CC BY
30
УДК 575.1:582.475
АЛЛОЗИМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ФЕРМЕНТОВ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ (LARIX SIBIRICA LEDEB.)
И ЛИСТВЕННИЦЫ КАЯНДЕРА (LARIX CAJANDERI MAYR)
Н.В. Орешкова
Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок, 50; е-mail: [email protected]
Методом электрофореза в 13 % крахмальном геле были исследованы ферменты в эндоспермах семян и вег е-тативных почках 156 деревьев в шести популяциях лиственницы сибирской из Красноярского края и двух поп у-ляциях лиственницы Каяндера из Якутии и Магаданской области. Дано описание электрофоретического полиморфизма 13 ферментных систем (MDH, SKDH, 6-PGD, IDH, GOT, LAP, PGI, FDH, PGM, GDH, PEPCA, G-6PD, SOD). Показано, что аллозимное разнообразие этих ферментов находится под контролем 22 генов, пять из которых (Lap-1, Pgi-1, Gdh, Pepca и G-6pd) являются мономорфными, а остальные (Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Mdh-4, 6-Pgd-1, 6-Pgd-2, Got-1, Got-2, Got-3, Lap-2, Idh, Pgi-2, Pgm-1, Pgm-2, Fdh, Skdh-2 и Sod-1) обнаруживают изменчивость хотя бы в одной из изученных популяций. Сегрегация аллельных вариантов подтверждает менделевское моногенное наследование выявленных аллозимных вариантов.
Ключевые слова: аллозимные варианты, наследование, полиморфизм, фермент, попул яция, лиственница
Using the 13 % starch gel electrophoresis, the enzymes of seed endosperms and vegetative buds collected from 156 trees in six populations of Siberian larch from Krasnoyarsk territory and two populations of Cajanderi larch from Yak u-tia and Magadan province were studied. A detailed analysis of electrophoretic variability of 13 enzyme systems: MDH, SKDH, 6-PGD, IDH, GOT, LAP, PGI, FDH, PGM, GDH, PEPCA, G-6PD, and SOD is presented. It was demonstrated in the study that these enzymes are encoded by 22 genes. Five of them (Lap-1, Pgi-1, Gdh, Pepca and G-6pd) were mo-nomorphic, while all other genes (Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Mdh-4, 6-Pgd-1, 6-Pgd-2, Got-1, Got-2, Got-3, Lap-2, Idh, Pgi-2, Pgm-1, Pgm-2, Fdh, Skdh-2 and Sod-1) were polymorphic. Allele segregation confirmed Mendelian monogenic inheritance of the revealed allozyme variants.
Key words: allozyme variants, inheritance, polymorphism, enzyme, population, larch
ВВЕДЕНИЕ
Лиственничные экосистемы занимают около 37% всей лесной площади нашей страны, причем основные массивы лиственничников расположены в Азиатской части России. Такое широкое распр о-странение лиственницы обусловлено ее экологической пластичностью, что предполагает ее значительную видовую и внутривидовую экологогенетическую дифференциацию. Лиственничные леса Азиатской России обладают богатейшими з а-пасами древесины и имеют огромное биосферное и экологическое значение не только для Ро ссии, но и для других стран.
Несмотря на значительное число иссл едований, многие вопросы биологии и экологии лиственницы остаются слабо изученными, что объясняется недостаточным использованием современных мет о-дов изучения биоразнообразия древесных ра стений и лесных экосистем (изоферментный анализ, исследования ДНК-полиморфизма и др.).
Использование изоферментов (изоэнзимов) в качестве генных маркеров позв олило получить
*Работа выполнена при частичной финансовой поддер ж-ке Президиума РАН (Программа «Динами ка генофондов растений, животных и человека»), СО РАН (пр оект № 12.1, № 5.18.), РФФИ (проекты № 06-04-48052, № 06-0481026), РФФИ-ККФН (проект № 07-04-96822).
данные о состоянии генетических ресурсов ц елого ряда видов хвойных (Guries, Ledig, 1978; Yeh, El-Kassaby, 1980, Loukas et о1., 1983; Алтухов и др., 1986;. Крутовский и др., 1986; Шурхал и др., 1989; Крутовский и др., 1989; Потенко, Кривко, 1993; Янбаев и др., 1997). В значительной степени это обусловлено тем, что хвойные, благодаря особе н-ностям своей системы размножения, являются ид е-альным объектом для применения изоэнзи много метода анализа генетической изме нчивости. Как известно, яйцеклетка и клетки, формирующие га п-лоидную ткань эндосперма, имеют общее происх о-ждение от одной мегаспоры и возникают при ее митотическом делении. Развитие зрелого с емени происходит после оплодотворения яйцеклетки, из которой образуется зародыш, окруженный гапл о-идной тканью эндосперма. Электрофоретический анализ водных экстрактов ткани эндоспермов п о-зволяет изучать гаплотипы материнских гамет и по сегрегации аллельных вариантов ферментов уст а-навливать генотип дерева (Крутовский и др., 1987). В соответствии с менделевскими закономерностями при моногенном наследовании у деревьев, гетер о-зиготных по какому-либо локусу, аллельные варианты ферментов (аллоз имы) эндоспермов семян должны сегрегировать в соотношении 1:1. Это с у-щественно облегчает и ускоряет проведение ген е-тических исследований в популяциях хвойных, п о-скольку отпадает необходимость в проведении сп е-
циальных скрещиваний и анализе потомства в поколениях.
В связи с этим одной из первоочере дных задач исследования было описание и изучение наслед о-вания электрофоретического разнообразия вкл ю-ченных в анализ ферментов лиственницы сиби р-ской и лиственницы Каяндера. Резул ьтаты этой работы, конечной целью которой являлось выявл е-ние пригодных для генетико -популяционных исследований видов лиственницы аллозимных марк еров структурных генов, изложены в данной статье.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов для исследования были выбраны шесть природных популяций лиственн и-цы сибирской из трех районов ее естественного распространения на территории Красноярского края и две природные популяции лиственницы К а-яндера из Якутии и Магаданской области. В табл и-це 1 представлены название, расположение и географические координаты изуче нных популяций.
Материалом для исследования послужили с е-
мена и вегетативные почки, собранные со 156 деревьев. Предварительно семена замачивались в дистиллированной воде в течение 24 часов. Затем эндосперм отделялся от зародыша и растирался в 12 каплях экстрагирующего буфера: 0,05 М Трис-HCl pH 7,7, содержащего дитиотрейтол (0,06 %), трилон Б (0,02 %) и Р-меркаптоэтанол (0,05 %). У каждого дерева анализировалось не менее 6 мега-гаметофитов. Гомогенизацияя вегетативных почек проводилась этим же буфером за день до проведения электрофоретического анализа. Полученные экстракты хранились в морозильной камере.
Электрофоретическое фракционирование эк с-трактов проводилось методом горизонтального электрофореза в 12-13 % крахмальном геле при температуре 5 °С в течении 6 часов при параметрах тока 170 V, 40 mA в трех буферных системах: I -трис-цитратной рН 6,2 (Adams, Joly, 1980), II -трис-цитратной рН 8,5 / гидроокись лития-боратной рН 8,1 (Ridgway et al., 197Q), III - трис-ЭДТА-боратпой pH 8,6 (Корочкип и др., 1977). Составы гелевьк и электродный буферов пе отличались от рекомендуемый.
Таблица 1 - Расположение исследованных популяций лиственницы
Вид
Популяция
Район расположения
Географические координаты
р
и
а
ц
и
н
н
ц
и
н
н
Популяция №1 (Ужур)
Популяция №2 (Ужур)
Популяция №3 (Ирбей)
Популяция №4 (Горбиачин)
ц Популяция №5 (Сyxaриxa)
Популяция №6 (Ирбо)
Популяция №7 (Якутия)
Популяция №8 (Магадан)
Ужурский район Красноярского края
располагается в 20 км на восток от г. Ужура, в пойме ручья Простокишин
на юго-восточном склоне Солгонского хребта.
Ирбейский район Красноярского края
предгорье Восточного Саяна
полуостров Таймыр
бассейн реки Г орбиачин, на склоне юго -восточной экспозиции
бассейн реки Сухариха, приблизительно в 100 км с е-веро-восточнее города Игарка, западная экспозиция склона
долина реки Ирбо, северо-восточная экспозиция склона
Т аттинский улус, окрестности поселка Чичимах (Ре с-публика Саха)
располагается в 250 км на восток от г. Магадана, бассейн реки Яма, территория государственного приро д-ного заповедника «Магаданский» (Магаданская о б-ласть)______________________________________________
55°15'с.ш.
90°10'в.д
55°20'с.ш.
90°15'в.д
55°20'с.ш.
95°43'в.д
67° 13' с.ш.
90° 32' в.д.
67° 13' с.ш.
87° 47' в.д.
68° 26' с.ш.
90° 19'в.д.
61° 4Q' с.ш.
130° 00'в.д.
между 59° 32' и 59° 48'с.ш. 153° 20' и 153° 57'в.д.
Гистохимическое окрашивание проводилось по стандартным прописям (Brewer, 1970; Shaw, Prasad, 1970; Vallejos, 1983; Manchenko, 1994) с некоторыми модификациями. Включенные в анал из ферменты, используемые для их электрофоретическ ого разделения буферные системы, число идентифицируемых локусов и аллелей приведены в таблице 2.
Обозначение ферментов, локусов и аллелей производилось по Ф. Айала (Айала, 1984). Аллели обозначалось следующим образом: наиболее часто встречающийся аллель локуса получал цифровой символ 100, остальным аллелям присваивались номера в соответствии с их электрофоретической
подвижностью относительно аллеля 100, например, 132, 105, 95 и т.д. Фенотипически не выраженные аллели обозначались “null”.
Генетический контроль выявленных электр о-форетических вариантов ферментов изучали сь методом анализа их сегрегации среди эндоспермов семян, взятых отдельно c каждого дерева. Гетер о-зиготное по какому-либо ферментному локусу дерево продуцирует эндоспермы, несущие аллел ь-ные варианты, в соотношении 1:1. Степень соо т-ветствия наблюдаемых соотношений аллозимов ожидаемым оценивалась с помощью критерия %2 (Айала, 1984).
Фермент Идентифицируемые локусы Число выявленных аллелей Буферная система
Mdh-1 2
Малатдегидрогеназа Mdh-2 3 I
(MDH, 1.1.1.37) Mdh-3 Mdh-4 6 2
Шикиматдегидрогеназа Skdh-2 2 I
(SKDH, 1.1.1.25)
6-фосфоглюконатдегидрог еназа 6-Pgd-1 3 I
(6-PGD, 1.1.1.44) 6-Pgd-2 3
Изоцитратдегидрогеназа Idh Got-1 2 2 I
(IDH, 1.1.1.42)
Глутаматоксалоацетаттрансаминаза (GOT, 2.6.1.1) Got-2 Got-3 2 2 II
Лейцинаминопептидаза Lap-1 1 II
(LAP, 3.4.11.1) Lap-2 3
Фосфоглюкоизомераза Pgi-1 1 II
(PGI, 5.3.1.9) Pgi-2 3
Формиатдегидрогеназа( FDH, 1.2.1.2) Fdh 3 II
Фосфоглюкомутаза Pgm-1 3 II
(PGM, 2.7.5.1) Pgm-2 2
Глутаматдегидрогеназа Gdh 1 III
(GDH, 1.4.1.2)
Фосфоенолпируваткарбоксилаза (PEPCA, 4.1.1.31) Pepca 1 III
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6PD, 1.1.1.49) G-6pd 1 III
Супероксиддисмутаза Sod-1 2 III
(SOD, 1.15.1.1)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе электрофоретического анализа тринадцати ферментов в эндоспермах семян и вегетати в-ных почках отдельных деревьев лиственниц сиби р-ской и Каяндера из восьми природных популяций обнаружено 50 стабильно проявляющихся аллельных вариантов, находящихся под ко нтролем 22 ген-ферментных локусов. Восемь аллельных вариантов ферментов были выявлены только при изучении популяций лиственницы Каяндера. На рисунке, демонстрирующим расположение на геле обнар уженных аллельных вариантов ферментов, эти вар и-анты отмечены звездочкой.
Малатдегидрогеназа (МЭИ). Электрофоретический спектр МОИ включает в себя четыре зоны ферментативной активности, контролируемые ч е-тырьмя независимыми локусами: Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3 и Mdh-4. Локус Mdh-1, контролирующий наиболее быстромигрирующую зону фе рмента, является полиморфным, в нем бнаружено два ал ь-тернативных аллеля: Mdh-1100, Mdh-193. Один из них, «медленный» Mdh-193, является редким. Локус Mdh-2 в исследованных популяциях лиственницы сибирской представлен двумя аллелями (Mdh-2112, Mdh-2100). Самым высокополиморфным оказался локус Mdh-3, имеющий пять однополосных аллелей (Mdh-3113, Mdh-3100, Mdh-368, Mdh-352, Mdh-324). В четвертой зоне ферментативной активности, дете р-минируемой локусом Mdh-4, выявлено два аллеля (Ш^4200, Mdh-4100) (рис.).
У лиственницы Каяндера локусы: Mdh-1, Mdh-4 оказались мономорфными. Локусы Mdh-2 и Mdh-3 обнаруживают изменчивость. Причем в обоих ло-
кусах у данного вида обнаружены аллели (Mdh-288, Mdh-3130) не встречающиеся у лиственницы сибирской.
У всех исследованных до настоящего времени видов лиственниц, как правило, идентифицир уются четыре локуса (Cheliak, Pitel, 1985; Fins, Seeb, 1986; Ларионова, 1988 а, б; Lewandowski et al., 1991; Ying, Morgenstern, 1991; Потенко, Разумов, 1996; Гончаренко, Силин, 1997; Ларионова, Яхнева, 2003; Яхнева, 2004).
Шикиматдегидрогеназа (SKDH). На гелях, окрашенных на SKDH, выявляется две зоны активности фермента, кодируемые локусами Skdh-1 и Skdh-2. Из двух выявленных зон стабильно проявлялась лишь медленномигрирующая зона, контр о-лируемая локусом Skdh-2. Локус Skdh-1 вследствие очень слабого и непостоянного окрашивания был исключен из анализа. Второй локус представлен двумя аллелями (Skdh-2100 и Skdh-276), кодирующими однополосные варианты фермента с измене нной подвижностью (рис.).
Однолокусный контроль электрофоретического разнообразия SKDH установлен у лиственницы Гмелина, сибирской, Сукачева, западной, европе й-ской, курильской, японской (Fins, Seeb, 1986; Lewandowski et al., 1991; Гончаренко, Силин, 1997; Шигапов и др., 1998; Ларионова, Яхнева, 2003; Ях-нева, 2004). У лиственницы американской выявлено две зоны активности фермента, кодируемые 2 -мя независимыми локусами: Skdh-1 и Skdh-2 (Ying, Morgenstern, 1990).
6-Фосфоглюконатдегидрогеназа (6-PGD). В результате генетического анализа электрофорет и-ческой изменчивости 6-PGD у лиственниц
сибирской и Каяндера выявлено два локуса: 6-Pgd-
1, 6-Pgd-2. У локуса 6-Pgd-1 обнаружено три алло-зимных варианта фермента: два различающиеся по подвижности (6-Pgd-1117, 6-Pgd-1100) и один нулевой (6-Pgd-1nul1). Приэтом аллозимный вариант Pgd-
1nul1 обнаружен лишь в популяции лиственницы Каяндера из Якутии с частотой чуть более 2%. Л о-кус 6-Pgd-2 имеет три аллеля (6-Pgd-2124; 6-Pgd-2100; 6-Pgd-285) (рис.).
У лиственницы американской идентифицир о-ваны также два локуса, кодирующие 6 -PGD, причем оба локуса полиморфны (Ying, Morgenstern, 1990). А при изучении лиственницы Гмелина ( Se-merikov et al., 1999; Ларионова, Яхнева, 2003; Яхне-ва, 2004) и лиственницы сибирской (Семериков, Матвеев, 1995; Ларионова и др., 2003; Яхнева, 2004) был установлен однолокусный контроль электрофоретического разнообразия 6-PGD.
Изоцитратдегидрогеназа (IDH). На гелях, окрашенных на IDH, наблюдается одна зона ферментативной активности (рис.). Она проявляется в в иде узкой хорошо окрашивающейся полосы ферме нта, кодируемой мономорфным локусом Idh. Исключением является лишь популяция лиственницы Кая н-дера из Якутии, где было обнаружено два ра зли-чающихся по подвижности однополосных вар ианта фермента (Idh100, Idh19).
В изученных ранее популяциях лиственницы сибирской (Ларионова, 1988 а, б; Семериков, Матвеев, 1995; Ларионова и др., 2003) локус Idh был мономорфным. Не обнаружено изменчивости в этом локусе и у других видов лиственницы ( Lewan-dowskii, Mejnartowicz, 1990; Потенко, Разумов, 1996; Гончаренко, Силин, 1997; Semerikov et al., 1999).
При исследовании лиственницы Гмелина из Эвенкии и Восточного Забайкалья было выявлено три различающихся по подвижности однополосных варианта IDH, кодируемых аллелями одного генного локуса Idh (Ларионова, Яхнева, 2003; Яхнева, 2004). У лиственницы западной этот локус также полиморфен, причем практически во всех исслед о-ванных популяциях (Fins, Seeb, 1986).
Глутаматоксалоацетаттранс аминаза (GOT). Выявляется на геле в 3 -х пространственно разделенных зонах активности фермента, которые, как показал генетический анализ, контролируются 3-мя полиморфными локусами: Got-1, Got-2, Got-3 (рис.), каждый из которых представлен двумя аллелями (Got-1107, Got-1100; Got-2111, Got-2100; Got-3100, Got-346). Необходимо отметить, что локус Got-3 полиморфен только лишь в популяциях лиственн и-цы Каяндера. В исследованных нами популяциях лиственницы сибирской этот локус является моно-морфным.
Трехлокусный контроль электрофоретической изменчивости GOT установлен и при изучении лиственницы сибирской из Приангарья (Ларионова и др., 2003), лиственницы Гмелина (Потенко, Раз умов, 1996; Ларионова, Яхнева, 2003; Яхнева, 2004), а также у лиственниц западной (Fins, Seeb, 1986), Сукачева (Тимерьянов и др., 1996; Шигапов и др.,
1998), курильской и японской (Гончаренко, Силин, 1997).
Лейцинаминопептидаза (LAP) При окрашивании гелей на LAP у лиственниц сибирской и Ка-яндера, как и у других видов лиственницы (Ларионова, 1988 а, б; Шурхал и др., 1989; Lewandowskii, Mejnartowicz, 1990; Ying, Morgenstern, 1990; Семериков, Матвеев, 1995; Гончаренко, Силин, 1997; Шигапов и др., 1998), обнаружено две пространственно разделенные зоны активности фермента (рис.). Быстромигрирущая зона LAP-1 представлена одним вариантом фермента (Lap-1100), который выражен в виде единичной полосы. В менее подви ж-ной зоне LAP-2 у лиственницы сибирской обнар ужено три аллозимных варианта фермента: два о д-нополосных, различающихся по подвижнос ти (Lap-
^100 т ^у98\ ^ /т■ '\null\
2 , Lap-2 ), и один «нулевой» (Lap-2 ), кодируемые аллелями локуса Lap-2. У лиственницы Каяндера этот локус оказался мономорфным.
В популяции лиственницы сибирской из Бог учанского района Красноярского края локус Lap-1 был слабополиморфным, а локус Lap-2 мономорфным (Ларионова и др., 2003). У лиственницы Гме-лина из Эвенкии и Восточного Забайкалья быстр о-мигрирующая зона LAP-1 представлена 2-мя вариантами фермента, а в менее по движной зоне LAP-2 обнаужено три аллозимных варианта фермента (Ларионова, Яхнева, 2003; Яхнева, 2004).
Фосфоглюкоизомераза (PGI). На электрофере-грамме этого фермента выявляются две зоны а к-тивности. «Быстрая» интенсивно окрашенная зона PGI-1, находящаяся под контролем локуса Pgi-1, была инвариантной во всех изученных нами поп у-ляциях лиственниц сибирской и Каяндера. Вторая зона PGI-2 изменчива и кодируется отдельным л о-кусом Pgi-2 с двумя аллелями, Pgi-2100 и Pgi-292 у лиственницы сибирской и аллелями, Pgi-2100 и Pgi-
256 у лиственницы Каяндера. Все выявленные аллели продуцируют однополосные варианты фермента с измененной подвижностью (рис.).
Два локуса, кодирующих PGI, обнаружены и при исследовании листве нницы сибирской (Шурхал и др., 1989; Семериков, Матвеев, 1995) и америка н-ской (Cheliak, Pitel, 1985; Knowles et al., 1987; Ying, Morgenstern, 1990).
Формиатдегидрогеназа (FDH). Единственная зона активности этого фермента контролируется локусом Fdh, изменчивость которого определяется тремя аллелями. Эти аллели: Fdh100, Fdh86, Fdh78, кодируют анодмигрирующие однополосные варианты фермента, различающиеся по подвижности (рис.).
Одна зона активности этого фермента была в ы-явлена и при исследовании лиственниц Сукачева (Тимерьянов и др., 1996)_ и европейской (Lewandowskii, Mejnartowicz, 1990).
Фосфоглюкомутаза (PGM). При гистохимическом окрашивании геля были выявлены две зоны активности, находящиеся под контролем локусов Pgm-1 и Pgm-2, причем оба локуса проявляются в виде двух полос. Локус Pgm-1 представлен 3-мя аллелями: Pgm-1107', Pgm-1100, Pgm-190. Частый
Фермент 6-РСО «ОТ
Локус 6-1*ц(1-2 СоМ С.;о4>2 Оо«-3
Аллель 117 "Г 100 пиП* 116 1 100 "Г 85 107 [ 100 111 Т 100 100 Т*
— —
* *
Фермент МОН
Локус Мс1Ь-1 \1dh-2 М«Н1-3 \ldh-4
Аллель 100 1 чз 112 100 К» 130 1 113 1 100 1 68 1 52 1 24 200 100
— “ — _ —
Фермент шм РС1 рем 5КОН
Локус 1.Ш РвИ Рц1-2 Рцт-1 1’йт-2 £кйЬ-2
Аллель 100 79' ш 100 I 92 I 56 107 | 100 40 120' | 100 100 | 76
— — *
Фермент ЬАР РЕРСА С-6РО N00 сон ьон
Локус 1лр-1 Ьар-2 Рерса <.. 6||»1 &>4-1 C.dll 14111
Аллель 100 100 98 пиП 100 100 100 61 МИ> 100 86 78
— • — * _
Рисунок - Схематическое изображение и обозначение аллельных вариантов 22 ген -ферментных локусов лиственницы сибирской и лиственницы Каяндера
аллель оказался вторым по подвижности. Вт орой локус Pgm-2 был инвариантен во всех популяциях лиственницы сибирской. У лиственницы Каяндера в этом локусе были обнаружены два аллеля: Pgm-2120 иPgm-2100, (рис.).
Двухлокусный контроль электр офоретической изменчивости PGM установлен и при изучении п о-пуляций других видов рода Larix (Шурхал и др., 1989; Fins, Seeb, 1986; Семериков, Матвеев, 1995; Потенко, Разумов, 1996; Гончаренко, Силин, 1997; Semerikov et al., 1999). У лиственницы американской исследователи учитывают один локус PGM, но при этом указывают на нал ичие дополнительной зоны активности фермента (Cheliak, Pitel, 1985; Ying, Morgenstern, 1990).
Глутаматдегидрогеназа (GDH). Проявляется на геле в виде узкой хорошо окрашивающейся полосы фермента, кодируемой мономорфным л о-кусом Gdh (рис.). У большинства видов рода Larix генетический контроль GDH также осуществляе т-ся одним локусом, как правило мономорфным или слабополиморфным (Шурхал и др., 1989; Lewandowskii, Mejnartowicz, 1990; Т имерьянов и др., 1994; Семериков, Матвеев, 1995; Потенко, Разумов, 1996; Гончаренко, Силин, 1997; Ларионова, 1997; Ларионова, Яхнева, 20 03; Яхнева, 2003).
Фосфоенолпируваткарбоксилаза (PEPCA).
При окрашевании гелей на PEPCA выявляется одна
зона активности фермента, кодируемая мономор ф-ным локусом Pepca (рис.). У других видов хвойных также выявляется одна инвариантная зона PEPCA (Hussendorfer et al., 1995; Белоконь и др., 2005).
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6PD). На электрофореграмме этого фермента выявляется одна зона ферментативной активности, которая как и у других видов лиственницы (Cheliak, Pitel, 1985; Knowles et al., 1987; Шурхал и др., 1989; Lewan-dowski et al., 1991), контролируется локусом G-6pd. В исследованных нами популяциях листве нниц сибирской и Каяндера локус G-6pd мономорфен (рис.).
В богучанской популяции лиственницы сибирской данный локус также являе тся мономорфным, а в популяциях лиственницы Гмелина из Эвенкии, Забайкалья и Хабаровского края он обнаруживает изменчивость (Потенко, Разумов, 1996; Ларионова, Яхнева, 2003; Яхнева, 2004).
Супероксиддисмутаза (SOD). При окрашивании гелей на SOD выявляются две зоны активн ости, каждая из которых кодируется отдельным л окусом. Локус Sod-1, ответственный за проявление «быстрой» зоны, был инвариантным во всех проанализ и-рованных популяциях. Исключением стала лишь популяция лиственницы сибирской из Ирбея, где у локуса Sod-1 был выявлен аллель Sod-161 с частотой менее 2% (рис.). Локус Sod-2 не был включен в анализ из-за слабого и нестабильного окрашивания.
Таблица 3 - Сегрегация аллозимов среди эндоспермов семян гетерозиготных деревьев
Генотипы Число деревьев Соотношение аллельных вариантов Критерий x2
Mdh-1100/93 2 3:8 2,273
Mdh-2100/112 14 41:45 0,186
Mdh-2100/88 1 2:4 0,666
Mdh-2112/88 1 3:3 0,000
Mdh-3100/130 1 2:4 0,666
Mdh-3100/113 9 27:25 0,077
Mdh-3100/68 30 118:89 4,063
Mdh-368/52 3 11:6 1,470
Mdh-3100/52 14 43:34 1,052
Mdh-368/24 8 24:21 0,200
Mdh-3100/24 14 40:38 0,051
Mdh-4100/200 2 3:8 2,273
6Pgd-1100/117 4 6:17 5,261
6Pgd-1100/nun 1 4:2 0,666
6Pgd-2100/116 25 68:69 0,007
6Pgd-2100/85 18 52:44 0,666
6Pgd-2116/85 7 18:22 0,400
Got-1100/107 36 117:87 4,412
Got-2100/111 31 68:102 6,800
Got-3100/46 21 62:58 0,133
Lap-2100/98 1 5:1 2,666
Lap-2100/lmn 1 3:3 0,000
Idh100/79 3 10:7 0,529
Pgi-2100/92 1 3:3 0,000
Pgi-2100/56 15 41:47 0,409
Pgm-1100/107 21 58:62 0,133
Pgm-1100/90 7 19:17 0,111
Pgm-1107/90 3 9:8 0,059
Pgm-2100/120 7 17:23 0,900
Fdh100/86 1 3:3 0,000
Fdh100/78 1 4:2 0,666
Skdh-2100/76 15 62:24 16,790
Один мономорфный локус SOD выяв лен у лиственниц западной (Fins, Seeb, 1986) и Сукачева (Тимерьянов и др., 1994). В работе, посвященной лиственнице европейской, описываются два мономорфных локуса супероксиддисмутазы и упоминаются два редких аллеля в локусе Sod-2 (Mejnartowicz, Bergmann, 1975). Один локус SOD, контролируемый двумя аллелями, обнаружен у лиственниц сибирской (Шурхал и др., 1989) и американской (Cheliak, Pitel, 1985).
Анализы сегрегации выявленных аллельных вариантов ферментов среди эндоспермов семян гетерозиготных деревьев подтверждают их мон о-генное наследование. Из представленных в та блице 3 данных по сегрегации, суммированных для каждого типа гетероз игот, видно, что ни у одного из идентифицированных полиморфных локусов не наблюдалось достоверного отклон е-ния от ожидаемого для вариантов, кодируемых аллелями одного локуса, соотношения 1:1. Зн а-чение критерия соответствия хи-квадрат (%2) варьировало от 0 до 16.79
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований п о-лучены данные, свидетельствующие о генетич е-ской природе электрофоретического разнообр азия 13 ферментных систем лиственницы сиби р-ской и лиственницы Каяндера.
Установлено, что генетический контроль в ы-явленных аллозимов осуществляется 22 ген-ферментными локусами, пять из которых (Lap-1, Pgi-1, Gdh, Pepca и G-6pd) являются мономорф-ными, а остальные (Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Mdh-4, 6-Pgd-1, 6-Pgd-2, Got-1, Got-2, Got-3, Lap-2, Idh, Pgi-2, Pgm-1, Pgm-2, Fdh, Skdh-2 и Sod-1) обнаруживают изменчивость хотя бы в одной из из ученных популяций. Идентифицированные локусы продуцируют 50 аллозимных варианта ферме н-тов.
Девять локусов: Mdh-1, Mdh-4, Got-1, Got-2, Got-3, Idh, Pgm-2, Skdh-2 и Sod-1 являются диал-лельными, то есть представлены в популяциях двумя аллелями. Семь локусов: Mdh-2, 6-Pgd-1, 6-Pgd-2, Lap-2, Pgi-2, Pgm-1 и Fdh имеют по 3 аллеля. В локусе Mdh-3 выявлено 6 аллелей. В локусах 6-Pgd-1 и Lap-2 обнаружены аллели, не имеющие фенотипического выражения, так наз ы-ваемые нуль-аллели.
При изучении генетического контроля указанных ферментов не было выявлено существе н-ных различий между исследованными видами лиственницы по числу идентифицированных ген -ферментных локусов. Различия наблюдались лишь по уровню полиморфизма и сос таву аллелей ряда одноименных локусов.
Обнаруженные в процессе электрофореза а л-лозимные варианты ферментов наследуются как моногенные признаки и могут быть использов а-ны в популяционно-генетических исследованиях этих видов лиственницы в качестве биохимич е-ских маркеров структурных генов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Айала, Ф. Введение в популяционную и эволюцио нную генетику / Ф. Айала. - М.: Мир, 1984. - 230 с.
Алтухов, Ю.П. Аллозимный полиморфизм в природной популяции ели европейской (Picea abies (L.) Karst.) Сообщение I. Системы полиморфизма и механизмы их генного контроля / Ю.П. Алтухов, и др. // Генетика. - 1986. - Т. 22, № 8. - С. 2135-2151.
Белоконь, М.М. Аллозимный полиморфизм европе й-ской кедровой сосны (Pinus cembra L.) в горных популяциях Альп и Восточных Карпат / М.М. Белоконь, и др. // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 11. - С. 1538-1551.
Гончаренко, Г.Г. К вопросу о генетической изменчив ости и дифференциации лиственницы курильской (Larix kurilensis Mayr) и лиственницы японской (Larix kaempferi Sarg.) / Г.Г. Гончаренко, А.Е. Силин // ДАН. - 1997. - Т. 354, № 6. - С. 835-838.
Корочкин, Л.И. Генетика изоферментов/ Л.И. Корочкин, и др.. - М.: Наука, 1977. - 275 с.
Крутовский, К.В. Аллозимный полиморфизм в природной популяции ели европейской (Picea abies (L.) Karst.) Сообщение II. Частота редких аллелей и мутаций de novo / К.В. Крутовский, и др. // Генетика. -1986. - Т. 22, № 9. - С. 2310-2316.
Крутовский, К.В. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение I. Механизмы генного контроля изофер-ментных систем / К.В. Крутовский, Д.В. Политов, Ю.П. Алтухов // Генетика. - 1987. - Т. 23, № 12. -С. 2216-2228.
Крутовский, К.В. Генетическая изменчивость сиби рской кедровой сосны P. sibirica. Сообщение IV. Генетическое разнообразие и степень генетической дифференциации между популяциями / К.В. Круто в-ский, и др. // Генетика. - 1989. - Т. 25, № 11. - С. 2009-2032.
Ларионова, А.Я. Генетическая изменчивость листве н-ницы сибирской в Нижнем Приангарье / А.Я. Л а-рионова, Н.В. Яхнева, Н.А. Кузьмина // Лесоведение.-2003.-№ 4.-С. 17-22.
Ларионова, А.Я. Генетическая изменчивость листве н-ницы сибирской из Южного Забайкалья / А.Я. Ларионова // Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья: Тезисы докладов. - Чита. 1997.
- С. 100-101.
Ларионова, А.Я. Генетический полиморфизм и внутривидовая дифференциация лиственницы сибирской / А.Я. Ларионова // Десятый конгресс дендрологов. Современное состояние общего исследования ест е-ственной дендрофлоры с особым учётом сохран е-ния её генофонда. - София, 1988 б. - С. 239-244.
Ларионова, А.Я. Генетический полиморфизм и внутр и-видовая изменчивость лиственницы Сукачева / А.Я. Ларионова // Развитие генетики и селекции в лес о-хозяйственном производстве: Тезисы докладов Вс е-союзного научно-технического совещания. - Москва, 1988 а.-С. 31-33.
Ларионова, А.Я. Наследование аллозимных вариа нтов у лиственницы Гмелина / А.Я. Ларионова, Н.В. Яхне-ва // Хвойные бореальной зоны. - 2003. - Вып. 1. -С 60-66.
Потенко, В.В. Генетическая изменчивость и популяционная структура лиственницы даурской на территории Хабаровского края ./ В.В. Потенко, П.Н. Разумов // Лесоведение. - 1996. - № 5. - С. 11-18.
Потенко, В.В. Изменчивость и сцепление изофермент-ных локусов у ели восточной Picea orientalis (L.) Link./ В.В. Потенко, В.Г. Кривко // Генетика. - 1993.
- Т. 29, № 4. - С. 632-637.
Семериков, В.Л. Изучение генетической изменчивости лиственницы сибирской (Larix sibirica Ldb.) по изоферментным локусам / В.Л. Семериков, А.В. Матвеев // Генетика. - 1995. - Т.31, № 8. - С. 1107-1113.
Тимерьянов, А.Ш. Генетическая изменчивость лиственницы Сукачева (Larix sukaczewii Dyl.) на Южном Урале. II Уровни изоферментной изменчивости в природных популяциях / А.Ш. Тимерьянов, Н.В. Старова, Р.М. Бахтиярова // Генетика. - 1996. - Т. 32, № 2.-С. 267-271.
Тимерьянов, А.Ш. Генетическая изменчивость листве н-ницы Сукачева на Южном Урале. I Механизм генного контроля изоферментных систем / А.Ш. Т и-мерьянов, З.Х. Шигапов, Ю.А. Янбаев // Г енетика. -1994. - Т. 30, № 9. - С. 1243-1247.
Шигапов, З.Х. Генетическая структура уральских популяций лиственницы Сукачева / З.Х. Шигапов, и др. // Генетика. - 1998. - Т. 34, № 1. - С. 65-74.
Шурхал, А.В. Аллозимный полиморфизм лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) / А.В. Шурхал, и др. // Генетика. - 1989. - Т. 25, № 10. - С. 1899-1901.
Янбаев, Ю.А. Дифференциация популяций ели сибирской (Picea obovata Ledeb.) на Южном Урале / Ю.А. Янбаев, и др. // Генетика. - 1997. - Т. 33, № 9. -С. 1244-1249.
Яхнева, Н.В. Генетико-таксономический анализ популяций лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.): дис. ... к-та биол. наук: 03.00.05. / Н.В. Яхнева - Красноярск, 2004. - 157 с.
Adams, W.T. Genetics of allozyme variants in Lo blolly Pine / W.T. Adams, R.I. Joly // Heredity. - 1980. - Vol. 71. - P. 33-40.
Brewer, G.J. Introduction to isozyme techniques / G.J. Brewer - N.Y.-L.: Academ. press., 1970. - 186 p.
Cheliak, W.L. Inheritance and linkage of a llozymes in Larix laricina / W.L. Cheliak, J.A. Pitel // Silvae Genet. -1985.-Bd. 34.-S. 142-147.
Fins, L. Genetic variation in allozymes of western larch. / L. Fins, L.W. Seeb // Can. J. Forest. - 1986. -Vol. 16. - P. 1013-1018.
Guries, R.P. Inheritance of some polymorphic isoe nzymes in pitch pine (Pinus rigida Mill.) / R.P. Guries, F.T. Ledig // Heredity. - 1978. - Vol. 40. - P. 27-32.
Hussendorfer, E. Inheritance and linkage of isozyme variants of silver fir (Abies alba Mill.) / E. Hussendorfer, M. Konnert, F. Bergmann // Forest Genetics. - 1995. -
Vol. 2. - P. 29-40.
Knowles, P. Significant levels of self-fertilization in natural populations of tamarack / P. Knowles, et al. // Can. J. Bot. - 1987. - Vol. 65, N 6. - P. 1087-1091.
Lewandowski, A. Genetic structure and the mating sy stem in an old stand of polish larch / A. Lewandowski, J. Berczyk, L. Mejnartowicz // Silvae Genet. - 1991. -Bd. 40. - S. 75-79.
Lewandowskii, A. Inheritance of allozymes in Larix decidua Mill. / A. Lewandowskii, L. Mejnartowicz // Silvae Genet. - 1990. - Bd. 39. - H. 5 - 6. - S. 184-188.
Loukas, M. Isozyme variation and heterozygosity in Pinus halepensis L. / M. Loukas, Y. Vergini, G.B. Krimbas // Biochem. Genet. - 1983. - Vol. 21, N 5 - 6. - P. 497-510.
Manchenko, G.P. Handbook of detection of enzymes on electrophoretic gels / G.P. Manchenko. - CRC Press, Ins. 1994. - 574 p.
Mejnartowicz, L. Genetic studies on european larch (Larix decidua Mill.) employing isoenzyme polymorphisms / L. Mejnartowicz, F. Bergmann // Genetica polonica -1975.-V. 16.-N 1.-P. 29-35.
Ridgway, G.J. Polymorphism in the Esterases of Atlantic Harring / G.J. Ridgway, S.W. Sherburne, R.D. Lewis // Trans. Am. Fish. Soc. - 1970. - Vol. 99. - P. 147-151.
Semerikov, V.L. Intra- and interspecific allozyme variability in Eurasian Larix Mill. species / V.L. Semerikov, L.F. Semerikov, M. Lascoux // Heredity. - 1999. - Vol. 82. - P. 193-204.
Shaw, C.R. Starch gel electrophoresis of enzymes - a compilation of recipes / C.R. Shaw, R. Prasad // Bi ochem. Genet. - 1970. - Vol. 4. - P. 297-320.
Vallejos, C.E. Enzyme activity staining / C.E. Vallejos. // Isozymes in plant genetics and breeding. Pt.A / Eds. Tanksley S.D., Orton T.J. Amsterdam: Elsevier Sci. Publ. 1983. - P. 469-516.
Yeh, F.C.H. Enzyme variation in natural popul ations of Sitka spruce (Picea sitchensis). I Genetic variation patterns among trees from 10 IUFRO provenances / F.C.H. Yeh, Y.A. El-Kassaby // Can. J. For. Res. -1980. - Vol. 10, N 5. - P. 415-422.
Ying, L. Inheritance and linkage relationships of some is o-zymes of Larix laricina in New Brunswick, Canada / L. Ying, E.K. Morgenstern // Silvae Genet. - 1990. - Bd. 39.-H. 5-6.-S. 245-251.
Ying, L. The population structure of Larix laricina in New Brunswick. Canada / L. Ying, E.K. Morgenstern // Si l-vae Genet. - 1991. - Bd. 40, H. 5. - S. 180-184.
Поступила в редакцию 19 декабря 2007г. Принята к печати 16 мая 2008 г.
