CC BY
32
УДК575.174.015.3: 612.1:636.237.23
ПОЛИМОРФИЗМ -824 А/G ГЕНА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА И ПОКАЗАТЕЛИ ВОСПРОИЗВОДСТВА КОРОВ
Т.И. КРЫЦЫНА1, аспирант
Н.Н. КОЧНЕВ1, доктор биологических наук, профессор
Р.Б. АЙТНАЗАРОВ2, кандидат биологических наук, научный сотрудник,
Н.С. ЮДИН2 3 4, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, С. Н. ПЕЧУРИН4, студент
Новосибирский ГАУ, ул. Добролюбова, 160, г. Новосибирск, 630039, Россия
2Институт цитологии и генетики СО РАН, пр. ак. Лаврентьева, 10, г. Новосибирск, 630090, Россия 3НИИ терапии и профилактической медицины СО РАМН, ул. Б. Богаткова, 175/1, г. Новосибирск, 630089, Россия
4Новосибирский государственный университет, ул. Пирогова, 2, г. Новосибирск, 630090, Россия E-mail: krytsyna@list.ru
Резюме. Ген TNF-a кодирует белок - многофункциональный ци-токин, который, наряду с функциями иммунного ответа, участвует в процессах морфогенеза и развитии плода, играет важную роль в формировании молочной железы, стимулирует образование простагландинов. Цель нашей работы - исследование возможной ассоциации полиморфизма -824 А/G в промоторе гена TNF-a с показателями воспроизводства (возраст при первом осеменении, сервис-период, межотельный период, сухостойный период, стельность) у коров красной степной породы. Полиморфизм гена TNF-a изучали методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов. Для анализа использовали ДНК, выделенную стандартным методом протеолитической обработки с последующей экстракцией фенол-хлороформом из крови 148 коров красной степной породы из СХА ПЗ «Степной» Алтайского края. Показатели воспроизводства установлены на основе зоотехнического учета. В изученной выборке частоты встречаемости генотипов по гену TNF-a G/G, G/A и A/A составили соответственно 56, 38 и 6%. Частота редкого аллеля A была равна 25%, аллеля G - 75%. Распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. У животных с генотипом G/G возраст при первом осеменении был на 2 месяца ниже, чем у коров с генотипом G/A (p<0,05). Продолжительность стельности у животных с генотипом G/G превышала величину этого показателя у гетерозигот G/A на 6,6 дн. (p<0,05). По другим показателям (сервис-период, межотельный и сухостойный период) статистически достоверных различий между коровами разных генотипов не установлено. Ключевые слова: полиморфизм, фактор некроза опухоли альфа, TNF-a, воспроизводство, возраст при первом осеменении, сервис-период, стельность
Для цитирования: Полиморфизм -824 А/G гена фактора некроза опухоли альфа и показатели воспроизводства коров / Т.И. Крыцына, Н.Н. Кочнев, Р.Б. Айтназаров, Н.С. Юдин, С. Н. Печу-рин //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №1. С. 39-41.
Известно, что рост молочной продуктивности коров часто сопровождается снижением воспроизводительных функций, что служит основной причиной выбраковки животных [1]. Наряду с использованием зооветеринарных методов повышения воспроизводительной способности, в последние годы большой интерес представляет поиск генетических маркеров сложных признаков.
На сегодняшний день в мире широкое распространение получил метод геномной селекции, суть которого заключается в оценке вклада большого числа равномерно распределенных по геному генетических маркеров
в фенотипический признак на референсной популяции животных. В дальнейшем геномные племенные оценки можно вычислять только на основании генотипирования селекционных кандидатов. Однако в результате кроссин-говера, полученные на референсной популяции геномные племенные оценки необходимо переопределять заново через несколько поколений животных или при переходе на другую породу[2]. При обнаружении вариантов ДНК, которые непосредственно влияют на фенотипический признак, необходимость в такой переоценке отпадает, поэтому поиск подобных мутаций остается важной задачей [3].
В ряде работ установлено влияние однонуклеотидных замен (SNP) в генах, вовлеченных в работу эндокринной и иммунной систем, на функции воспроизводства [4-7]. Например, гетерозиготы С/Т по SNP Т > C в интроне 4 гена инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-1) отличались повышенной продолжительностью сервис-периода после рождения второго теленка, по сравнению с гомозиготами С/С [8]. Три SNP в кодирующих частях гена рецептора фол-ликулостимулирующего гормона (FSHR) ассоциированы с процентным выходом жизнеспособных эмбрионов и неоплодотворенных ооцитов после суперовуляции [9].
Поскольку в реализации воспроизводительных функций большую роль играет иммунная система, ген фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), который участвует в синтезе многофункционального белка из класса цитокинов, относится к числу перспективных генов, контролирующих репродуктивный потенциал молочного скота. Наряду с регуляцией иммунного ответа, TNF-a стимулирует образование простагландинов - липидных медиаторов, воздействующих на эндотелий и матку при родовой деятельности. Как известно, активность лейкоцитов укоров после отела снижена, наблюдается общее подавление иммунитета, что становится причиной маститов и эндометритов [10]. TNF-a стимулирует альтерацию, а также адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам сосудов [11]. Кроме того, TNF-a участвует в процессах морфогенеза и развития плода, а также играет важную роль в формировании молочной железы [12, 13].
В ряде работ продемонстрирована ассоциация полиморфизма гена TNF-a с молочной продуктивностью
[14], уровнем удоев в зависимости от пола теленка
[15], массой телят при рождении [16], сроком наступления первой овуляции после отела [17].
Цель нашей работы - исследование возможной ассоциации полиморфизма -824 А/G в промоторе гена TNF-a с показателями воспроизводства у коров красной степной породы.
Условия, материалы и методы. В работе использованы данные 148 коров красной степной породы из СХА ПЗ «Степной» Алтайского края. Сведения о воспроизводстве (возраст при первом осеменении, сервис-период, межотельный период, продолжительность стельности, сухостойный период, кратность осеменений) взяты из данных зоотехнического учета. Поскольку животных разных генотипов содержали в одинаковых условиях среды, влияние паратипических факторов на результаты исследований было несущественно.
ДНК выделяли с использованием стандартного метода протеолитической обработки с последующей экстракцией фенол-хлороформом.
Таблица 1. Возраст первого осеменения у коров разных генотипов по TNF-a
Показатель Генотип
G/G G/A A/A
x±Sx, мес Cv, % 24,6±0,5* 19,6 26,6±0,6 16,3 26,6±1,4 12,9
*p < 0,05, по сравнению с группой G/A
Полиморфизм гена TNF-a изучали с помощью метода ПЦР-ПДРФ с использованием прямого праймера 5 -CCGAGAAATGGGACAACCT-3 ' и обратного праймера 5'- GCCATGTATCCCCAAAGAAT-3'.
Фрагмент 145 п.н. амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 75 мМ ТрисНО (рН 9,0), 20 мМ (NH4)2SO4, 0,01% твина, 3 мМ MgCl2, по 200 мкМ каждого dNTP, по 1 мкМ каждого праймера, 2,5 ед. активности Taq-полимеразы («СибЭнзим»), 6% глицерина и 0,5-1 мкг ДНК в течение 35 циклов (95°C - 30 сек., 62°C - 30 сек., 72°C - 30 сек.) с предварительной денатурацией при 95°C - 3 мин.
Продукт амплификации подвергали рестрикции ферментом EcolCRI («CибЭнзим») в условиях, рекомендуемых производителем. Ампликон 145 п.н. либо оставался неразрезанным (аллель G), либо разрезался на фрагменты 81 и 64 п.н. (аллель A). Электрофорети-ческий анализ фрагмента проводили в 4%-ном ПААГ с добавлением бромистого этидия.
Статистический анализ выполнен с использованием компьютерных программ Statistica и Microsoft Excel. Оценку достоверности различий показателей воспроизводства коров с разными генотипами осуществляли методом дисперсионного анализа. Попарное сравнение между группами проводили путем post hoc анализа с использованием критерия Фишера.
Результаты и обсуждения. Исследование геноти-пической структуры по гену TNF-a показало, что доля гомозигот G/G и A/A в изученной популяции составляет соответственно 56 и 6%, доля гетерозигот G/A - 38%. Частота встречаемости аллеля G - 75%, аллеля А -25%. Частоты генотипов в популяции существенно не отличались от ожидаемых по распределению Харди-Вайнберга. Анализ генетического разнообразия по TNF-a у животных красной степной породы представлен в ранее опубликованных работах [14].
Среди параметров воспроизводительной способности коров выделяют возраст первого осеменения, который характеризует половую и физиологическую зрелость организма. С экономической и селекционной точки зрения считается предпочтительным более ранний срок осеменения. Мы установили, что у животных с генотипом G/G он наступает раньше, чем у особей с генотипом G/A, на 2 мес. (p<0,05), а также выявили тенденцию к более раннему осеменению, по сравнению генотипом A/A (табл. 1). Следовательно, можно предположить, что коровы с генотипом G/G достигают требуемой для осеменения живой массы за более короткий период. Такое предположение подтверждает установленное ранее превосходство коров с генотипом G/G по живой массе при рождении, в 6 и 12 мес. [16].
Результаты дисперсионного анализа свидетельствуют о достоверном влиянии генотипа по гену фактора некроза опухоли альфа на возраст первого осеменения (F(2; 144) =3,825, p=0,024).
Еще один важный показатель воспроизводства -продолжительность сервис-
периода. В исследовании Shirasuna et al. [17] показана ассоциация генотипа A/A с более длительным сервис-периодом после третьего отела, в сравнении с гомозиготами G/G, и ассоциация этого генотипа с задержкой первой овуляции после отела. Так, она наступала в течение трёх недель после отела она наступила лишь у14,3% животных с генотипом A/A, тогда как у особей с генотипом G/G и G/A - у 50 и 55,4% соответственно.
В нашем исследовании наблюдается общая картина изменения продолжительности сервис-периода животных с разными генотипами по гену TNF-a в течение шести лактаций с возрастом (см. рисунок). Ее увеличение после первого отела, возможно, связано с замедленным восстановлением репродуктивных органов. После четвертого отела в группах всех генотипов также отмечен более продолжительный сервис-период, но при этом показатели сильное расходятся. Это может быть следствием реакции генотипов на паратипические факторы. Возможно, доля средовой компоненты в фенотипическом проявлении этого признака с возрастом снижается, а генотипические различия при этом усиливаются.
Рисунок. Продолжительность сервис-периода по шести лактациям у коров с разными генотипами по гену TNF-a:
— G/G; «"С™» — G/A; «ым^омы*« — A/A.
Несмотря на низкую фенотипическую изменчивость показателя продолжительности стельности у коров разных генотипов (1-5%), различия между животными с генотипом G/G и G/A по третьей лактации были достоверны (p<0,05), у гомозигот она была дольше, чем у гетерозигот, на 6,6 дн (табл. 2).
Межотельный период характеризует воспроизводительную способность коров, интегрируя в себе продолжительность плодоношения и сервис-периода. Анализ не выявил достоверных различий между группами животных разных генотипов по величине этого показателя, а также по длительности сухостойного периода. Очевидно, чем больше параметров вовлекается в оценку генотипов, тем больше нивелируются различия между ними.
Результаты анализа свидетельствуют, что направление связи между изучаемыми признаками в зависимости от генотипа не менялось, в отличие от величин коэффициентов корреляции по всем коррелирующим парам. Например, у животных с генотипом G/A коэффициент корреляции
Таблица 2. Продолжительность стельности у коров разных генотипов по TNF-a
Показатель Генотип
G/G G/A A/A
Первая лактация x±Sx, дн 283,7±0,5 282,7±0,6 282,7±1,3
Cv, % 1,3 1,8 0,6
Вторая лактация x±Sx, дн 281,3±0,9 282,1±1,2 281,5±3,0
Cv, % 1,3 2,4 5,3
Третья лактация x±Sx, 283,1±1,8* 276,5±2,4 286±6,9
Cv, % 2,0 2,4 1,7
p < 0,05, по сравнению с группой G/A
между продолжительностью сухостойного и межотельного периода составил 0,39 (p<0,05), а в группе G/G - 0,13 (p<0,05), между длительностью сухостойного периода и стельностью в первой группе - 0,61 (p<0,05), во второй -0,55 (p<0,05). В случае корреляции сервис-периода с межотельным периодом наблюдается обратная картина: у группы G/A коэффициент равен 0,15, G/G - 0,24 (p<0,05). Если признать факт наличия сбалансированных взаимосвязей между различными признаками, характеризующими воспроизводство, то не исключено влияние генотипа на степень связи между указанными показателями. Однако это заключение предварительное и требует дальнейшего изучения с учетом множества других факторов.
Выводы. Генетическая структура изученной популяции крупного рогатого скота красной степной породы
по гену фактора некроза опухоли альфа характеризуется соотношением генотипов G/G, G/A, A/A - 56, 38 и 6% соответственно, с частотой встречаемости аллеля G - 75%, А - 25%. Популяция находится в состоянии генного равновесия.
Животные с генотипом G/G отличаются более ранним возрастом первого осеменения, по сравнению с генотипом G/A, разница составляет 2 месяца (p<0,05).
Продолжительность стельности у животных с генотипом G/G больше, чем у гетерозигот G/A, на 6,6 дн. (p<0,05).
По длительности сервис-периода, межотельного и сухостойного периода статистически достоверных различий между животными с разными генотипами не установлены.
Литература.
1. Дорощук С.В. Молочная продуктивность и воспроизводительная функция коров // Достижения науки и техники АПК.
2012. № 11. С. 47-49.
2. Meuwissen T., Hayes B., Goddard M. Accelerating Improvement of Livestock with Genomic Selection //Annu. Rev. Anim. Biosci.
2013. №1. P. 221-237.
3. Weller J.I., Ron M. Invited review: quantitative trait nucleotide determination in the era of genomic selection // J Dairy Sci. 2011. V.94. №3. P. 1082-1090.
4. Discovery of single nucleotide polymorphisms in candidate genes associated with fertility and production traits in Holstein cattle / S.D. Cochran, J.B. Cole, D.J. Null, P.J. Hansen // BMC Genetics. 2013. V.14. P. 49-72.
5. Genome wide analysis of fertility and production traits in Italian Holstein cattle / G. Minozzi, E.L. Nicolazzi, A. Stella, S. Biffani, R. Negrini, B. Lazzari, P. Ajmone-Marsan, J.L. Williams//PLoS One. 2013. V.8. №11. P. e80219.
6. Schneider A., Correa M.N., Butler W.R. Association between growth hormone receptor Alul polymorphism and fertility of Holstein cows// Theriogenology. 2013. V.80 P. 1061-1066.
7. Short communication: Effects of the progesterone receptor variants on fertility traits in cattle/A.M. Driver, W. Huang, S. Gajic, R.L. Monson, G.J. Rosa, H. Khatib //^ Journal of Dairy Science. 2009. V.92. P. 4082-4085.
8. Abdolmohammadi A., Zamani P. SNP exploring in the middle and terminal regions of the IGF-1 gene and association with production and reproduction traits in Holstein cattle // Gene. 2014. V. 540. №1. P. 92-95.
9. Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine follicle-stimulating hormone receptor and effects of genotypes on superovulatory response traits/ A.T. Cory, C.A. Price, R. Lefebvre, M.F. Palin//Anim Genet. 2013. V.44. №2. P. 197-201.
10. Kehrli M.E. Jr, Nonnecke B.J., Roth J.A. Alterations in bovine neutrophil function during the periparturient period //American Journal of Veterinary Research. 1989. V.50. №2. P. 207-214.
11. Кевра М.К. Фактор некроза опухолей: изучение роли в организме // Медицинские новости. 1995. №8. С. 3-22.
12. Aggarwal B.B., Gupta S.C., Kim J.H. Historical perspectives on tumor necrosis factor and its superfamily: 25 years later, a golden journey // Blood. 2012. V.119. № 3. P. 651-665.
13. Karolchik D., Barber G.P., Casper J. The UCSC Genome Browser database: 2014 update // Nucleic Acids Research. 2014. V.42. № 1. P. D764-D770.
14. Влияние полиморфизма -824 А/G гена фактора некроза опухоли на молочную продуктивность коров красной степной породы / Н.Н. Кочнев, Т.И. Крыцына, Р.Б. Айтназаров, Г.М. Гончаренко, Н.С. Юдин// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2014. №4. С. 68-73.
15. Association of polymorphism harbored by tumor factor alpha gene and sex of calf with lactation perfomance in cattle / N. S. Yudin, R. B. Aitnazarov, M. I. Voevoda, L. A. Gerlinskaya, M. P. Moshkin //Asian Australas. J. Anim. Sci. 2013. V. 26. №10. P. 1379-1387.
16. Ассоциация полиморфизма -824 А/G гена фактора некроза опухоли с показателями роста телят/ Т.И. Крыцына, Н.Н. Кочнев, Р.Б. Айтназаров, Г.М. Гончаренко, Н.С. Юдин//ВестникНГАУ. 2014. №3. С. 71-75.
17. Relationships between the first ovulation postpartum and polymorphism in genes relating to function of immunity, metabolism and reproduction in high-producing dairy cows / K. Shirasuna, C. Kawashima, C. Murayama, Y. Aoki, Y. Masuda, K. Kida, M. Matsui, T. Shimizu, A. Miyamoto // J. Reprod. Dev. 2011. № 57. P. 135-142.
POLYMORPHISM OF -824 A/G TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA GENE AND INDICATORS OF CATTLE REPRODUCTION
T.I. Krytsyna1, N.N. Kochnev1, R.B. Aitnazarov2, N.S. Yudin2'34, S.N. Pechurin4
'NovosibirskAgrarian State University, Dobrolyubovstr., 160, Novosibirsk, 630039, Russia
2Institute of Cytology and Genetics Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Lavretyev ave., 10, Novosibirsk, 630090, Russia 3Institute of Internal Medicine Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences, B. Bogatkov str., 175/1, Novosibirsk, 630089, Russia 4Novosibirsk State University, Pirogova Str., 2, Novosibirsk, 630090, Russia
Summary. Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) gene encodes the protein which is a multifunctional cytokine, and along with the functions of the immune response it is involved in the morphogenesis and fetation, plays the important role in the formation of a mammary gland, stimulates the formation of prostaglandins. The purpose of our study was to investigate the possible association between -824A/G polymorphism in the promoter of TNF-alpha gene and reproductive indices (age at the first insemination, service period, calving interval, interlactation period, pregnancy) of Red Steppe cattle. Polymorphism of TNF-alpha gene was studied using polymerase chain reaction followed by restriction fragment length analysis. For the analysis DNA was extracted by the standard method of protease treatment followed by extraction with phenol-chloroform from the blood of 148 cows of Red Steppe breed from agricultural cooperative stud farm "Stepnoy" in Altai Territory. Reproduction indices were determined on the basis of zootechnical calculation. In the studied group the frequencies of genotypes G/G, G/A and A/A for TNF-alpha gene was 56, 38 and 6 % respectively. The frequency of the rare allele A was 25 %, of allele G - 75 %. The distribution of genotype frequencies corresponded to the Hardy-Weinberg equilibrium distribution. The age of animals with genotype G/G at first insemination was 2 months less compared to G/A genotype (p < 0.05). The duration of pregnancy in the animals with G/G genotype was higher than that in G/A genotype by 6.6 days (p < 0.05). No significant associations were found for other reproductive performance (service period, calving interval and interlactation period) between cows with different genotypes. Keywords: polymorphism, tumor necrosis factor-alpha, TNF-alpha, reproduction, age at first insemination, service period, pregnancy. Author Details: T.I. Krytsyna, Post graduate Student (e-mail: krytsyna@list.ru); N.N. Kochnev, Dr. Sc. (Biol.), Prof.; .R.B. Aitnazarov, Cand. Sc. (Biol.), Researcher; N.S. Yudin, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher, S.N. Pechurin, Student
For citation: Krytsyna T.I., Kochnev N.N., Aitnazarov R.B., Yudin N.S., Pechurin S.N. -824 A/G polymorphism of the tumor necrosis factor alpha gene and reproduction indicators of cattle. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2015. T.29. №1. pp. 39-41 (In Russ)
