CC BY
49
УДК 575.17 + 581.1
раздел БИОЛОГИЯ
ПОЛИМОРФИЗМ ДЫХАТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ У С4 ВИДА KOCHIA PROSTRATA (L.) SCHRAD В УСЛОВИЯХ ЗАСУХИ
© Е. В. Шуйская1, З. Ф. Рахманкулова1,3*, К. Н. Тодерич2,
Е. С. Семиошина1, И. Ю. Усманов3
1 Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук Россия, 127276 г. Москва, ул. Ботаническая 35.
E-mail: evshuya@mail.ru 2Международный Центр по развитию биоземледелия на засоленных почвах (ИКБА) Узбекистан, 100000 г. Ташкент, ул. Осие 6 А.
E-mail: k.toderich@yahoo.com 3Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди 32.
E-mail: iskander.usmanov@mail.ru
Проанализирован полиморфизм дыхательных белков у С4растения Kochia prostrata (L.) Schrad в условиях засухи. Выделено «адаптивное сочетание» генотипов ферментов, важных с энергетической точки зрения, которое, как предполагается, детерминирует формирование энергетического и редокс-балансов в процессе адаптации к водному стрессу.
Ключевые слова: С4 растения, полиморфизм белков, дыхание, редокс-баланс.
Введение
Давно идет дискуссия о биологическом смысле полиморфизма белков. Существуют две концепции, одна из которых склонна трактовать полиморфизм белков как селективно-нейтральный [1], другая - как адаптивную изменчивость, поддерживаемую различными формами отбора [2]. Если белковый полиморфизм функционально «нагружен» и представляет собой стабильную фазу эволюции, то становится очевидной необходимость этой генетической изменчивости и открывается уникальная возможность использования его в селекционных программах и оценке потерь естественного генного разнообразия в изменяющихся условиях внешней среды [3].
В энерготрансформирующие процессы вовлечено огромное количество ферментов, значительная часть которых представлена генетически детерминированными множественными молекулярными изоформами, функционирующими в различных клеточных компартментах. Показано, что эти изоферменты часто проявляют внутривидовой полиморфизм и широко применяются в популяционно-генетических исследованиях в качестве молекулярно-генетических маркеров, поскольку их гораздо легче обнаружить, чем другие белки, по катализируемой ими реакции [4]. В частности, в качестве таких маркеров часто используют дыхательные ферменты [5, 6]. Хотя известно, что энзимы прямо связанные с энергетическим метаболизмом менее изменчивы по сравнению с другими водорастворимыми - менее специализированными и функционально менее нагруженными белками [7]. Как правило, если ферменты первой группы используют субстраты, являющиеся специфическими метаболитами организма, то ферменты второй группы катализируют весьма разнообразные субстраты, поступающие из внешней среды. Кроме того, на основе анализа генетической изменчивости белков и их функциональной значимости, проведенных на дрозофиле, млекопитающих и человеке, Г. Джонсоном было сформулировано предположение, что ферменты, занимающие ключевые позиции в основных метаболических путях, должны быть наименее полиморфными [3, 8]. Детально же взаимо-
связь функций митохондрий и степени полиморфизма дыхательных белков у растений в стрессовых условиях практически не изучалась.
Цель данной работы - выявить возможную связь между генетической изменчивостью дыхательных ферментов и их функциональной значимостью у С4 растений, на примере Kochia prostrata (L.) Schrad в условиях засухи.
Материалы и методы
Kochia prostrata (L.) Schrad - многолетний С4 эуксерофит с НАДФ МЕ типом метаболизма, произрастающий в различных экологических условиях. Полиморфизм нескольких дыхательных белков: 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (6-PGD), глюкоза 6 фосфатдегидрогеназа (G-6-PD), малатдегидрогеназа (MDH), глутаматдегидрогеназа (GDH), фосфоглю-комутаза (PGM), фосфоглюкоизомераза (PGI), глу-томатоксалоацетаттрансаминаза (GOT), НАДН диафораза (DIA) (табл.) был изучен в восьми популяциях K. prostrata полуаридной и аридной зоны методом электрофореза. Материалом послужили семена (по 30-60 на популяцию), собранные с 1025 отдельных растений в каждой популяции K. prostrata. Для анализа семена очищали от крылаток и замачивали в воде в течении 12 часов до набухания, затем для экстракции ферментов зародыши гомогенизировали в 80 мкл буфера: EDTA, KCl, MgCl2, TRITON, PVP, TRIS-HCl. В полученном гомогенате пропитывали кусочки ватмана МЗ размером 11x12, которые затем вставлялись в прорезь в геле. Разделение энзимов проводилось в 10% крахмальном геле с использованием двух буферных систем [9]: (1) электродный буфер - Трис, лимонная кислота, pH 8.0; гелевый буфер - 10 мл электродный буфер, 90 мл Н2О, pH 8.0; (2) электродный буфер - борная кислота, NaOH, pH 8.2; гелевый буфер - Трис, лимонная кислота, pH 8.7. Электрофорез проводили в течении 4-6 часов при следующих условиях: (1) буферная система -90 В, 40-50 мА; (2) буферная система - 210 В, 70-80 мА при температуре 5 °С. Г истохимическое окрашивание ферментов и генетическая интерпретация проводились по [5, 10, 12] с некоторыми модификациями.
* автор, ответственный за переписку
Таблица
Биохимическая характеристика и полиморфизм ферментов в популяциях K. рrostrata (FIT, FST - коэффициенты инбридинга по Wright (1984)).
Г енетическая характеристика полиморфизма ферментов
Номенклатура Функция и систематическое % популяций, в средняя на-
фермента название фермента локусы блюдаемая Fit
которых полиморфны гетерозигот-ность (Ho) Fst
1 НАДН диафораза (E.C. 1.6.9.9) НАДН- : акцептор оксидоре- Dia A 50 0.106 0.115 0.184
DIA дуктаза Dia B 50 0.0З5 -0.026
0.015
Глюкоза-6-
2 фосфатдегидроге-наза (E.C. 1.1.1.49) НАДФ+ оксидоредуктаза G-6-pd 100 0.207 -0.089 0.018
G-6-PD 0.101 0.065 0.З07 0.079
З Малатдегидроге-наза (E.C. 1.1.1.З7) MDH L-малат : НАД+ оксидоредукта-за Mdh A Mdh B 75 50 0.207 0.056
4 Глутаматдегидро-геназа (E.C. 1.4.1.2) GDH L-глутамат: НАДФ оксидоре-дуктаза Gdh 100 0.682 -0.З56 0.016
5 Фосфоглюкомута-за (E.C.5.4.2.2) PGM Фосфоглюкоизо- 5-а-О-глюкоза-1,б- фосфомутаза Pgm 87.5 0.197 0.З29 0.125 -0.218
6 мераза (E.C. 5.З.1.) О-глюкоза-б-фосфатизомераза Pgi B 100 0.510 0.0ЗЗ
PGI
Глутоматоксало-
7 ацетаттрансамина- L-аспартат-2-оксоглутарат Got 75 0.616 -0.268
за (E.C. 2.6.1.1) GOT 6-фосфоглюконат- аминотрансфераза 0.046
8 дегидрогеназа б-фосфо-О-глюконат НАДФ+ 6-pgd 87.5 0.З18 -0.0З4
(E.C. 1.1.1.44) 2-оксидоредуктаза 0.049
6-PGD
Результаты
Восемь ферментных систем: 6-PGD, G-6-PD, MDH, GDH, PGM, PGI, GOT, DIA у K. prostrata кодируются 11 локусами, 10 из которых проявляют хорошую или удовлетворительную активность и разрешимость при электрофорезе. Все изученные локусы оказались полиморфными, то есть ни один локус не был абсолютно мономорфным. Локусы G-6-pd, Pgi B и Gdh были полиморфны во всех изученных популяциях, тогда как остальные в 5087.5% популяций (табл.). Число аллелей на локус варьировало от 2 (Got) до 5 (Pgi B). Наибольшее количество генотипов наблюдалось по локусам Pgm (8), 6-pgd (7), Pgi B (7) и Gdh (6) (рис. 1), что свидетельствует о высоком уровне их полимор -физма. Наличие такого полиморфизма белков, а также практически всего спектра внутривидового полиморфизма по изученным локусам в пределах каждой популяции резко отличает K. prostrata от других представителей Chenopodiaceae [11-15].
В целом, около 78% генов K. prostrata находятся в полиморфном состоянии и каждое растение
гетерозиготно по 34% генов. Кроме того, было обнаружено, что усиление аридности климата отражается на генетической структуре популяций K. prostrata в виде снижения гетерозиготности (на 15.6%) и в повышении дифференциации по отдельным адаптивно значимым локусам. Как известно, на популяционном уровне гетерозиготность обеспечивает возможность популяции восстанавливать свою генетическую структуру после выведения ее из равновесия - так называемого генетического гомеостаза [16], Вклад в общий уровень гетерози-готности популяций и селективность отдельных изоферментов в условиях водного дефицита различна (табл.). Значительный избыток гетерозигот (в таблице: отрицательные значения FIT) при высоком уровне наблюдаемой гетерозиготности обнаружен у локусов Gdh, Pgi B и Got (табл.), что свидетельствуют о значительном уровне полиморфизма данных ферментов. Межлокусная гетерогенность значений FST (от 0.014 до 0.184) подтверждает селективность части изоферментного полиморфизма.
O.8
O.6
0.4
0.2
1 * ♦ д
♦
♦
♦ &
і ♦
♦ А
♦
1 1
А А
& А ♦ г ♦
і д
0.4
0.2
А
А
А
А
Л
д
А
і
b
d
c d
Рис. 1. Частоты генотипов изученных локусов в восьми популяциях K. prostrata (ось Х - генотипы; ось Y - частота встречаемости).а) Mdh A (черные треугольники), Mdh B (белые треугольники), G6pd (звездочки); b) Dia A (черные треугольники), Dia B (белые треугольники), Gdh (звездочки); c) 6pgd (черные треугольники), Got (белые треугольники); d) Pgi
B (черные треугольники), Pgm (белые треугольники).
0.8
0.6
0.4
0.2
0
b
d
а
С
b
a
0.8
0.6
0
0
b
d
а
С
е
а
С
е
Частоты большинства генотипов локусов Біа В, Обрё, ОёЬ и МёЬ А схожи в изученных популяциях и составляет более 50% (рис. 1). Теоретически при наличии 12 генотипов локусов Біа В, Обрё, ОёЬ и МёЬ А возможно около 90 различных сочетаний генотипов, однако доминирует сочетание генотипов Біа В (а), О-б-рё (а), ОёЬ (с) и МёЬ А (а), частота встречаемости которых во всех популяциях полуаридной и аридной зоны равна 0.53-1.0, то есть составляет, как уже говорилось выше, более 50% от всего многообразия сочетаний. Это может быть объяснено дифференциальным отбором генотипов, который приводит к кооперации неаллельных генов [17]. Согласно многим авторам [18, 19], популяции составляют преимущественно особи с определенными «адаптивными» комбинациями генов, то есть интегрированными системами генов. Такие сочетания были найдены и в популяциях К. prostrata, выраженные в данном случае в сочетаниях генотипов ферментных локусов.
Обсуждение
Итак, на основе генетического анализа восьми изученных ферментов (табл.), были выделены четыре (Б1А, О-б-РБ, ОБИ, МБИ), которые образуют коадаптированные комбинации, отражающие степень реализации адаптационного потенциала данного вида в условиях водного стресса. Интересно, что именно эти четыре фермента из восьми исследованных имеют некоторые общие черты, а также занимают ключевые позиции в функционировании и регуляции дыхательного метаболизма в норме и при адаптации к водному дефициту (рис. 2).
Следует отметить следующие особенности этих ферментов - все они дегидрогеназы (т.е. относятся к классу оксидоредуктаз) (табл.) [20]. В качестве ко-ферментов у них используются пиридиннуклеотиды НАД+ и НАДФ+, которые являются, в тоже время, важными компонентами редокс-регуляции [21]. Все эти ферменты связаны с регуляторными точками двух основных дыхательных путей: дихотомического (гликолиз, ЦТК) и апотомического (ОПФП)
пируват
I
ПДК I
. диафораза
белки
Рис. 2. Основные дыхательные пути в растительной клетке: дихотомический (гликолиз, ЦТК) и апотомический (ОПФП). ЦТК - цикл трикарбоновых кислот; ПДК - пируватдегидрогеназный комплекс;
ОПФП - окислительный пентозофосфатный путь.
(рис. 2). Так, О-б-РБ - является ключевым ферментом ОПФП, катализирующим первый окислительный, необратимый этап этого пути, именно на уровне О-б-РБ поток метаболитов перераспределяется и может быть направлен по гликолитическому окислительному пути [22]. Показано, что существует две изоформы О-б-РБ - пластидная и цитозольная, активность которых регулируется посредством разных механизмов: пластидная с участием тиоредоксин-ферредоксиновой системы, т.е. непосредственно через механизм редокс-регуляции, а цитозольная форма О-б-РБ зависит от уровня сахаров в цитозоле [22, 23]. Три остальных фермента связаны с ключевыми реакциями цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). ОБН - катализирует реакцию восстановления а-кетоглутарата до І-глутамата, из которого за счет реакций переаминирования может образоваться целый спектр аминокислот, в частности пролин, играющий важную роль при стрессе, в том числе при засухе и при засолении [24], участвующий в поддержании клеточного гомеостаза, включающий ре-
докс-баланс и энергетический статус, а также в качестве сигнальной молекулы, являющийся модулятором митохондриальной функции при стрессе [25]. Кроме того ОБН обеспечивает анаплеротические реакции которые могут пополнять ЦТК путем образования а-кетоглутарата действием глутаматдегид-рогеназы на глутамат. В опытах на горохе показана тесная связь между ОБН и альтернативным цианид-резистентным путем дыхания [2б], играющим важную роль в регуляции дыхания растений, особенно в стрессовых условиях. Кроме того показано, что ОБН принимает участие в работе ОАВА-шунта, который является обходным путем 2-х реакций ЦТК, играет метаболическую и сигнальную роль, участвует в регуляции дыхательной ЭТЦ (на уровне сукцинат семиальдегид дегидрогеназы, которая может поставлять НАДН на сукцинат и в дыхательную цепь) [27]. Также, показана активация ОАВА шунта при неблагоприятных внешних условиях, в частности в защите от окислительного стресса [28], выполняет протекторную функцию при засухе и засолении [29], через
активацию пролин/GABA транспортеров, поставляющих органические осмолиты [27].
MDH катализирует превращение L-малата в оксалоацетат в ЦТК, т.е. завершающий этап данного цикла [20]. Изоформы MDH есть в различных компартментах клетки (митохондрии, хлоропласты и цитоплазма) [23]. Малатдегидрогеназный комплекс представлен четырьмя дегидрогеназами, две из которых обладают оксидоредуктазной активностью, а две другие декарбоксилирующие MDH. Благодаря работе данной ферментной системы, осуществляется стыковка и сопряжение отдельных метаболических процессов в растениях [30]. DIA входит в состав двух ферментных комплексов: пи-руватдегидрогеназного (ПДК) и а-кетоглутарат дегидрогеназного [20], которые, как известно, являются важными этапами регуляции ЦТК [31].
Данные ферменты представляют собой НАД(Ф)+-зависимые оксидоредуктазы, которые участвуют в образовании восстановительных эквивалентов и занимают ключевые позиции в функционировании и редокс-регуляции дыхательного метаболизма. При этом данные ферменты у K. prostrata, с одной стороны, характеризуются уровнем полиморфизма не меньшим, чем другие изученные белки, что не согласуется с гипотезой Г. Джонсона [8]. С другой - составляют «адаптивное сочетание генотипов» для популяций K. prostrata, произрастающих в различных экологических условиях аридной и полу-аридной зоны, которое, возможно, детерминирует формирование энергетического и редокс-балансов при адаптации к стрессу [32].
Выводы
1. Обнаружен высокий уровень полиморфизма всех изученных ферментов у K. prostrata
2. Высказано предположение, что наличие сбалансированных коадаптированных сочетаний генотипов (Dia B(a), G-6-pd(a), Gdh(c), Mdh A(a)) ферментов, важных с энергетической точки зрения, детерминирует формирование энергетического и редокс-балансов в процессе адаптации к стрессу.
Работа выполнена частично за счет средств проекта 6.3. Программы Президиума РАН «Изменение окружающей среды и климата: природные и связанные с ними техногенные катастрофы» и гранта РФФИ «12-04-97023-р_поволжье_а».
ЛИТЕРАТУРА
1. Kumura M. The neutral theory of molecular evolution. Cambridge: University Press. 1983. 367 p.
2. Айала Ф. Введение в молекулярную и эволюционную генетику. М.: Мир.1984. 230 с.
3. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. М.: Академкнига. 2003.431 с.
4. Koch M., Bernhardt K. Comparative biogeograpHy of the cytotypes of annual Microthlaspi perfoliatum (Brassicaceae) in Europe using isozymes and cpDNA data: refugia, diversity centers and postglacial colonization // American Journal of Botany. 2004. V. 91. P. 115-124.
5. Soltis D. E., Soltis P. S. Isozymes in plant biology. 1992. Springer. 268 p.
6. Vertleij J. A. C., Koniuszek W. J. Genetic variability in Cha-maenerion angustifolium (L.) Scop. (Onagraceae) occurring on contrasting soils // Genetica. 1981. №55. P. 151-159.
7. Gillespie J. H., Kojima K. The degree of polymorpHism in enzymes involved in energy production compared to that in nonspecific enzymes in two DrosopHila ananassae populations
// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1968. V. 61. P. 581-585.
8. Johnson G. B. Genetic polymorpHism and enzyme function // Molecular Evolution / Ed. F. Ayala. Sunderland (Mass): Si-nauer Assoc. Publ. 1976.P. 46-59.
9. Muona O., Szmidt A. A multilocus study of natural populations of Pinus sylvestris. in: Population genetics in forestry. // Lect. Notes Biomath. 1985. N 60. P. 226-240.
10. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Потенко В. В. Руководство по исследованию хвойных видов методом электрофоретического анализа изоферментов. 1989. Гомель: Изд. Белорусского НИИ лесного хозяйства. 150 с.
11. Wojnicka-Poltorak A., Chudzinska E., Shuiskay E., Barchak H., Toderich K. N., Prus-Glowacki W. Izoenzymatic and cytolodical studies of some asiatic species of the genus Salsola //Acta Societa-tis Botanicorum Polonae. 2002. V. 71. №2. P. 115-120.
12. Crawford D. J. Allozyme studies in Chenopodium incanum: intraspecific variation and comparison with Chenopodium fremonti // Bulletin of the Torrey Botanical Club. 1977. V. 106. №4. P. 257-261.
13. Crawford D. J., Wilson H. D. Allozyme variation in several closely related diploid species if Chenopodium of the Western United States // American Journal of Botany. 1979. V. 66. №3. P. 237-244.
14. Wilson H. D. Genetic variation among south American populations of tetraploid Chenopodium sect. Chenopodium subsect. Cellulata // Systematic Botany. 1981.V. 6. №4. P. 380-398.
15. Ryan F. J., Ayres D. R. Molecular markers indicate two cryptic, genetically divergent populations of Russian thistle (Salso-la tragus) in California // Cannadian Journal of Botany. 2000. V. 78. P. 59-67.
16. Lerner I. M. Genetic homeostasis. N.Y.: Wiley. 1954.134 p.
17. Животовский Л. А., Духарев В. А. 1985. Гаметическая интеграция у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.). М.: Наука. 147 с.
18. Левонтин Р. Генетические основы эволюции. М.: Мир. 1978. 349 с.
19. Caugant D. A., Levin B. R., Selander R. K. Genetic diversity and temporal variation in the E. coli population of a human host // Genetics. 1981. V. 98. P. 467-490.
20. Биссвангер Х. Практическая энзимология. М.: Бином. Лаборатория знаний. 2010. 328 с.
21. Foyer C. H, Noctor G. Redox Regulation in PHotosynthetic Organisms: Signaling , Acclimation, and Practical Implications // Antioxidants & redox signaling. 2009. V. 11. №4. P. 861-906.
22. Esposito S., Guerrieo G., Vona V., Di Martino Rigano V., Carfagna C, Rigano C. Glucose-6P dehydrogenase in chlorella sorokiniana (211/8k): an enzyme with unusual characteristics // Planta. 2006. V. 223. Р. 796-804.
23. Scheibe R. Malate valves to balance cellular energy supply // PHysiologia plantarum. 2004.V. 120. P. 21-26.
24. Kavi Kishor P. B., Sangam S., Amrutha R. N., Sri Laxmi P., Naidu K. R., Rao K. R. S. S., Rao S., Reddy K. J., Theriappan P., Sreeniva-sulu N. 2005. Regulation of Proline Biosynthesis, Degradation, Uptake and Transport in Higher Plants: Its Implications in Plant Growth and Abiotic Stress Tolerance // Curr. Sci. V. 88. Р. 424-438.
25. Szabados L., Savoure A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends in plant science. 2010. V. 15. №2. P. 89-97.
26. Frechilla S., lasa B., Aleu M., Juanarena N., Lamsfus C., Apa-ricio-Tejo P.. Short-term ammonium supply stimulates glutamate dehydrogenase activity and alternative pathway respiration in roots of pea plants // Journal Plant pHysiology. 2002. V. 159: P. 811-818.
27. Boushe N., Fromm H. GABA in plants: just a metabolite? // Trends in Plant Science. 2004. V 9. №3. Р. 110-115.
28. Coleman S. T. Fang T. K., Rovinsky S. A., Turano F. J., Moye-Rowley W. S. Expression of a glutamate decarboxylase homologue is required for normal oxidative stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae // Journal Biology Chemistry. 2001. V. 276. P. 244-250.
29. Rentsch D. et al. Salt stress-induced proline transporters and salt stress-repressed broad specificity amino acid permeases identified by suppression of a yeast amino acid permease-targeting mutant // Plant Cell. 1996. №8. 1437-1446.
30. Епринцев А. Т., Федорина О. С. Функционирование ма-латдегидрогеназного комплекса в мезофилле и обкладке кукурузы в условиях солевого стресса // Журнал стресс-физиологии и биохимии. 2006. №2. С. 4-9.
31. Heldt H. Plant biochemistry. Elsevier. 2005. 647 p.
32. Рахманкулова З. Ф. Уровни регуляции энергетического обмена в растениях // Вестник Башкирского университета. 2009. Т. 14. №3(I). С. 1141-1154.
Поступила в редакцию 13.05.2012 г.
