CC BY
119
УДК 616.831-005.1:575(571.1/.5)
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА APOE И ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНСУЛЬТ В ГОРОДСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
Михаил Иванович ВОЕВОДА1, Сергей Владимирович ШИШКИН1,
Владимир Николаевич МАКСИМОВ1, Елена Владимировна ШАХТШНЕЙДЕР1,
Юлия Владимировна СКУРИХИНА1, Игорь Вячеславович КУЛИКОВ1,
Аида Герасимовна РОМАЩЕНКО2
1НИИ терапии СО РАМН
630089, г. Новосибирск, ул. Б. Богаткова, 175/1
2Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10
В статье описаны половые и возрастные особенности полиморфизма гена АРОЕ и его ассоциации с показателями липидного состава крови у больных ишемическим инсультом жителей г. Новосибирска. Отмечено, что в возрастной группе старше 65 лет у мужчин реже встречается носительство генотипа е2/е3 и е3/е4 гена АРОЕ, чем у женщин. Независимого влияния полиморфизма генотипов гена АРОЕ на средний уровень общего холестерина, триглицеридов и холестерина липопротеинов высокой плотности у больных ишемическим инсультом выявлено не было.
Ключевые слова: полиморфизм, ген АРОЕ, липидный состав крови, пол, возраст, ишемический инсульт.
Идентификация генетической предрасположенности к инсульту и другим мультифакториальным заболеваниям проводится на основе анализа возможного участия белкового продукта тестируемого гена в патогенезе заболевания. О возможной ассоциации гена-кандидата или отдельных областей генома с конкретным заболеванием можно судить по наличию статистически достоверных различий частоты генотипов в группах больных и здоровых носителей полиморфных аллелей в рамках данной популяции.
Аполипопротеин Е — полиморфный секреторный гликопротеин, участвующий в транспорте холестерина, который может быть представлен тремя изоформами белка (е2, е3, е4). Получены данные, свидетельствующие о том, что три изоформы аполипопротеина Е связаны с метаболизмом липопротеинов и определяют вариабельность риска развития атеросклероза сосудов мозга и коронарных артерий [1]. Предполагается, что неполная экспрессия участка гена АРОЕ в случае присутствия аллеля е2, часто встречающаяся в по-
пуляциях южно-европеиских стран, имеет отношение к низким показателям кардиоваскулярной смертности в регионе Средиземноморья [2]. Эти факты позволяют предполагать наличие взаимосвязей между вариантами генотипа гена АРОЕ и ишемическими типами инсульта.
Материал и методы
При решении проблемы генетической детерминированности инсульта нами была поставлена задача изучить особенности взаимодействия сре-довых и генотипических факторов на примере полиморфизма гена АРОЕ у больных с наиболее распространенным типом острых церебральных сосудистых поражений — ишемическим инсультом [3].
В ходе выполнения исследования в соответствии с международными критериями диагностики инсульта [4, 5] среди населения репрезентативного района Новосибирска (общая численность жителей около 150 000 человек) методом регистра в период с 2003 по 2007 гг. были выявлены больные с впервые развившимися и повторными случая-
Воевода М.И. — д.м.н., проф., чл.-корр. РАМН, директор; e-mail: [email protected]
Шишкин С.В. — к.м.н., ст.н.с. лаборатории клинико-популяционных и профилактических исследований
терапевтических и эндокринных заболеваний
Максимов В.Н. — д.м.н., вед.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний
Шахтшнейдер Е.В. — к.м.н., вед.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний Скурихина Ю.В. — аспирант
Куликов И.В. — к.м.н., ст.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний
Ромащенко А.Г. — к.б.н., зав. лаборатории молекулярных основ генетики животных
ми ишемического инсульта. Из числа всех зарегистрированных «превалентных» случаев инсульта была сформирована 15%-ная случайная выборка. В соответствии с МКБ-9 в общей группе больных ишемическим инсультом учетными являлись следующие клинические формы и коды инсульта: 433 — инфаркт мозга неэмболический, 434 — инфаркт мозга вследствие тромбоэмболии сосудов. Все пациенты с мозговым инсультом, отобранные для участия в проекте — госпитализированные и негоспитализированные — осматривались неврологом в подостром или восстановительном (преимущественно) периодах заболевания с забором крови для молекулярно-генетического исследования и определения липидного профиля.
Для сравнительной характеристики полиморфизма гена APOE использовался банк ДНК популяции жителей Новосибирска в возрасте 25—64 лет, который был сформирован в 1994—1995 гг. в Институте терапии СО РАМН в ходе выполнения третьего одномоментного скринирующего обследования населения в рамках международной кооперативной программы по изучению тенденций заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний и определяющих их факторов (программа ВОЗ «MONICA»).
Генотипирование полиморфизма гена APOE в группе больных с ишемическим инсультом выполнено для 225 человек: 105 мужчин и 120 женщин. Средний возраст развития инсульта у мужчин составил 61,3 ± 1,0 года, у женщин —
б6,1 ± 0,9 года.
Выделение ДНК из образцов крови осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции по модифицированной методике Смита с соавт. [6]. Ген APOE размером 3,7 кб включает четыре экзона и расположен на хромосоме 19 [7, 8]. Генотипи-рование выполняли по широко изучаемому полиморфизму гена APOE (112С/Т и 158С/Т). Анализ полиморфизма гена APOE состоял в определении частоты его наиболее распространенных аллельных вариантов е2 (Cys112, Cys158), е3 (Cys112, Arg158) и е4 (Arg112, Arg158) и формируемых ими генотипов. Для анализа была использована оригинальная методика генотипирования, основанная на подходе, предложенном J.E. Hixson и D.T. Vernier [9]. Визуализацию продукта полимеразной цепной реакции проводили методом гель-электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и тестировали с применением системы компьютерной видеосъемки.
Кровь для определения липидных фракций забиралась после 12-часового голодания. Центрифугированная сыворотка хранилась в низкотемпературной камере (—70 °С) до проведения анализов (в течение 1—3 месяцев). Определение концентрации общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ) и холестерина липопротеинов высокой
плотности (ХС ЛПВП) проводилось энзиматическим методом с использованием коммерческих наборов «Вюсоп» (Германия) на автоанализаторе <^аЪ8у81еш» (Финляндия). Индекс атерогенности (ИА) рассчитывался по формуле: ИА = (ОХС — - ХС ЛПВП) / ХС ЛПВП.
Статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета программ SPSS 11.5. Статистические оценки включали дескриптивный анализ числовых характеристик признаков (средние значения, стандартные отклонения) и их распределений с использованием стандартных критериев оценки статистических гипотез.
Результаты и обсуждение
Частота генотипов в обследованной выборке соответствует теоретически ожидаемой и находится в равновесии Харди - Вайнберга.
Наиболее распространенным в выборке больных ишемическим инсультом является генотип е3/е3, как в группе мужчин, так и в группе женщин. Этот же генотип был наиболее представлен в популяционной выборке (табл. 1).
Возрастная динамика частот отдельных генотипов при ишемическом инсульте характеризуется следующим: статистически значимое снижение частоты генотипа е3/е3 и е3/е4 у мужчин по сравнению с женщинами наблюдалось при сопо-
Таблица 1
Частота генотипов гена АРОЕ у больных ишемическим инсультом
Возраст Генотип
е2/е3 е2/е4 е3/е3 е3/е4 е4/е4
Мужчины
Инсульт
25-54 (n = 25) 16,0 % 8,0 % 60,0 % 16,0 % -
55-64 (n = 40) 12,5 % 2,5 % 55,0 % 30,0 % -
> 65 (n = 40) 17,5 % - 60,0 % 20,0 % 2,5 %
Всего (n = 105) 15,2 % 2,9 % 58,1 % 22,9 % 0,9 %
Жители Новосибирска
25-45 (n = 426) 11,5 % 2,8 % 67,4 % 16,0 % 2,3 %
Возраст Женщины
Инсульт
25-54 (n = 25) - - 96,0 % 4,0 % -
55-64 (n = 25) - - 76,0 % 20,0 % 2,5 %
> 65 (n = 70) 10,0 % 4,3 % 58,5 % 24,3 % 2,9 %
Всего (n = 120) 5,8 % 2,5 % 70,0 % 19,2 % 2,5 %
Жители Новосибирска
25-45 (n = 176) 11,9 % - 64,2 % 23,3 % 0,6 %
ставлении возрастной группы 55-64 и > 65 лет (р = 0,014 и p = 0,02 соответственно). Вероятно, генотипы е3/е3 и е3/е4 у мужчин в возрастной группе старше 65 лет ассоциированы с более частыми неблагоприятными исходами ишемического инсульта.
Наследующемэтапемолекулярно-генетического анализа была изучена ассоциация полиморфизма гена APOE с уровнями липидов крови в обследованной выборке. Анализировали ассоциацию полиморфизма с уровнями ОХС, ТГ и ХС ЛПВП (табл. 2).
Как следует из таблицы 2, в выборке больных ишемическим инсультом различия в средних уровнях ОХС, ТГ, ХС ЛПВП не были статистически значимы при попарных сравнениях между генотипами е2/е3, е3/е3, е3/е4, е4/е4 (р > 0,05).
Максимальное значение среднего уровня ОХС выявлено для генотипа е3/е3 (225,8 мг/дл), минимальное - при генотипе е4/е4 (175,2 мг/дл). Отмечается увеличение среднего уровня ОХС в ряду генотипов е4/е4, е2/е3, е3/е4, е2/е4, е3/е3 (175,2 -
222,1 - 224,7 - 225,7 - 225,8 мг/дл), однако различия не достигают статистической значимости и находятся ниже уровня гиперхолестеринемии, определенной по значению ОХС > 240 мг/дл. Независимого влияния полиморфизма генотипов гена APOE на средний уровень ОХС у больных ишемическим инсультом жителей г. Новосибирска не выявлено (р = 0,28).
Минимальное значение средних уровней ХС ЛПВП в выборке больных ишемическим инсультом определено для генотипа е2/е4 (40,5 мг/дл) у мужчин и е2/е3 (45,5 мг/дл) у женщин. Выявлены относительно более высокие значения среднего уровня ХС ЛПВП при генотипе е4/е4 (51,0 мг/дл)
у мужчин и е3/е3 (53,4 мг/дл) у женщин по сравнению с генотипами е2/е4, е2/е3 и е3/е4, при этом у мужчин с соответствующим генотипом наблюдается наиболее низкое, а у женщин — наиболее высокое среднее значение содержания ОХС. В общей факторной модели выявлено статистически значимое влияние полиморфизма генотипов APOE, пола и возраста на концентрацию ХС ЛПВП (р = 0,03).
Максимальные значения среднего уровня ТГ в выборке определяются при генотипе е3/е4 (247,6 мг/дл у мужчин и 238,0 мг/дл у женщин) и е2/е3 (235,1 мг/дл у мужчин и 213,6 мг/дл у женщин), минимальное выявлено для генотипа е4/е4 (84,0 мг/дл у мужчин и 152,8 мг/дл у женщин). Статистически значимого влияния полиморфизма генотипов гена APOE на средний уровень ТГ не обнаружено (р = 0,12).
Минимальные средние значения ИА выявлены у мужчин и женщин с генотипом е4/е4 (1,6 и 3,0 соответственно), максимальные — при генотипе е3/е4 (4,9 и 4,7 соответственно). Обнаружено статистически значимое влияние полиморфизма генотипов гена APOE, пола и возраста на величину ИА (р = 0,04).
Отсутствие доказательств независимого влияния полиморфизма гена APOE на уровень липидных фракций у больных с перенесенным ишемическим инсультом в представленном анализе не противоречит данным о менее определенной и не столь постоянно выявляемой роли повышенного уровня холестерина в развитии инсульта по сравнению с ишемической болезнью сердца (ИБС) [10]. Убедительные данные о наличии прямой связи между повышением содержания холестерина в крови и риском развития ИБС [11] не подтверждаются в эпидемиологических исследованиях, ко-
Таблица 2
Генотипы гена АРОЕ и уровень липидов (мг/дл) у больных ишемическим инсультом (медиана (95% доверительный интервал))
Генотип Содержание ОХС Содержание ТГ Содержание ХС ЛПВП
Мужчины (n = 105) Женщины (n = 120) Мужчины (n = 105) Женщины (n = 120) Мужчины (n = 105) Женщины (n = 120)
е2/е4 213,5 (158,6-268,5) 237,8 (190,2-285,3) 197,7 (170,7-224,6) 185,4 (154,4-216,4) 40,5 (26,2-54,8) 54,5 (42,1-67,0)
е2/е3 211,3 (188,9-233,8) 215,1 (181,5-248,8) 229,3 (176,1-282,5) 221,1 (141,3-301,0) 47,3 (41,4-53,1) 47,0 (38,2-55,8)
е3/е3 214,8 (200,5-229,1) 209,0 (190,3-227,7) 169,5 (176,1-282,5) 176,7 (132,3-221,0) 50,1 (46,4-53,8) 49,3 (44,4-54,1)
е3/е4 225,4 (202,7-248,0) 209,9 (185,4-234,3) 226,0 (172,3-280,0) 197,1 (139,1-255,1) 45,4 (39,5-51,3) 50,7 (44,3-57,1)
е4/е4 132,9 (54,3-209,7) 196,8 (149,2-244,3) 84,0 (0-268,4) 152,8 (39,8-265,7) 51,0 (30,7-71,3) 47,8 (35,3-60,2)
торые пытаются установить зависимость между концентрацией холестерина и риском инсульта [12]. Обусловлено это тем, что инсульты характеризуются большей неоднородностью патогенеза, и лишь часть их вызвана атеротромботическими осложнениями [3].
«Парадоксальные» эффекты, выявляемые в эпидемиологических исследованиях, при изучении связи между атерогенными фракциями липидов и риском развития инсульта, объясняются неодинаковым влиянием холестерина на разные типы инсульта [13, 14], а наблюдаемая в клинических трайлах эффективность липидснижающей терапии статинами при инсульте объясняется плейотропным действием статинов (например, антитромботическим, противовоспалительным или стабилизирующим бляшку).
Выводы
Молекулярно-генетические исследования по поиску генетических маркеров ишемического инсульта необходимо продолжить с учетом гетерогенности его подтипов и необходимости изучения новых патогенетических механизмов его развития.
Благодарности Работа поддержана грантом РГНФ № 09-06-00724а.
Список литературы
1. Menzel H.-J., Kladetzky R.-G., Assman G. Apo-lipoprotein E polimorphism and coronary artery disease // Arteriosclerosis. 1983. 3. 310—315.
2. Muros M., Rodreguez-Ferrer C. Apolipopro-tein E polymorphism influence on lipids, apolipopro-teins and Lp(a) in a Spanish population underexpressing apo E4 // Atherosclerosis. 1996. 121. (1). 13—21.
3. Warlow C., Dennis S., Jan van Gijn et al. Stroke: a practical guide to management // 2nd ed. Malden: Blackwell Science, 2001. 151 p.
4. MONICA Manual, Section 2: Stroke event registration data component. 1990. 3—12.
5. Aho K., Harmsen P., Hatano S. et al. Cerebrovascular diseases in the community: Results of the WHO collaborative Study // Bull. WHO. 1980. 58. (1). 13-130.
6. Smith K., Kliko C, Cantor C. Puls-elektrofo-rez and methods of work with the big molecules of DNA // The Analysis of the genome. Methods: the Lane with English. M, World. 1990. 58-94.
7. Paik Y.K., Chang D.J., Reardon C.A. et al. Nucleotide sequence and structure of the human apolipo-protein E gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. 82. 3445-3449.
8. Das H.K., McPherson G.A., Bruns S.K. et al. Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the human apolipoprotein E gene // J. Biol. Chem. 1985. 260. 6240-6247.
9. Hixson J.E., Vernier D.T. Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with Hhal // J. Lipid Res. 1990. 31. (3). 545-8.
10. Kent D.M. Stroke - An equal opportunity for the initiation of statin therapy // N. Engl. J. Med. 2006. 355. (6). 613-615.
11. Castelli W.P., Anderson K., Wilson P.W. et al. Lipids and risk of coronary heart disease: the Framingham Study // Ann. Epidemiol 1992. 2. 23-28.
12. Prospective Studies Collaboration. Cholesterol, diastolic blood pressure, and stroke: 13 000 strokes in 450 000 people in 45 prospective cohorts // Lancet. 1995. 346. 1647-1653.
13. Tirschwell D.L., Smith N.L., Heckbert S.R. et al. Association of cholesterol with stroke risk varies in stroke subtypes and patient subgroups // Neurology. 2004. 63. 1868-1875.
14. Bhatia M., Howard S.C., Clark T.G. et al. Apo-lipoproteins as predictors of ischaemic stroke in patients with a previous transient ischaemic attack // Cerebrovasc. Dis. 2006. 21. 323-328.
APOE GENE POLYMORPHISM AND ISCHEMIC STROKE IN URBAN POPULATION OF WEST SIBERIA
Michail Ivanovich VOEVODA1, Sergei Vladimirovich SHISHKIN1, Vladimir Nikolaevich MAXIMOV1, Elena Vladimirovna SHAKHTSHNEIDER1, Yulia Vladimirovna SKURIHINA1,
Igor Viacheslavovich KULIKOV1, Aida Gerasimovna ROMASHENKO2
1Institute of Internal Medicine SB RAMS
630089, Novosibirsk, B. Bogatkov st., 175/1
2Institute of Cytology and Genetics SB RAS
630090, Novosibirsk, Academician Lavrentiev av., 10
In article sexual and age features of APOE gene polymorphism and its associations with indicators of blood lipid structure at Novosibirsk inhabitants suffering from ischemic stroke are described. It is noticed that at men in age group of more than 65 years old there are less often carrying of APOE gene’s e2/e3 and e3/e4 genotypes, than at women. Independent influence of APOE gene’s genotypes polymorphism on average level of cholesterol, triglycerideses and high-density lipoproteins cholesterol at ischemic stroke patients has not been revealed.
Key words: polymorphism, gene APOE, plasma lipids, gender, age, ischemic stroke.
Voevoda M.I. — doctor of medical sciences, professor, corresponding member of RAMS, director; e-mail: [email protected]
Shishkin S.V. — candidate of medical sciences, senior scientific researcher of laboratory of clinic population and prophylaxis investigations of therapeutic and endocrinology diseases
Maximov V.N. — doctor of medical sciences, leading scientific researcher of genetics laboratory Shakhtshneider E.V. — candidate of medical sciences, leading scientific researcher of genetics laboratory Skurihina Y.V. — post-graduate student
Kulikov I.V. — candidate of medical sciences, senior scientific researcher of genetics laboratory Romashenko A.G. — candidate of biological sciences, chief of laboratory of molecular bases of animals genetics
