, они модифицируют риск развития и клиническое течение рака. Подтверждена целесообразность изучения полиморфизма этих генов в связи с клинико-патологическими параметрами опухолей для выявления дополнительных прогностических маркеров. К таковым можно отнести варианты ERCC6/CSB МеИ097Уа1, ERCC2/XPD Asp312Asn, ERCC2/XPD Lys751Asp, преимущественно ассоциированные с распространенностью опухоли, степенью дифференциации опухолевой ткани и/или рецидивированием рака. Следует также обратить внимание на взаимодействие генов, которое в некоторых случаях существенно увеличивает рисковую значимость отдельных SNP. Чтобы повысить практическую ценность выявленных маркеров, целесообразно в будущем оценить их влияние на такие медицинские показатели как общая и онкоспецифическая выживаемость, выживаемость до прогрессирования и безрецидивная выживаемость пациентов, страдающих РМП.
Заключение
Генотипировано 418 образцов ДНК от пациентов с гистологически установленным раком мочевого пузыря (РМП) и проанализировано распределение частот генотипов и аллелей генов эксцизионной репарации ERCC2/XPD (Asp312Asn и Lys751G1n), ERCC6/CSB (Ме1-1097Уа1 и G1y399Asp), XRCC1 (А^399^п), OGG1 (Ser326Cys) в зависимости от клинико-патологических и этиологических факторов. Рецидивные опухоли наблюдались у 36% пациентов. Выявлены статистически значимые различия между группами курящих пациентов с рецидивными и первичными опухолями по полиморфизму гена XPD 751. У пациентов, курящих 30 и более лет, вероятность развития рецидивных опухолей значимо повышалась под влиянием гетерозиготного генотипа XPD 751 Lys/G1n и увеличивалась в 3-5 раз при сочетании этого генотипа с гетерозиготами в других изученных локусах (XRCCl Arg399G1n, ERCC6 МеИ 097Уа1, ERCC6 G1y399Asp). Установлена ассоциация аллеля XPD 312Asn и
гетерозиготного генотипа XPD 312 Asp/Asn с риском развития рецидивных опухолей высокой степени злокачественности. В отличие от полиморфных вариантов гена XPD, минорный аллель ERCC6 1097Val в гомозиготном состоянии ассоциирован с первичными мышечно-инвазивными опухолями высокой степени злокачественности. Указанные ассоциации свидетельствуют о возможном влиянии изученных аллельных вариантов генов эксцизионной репарации ДНК (отдельно и при их взаимодействии с этиологически важным фактором или между собой) на рецидивирование и более агрессивное течение РМП.
Список использованных источников
1. Океанов, А.Е. Статистика онкологических заболеваний / А.Е. Океанов, П.И. Моисеев, Л.Ф. Левин; под ред. О.Г. Суконко. - Минск, 2013. - 373 с.
2. Рак мочевого пузыря TaT1 (без мышечной инвазии) / M. Babjuk [et al.]; пер. М.Ю. Фе-дянина, науч. ред. О.Б. Карякин. - Европейская ассоциация урологов, 2010. - С. 1-20.
3. Инвазивный и метастатический рак мочевого пузыря / A. Stenzl [et al.]; пер. О.В. Антонова, науч. ред. И.Г. Русаков - Европейская ассоциация урологов, 2010. - С. 1-63.
4. Predicting recurrence and progression in individual patients with stage TaT1 bladder cancer using EORTC risk tables: a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials / R.J. Sylvester [et al.] // Eur Urol. - 2006. -Vol. 49, № 3. - P. 466-477.
5. Ather, M.H. Predicting recurrence and progression in non-muscle-invasive bladder cancer using European organization of research and treatment of cancer risk tables / M.H. Ather, M. Zaidi // Urol. J. - 2009. - Vol. 6, № 3. - P. 189-193.
6. FGFR3 and P53 characterize alternative genetic pathways in the pathogenesis of urothelial cell carcinoma / B.W. van Rhijn [et al.] // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64, No. 6. - P. 1911-1914.
7. Kim, Y.K. Epigenetic markers as promising prognosticators for bladder cancer / Y.K. Kim, W.J. Kim // Int. J. Urol. - 2009. -Vol. 16, No. 1. - P. 17-22.
8. Genetic variants in urinary bladder cancer: collective power of the "wimp SNPs" / K. Gol-ka [et al.] // Arch. Toxicol. - 2011. - Vol. 85, No. 6. - P. 539-554.
9. Полиморфизмы генов эксцизионной репарации ДНК при раке мочевого пузыря / Н.В. Савина [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - 2011. -Т. 12. - С. 64-74.
10. Полиморфизм генов эксцизионной репарации XPD, XRCC1 и hOGGl у населения Республики Беларусь и его влияние на канцерогенез / О.П. Романюк [и др.] // Экологическая генетика. - 2013. - Т. 11, № 4. - С. 45-63.
11. Polymorphism of DNA repair genes OGG1, XRCC1, XPD, and ERCC6 in bladder cancer in Belarus / V.P. Ramaniuk [et al.] // Bio-markers. - 2014 - Vol. 19, No. 6. - P. 509-516.
12. Полиморфизм генов эксцизионной репарации ДНК как дополнительный фактор прогрессии рака мочевого пузыря: исследование на пациентах Беларуси / Н.В. Савина [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - 2014. - Т. 18. - С. 44-52.
13. The cellular response to oxidatively induced DNA damage and polymorphism of some DNA repair genes associated with clinicopathological features of bladder cancer / N.V. Savina [et al.] // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. -2016: 5710403. doi 10.1155/2016/5710403
14. Klaunig, J.E. Oxidative stress and oxidative damage in carcinogenesis / J.E. Klaunig, L.M. Kamendulis, B.A. Hocevar // Toxicol. Pathol. - 2010. - Vol. 38, No. 1. - P. 96-109.
15. The role of oxidative stress in bladder cancer / E. Sawicka [et al.] // Postepy Hig Med Dosw (Online). - 2015. - Vol. 69. - P. 744-752.
16. Jankovic, S. Risk factors for bladder cancer / S. Jankovic, V. Radosavljevic // Tumori. -2007. - Vol. 93. - P. 4-12.
17. FGFR3 and TP53 mutations in a prospective cohort of Belarusian bladder cancer patients / MP. Smal [et al.] // Exp. Oncol. - 2014. -Vol. 36, No. 4. - P. 246-251.
18. Combined gene expression and genomic profiling define two intrinsic molecular subtypes of urothelial carcinoma and gene signatures for molecular grading and outcome / D. Lindgren [et al.] // Cancer Res. - 2010. - Vol. 70, No. 9. -P. 3463-3472.
19. Статус метилирования гена RUNX3 как фактор прогноза при раке мочевого пузыря без мышечной инвазии / М.П. Смаль [и др.] // Доклады НАН Беларуси. - 2015. - T. 59, № 5. - С. 85-90.
20. Single nucleotide polymorphisms in DNA repair genes might be prognostic factors in muscle-invasive bladder cancer patients treated with chemoradiotherapy / S. Sakano [et al.] // Br. J. Cancer. - 2006. - Vol. 95, No. 5. - P. 561-570.
21. DNA repair gene polymorphisms may be associated with prognosis of upper urinary tract transitional cell carcinoma / M. Sasaki [et al.] // Neoplasia. - 2008. - Vol. 10. - P. 255-265.
22. Polymorphisms in XPD, XPC and the risk of death in patients with urinary bladder neoplasms / S. Sanyal [et al.] // Acta Oncol. - 2007. - Vol. 46. -P. 31-41.
23. Polymorphisms in the XRCC1 gene modify survival of bladder cancer patients treated
with chemotherapy / C. Sacerdote [et al.] // Int. J. Cancer. - 2013 - Vol. 133. - P. 2004-2009.
24. Tissue hOGGl genotype predicts bladder cancer prognosis: a novel approach using a peptide nucleic acid clamping method / Y.S. Ha [et al.] // Ann. Surg. Oncol. - 2011. - Vol. 18. -P. 1775-1781.
25. Nucleotide excision repair gene polymorphisms and recurrence after treatment for superficial bladder cancer / J. Gu [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2005. - Vol. 11. - P. 1408-1415.
26. Bladder cancer and polymorphisms of DNA repair genes (XRCC1, XRCC3, XPD, XPG, APE1, hOGGl) / K.F. Narter [et al.] // Anticancer Res. - 2009. -Vol. 29. - P. 1389-1393.
N.V. savina1, N.V. Nikitcheko1, T.D. Kuzhir1, s.L. Polyakov2, A.I. Rolevich2, s.A. Krasny2,
R.I. Goncharova1
polymorphism of excision repair genes: impact on bladder cancer reccurencies in belarusian patients
institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus Minsk BY-220072, Republic of Belarus 2N.N. Alexandrov National Cancer Centre of Belarus Lesnoy, Minsk District BY-223040, Republic of Belarus
The results of genotyping DNA samples collected from patients with verified diagnosis of bladder cancer (BC) for polymorphism of nucleotide excision repair genes XPD (Asp312Asn and Lys751Gln), ERCC6 (Met1097Val and Gly399Asp) and base excision repair genes XRCC1 (Arg399Gln), OGG1 (Ser326Cys) are presented. The distribution of genotypic/allelic frequencies for the listed genes has been analyzed in patients with primer and recurrent tumors. The impact of the XPD Lys751Gln polymorphism on cancer recurrence was found in smokers. In XPD Lys751Gln heterozygous genotype carriers smoking over 30 years, the recurrence risk was increased in 3-5 times by combining that with heterozygotes in other loci (XRCC1 399, ERCC6 1097 and 399). The association between XPD 312Asn allele and high grade recurrent tumors was revealed.
Key words: DNA excision repair, XPD,XRCC1, OGG1, ERCC6 gene polymorphisms, bladder cancer, recurrence.
Дата поступления статьи 8 декабря 20l5 г.
