CC BY
20КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
М.И.Кормилицына1, И.С.Мещерякова1, Т.В. Михайлова1, А.А.Добровольский2
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ТУЛЯРЕМИИ
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва, 2Окружная клиническая больница, Ханты-Мансийск
Цель. Совершенствование лабораторной диагностики туляремии путем определения ДНК F. tularensis в сыворотке крови больных методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Материалы и методы. 39 сывороток крови больных, полученные во время трансмиссивной эпидемической вспышки туляремии в г. Ханты-Мансийск в 2013 году, исследованы в реакции агглютинации, пассивной гемагглютинации, ПЦР-РВ. Истользованы специфические праймеры и флюоресцентные зонды: ISFTu2F/R+ISFTu2P, Tul4GF/R+tul4-PR2. Результаты. Установлены преимущества использования ПЦР-РВ для ранней диагностики туляремии, когда специфические антитела с помощью традиционных иммунологических методов не обнаруживаются. Использование сочетания прай-меров и зонда ISFTu2F/R+ISFTu2P позволило выявить ДНК F. tularensis в 100% сывороток, тогда как сочетание Tul4GF/R+tul4-PR2 — в 92% сывороток. Данные получены при выделении ДНК из сывороток экспресс-методом «Проба Рапид». В случае исследования сывороток через 3 — 4 недели от начала заболевания клинико-эпидемиологический диагноз туляремии был подтвержден как иммуно-серологическими, так и ПЦР-РВ методами. Заключение. ПЦР-РВ с праймерами ISFTu2F/R и флуоресцентным зондом ISFTu2P, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет определять ДНК F. tula-rensis в сыворотках крови больных как в ранний период, так и через 3 — 4 недели от начала заболевания.
Журн. микробиол., 2015, № 3, С. 59—63
Ключевые слова: лабораторная диагностика туляремии, сыворотка крови, ДНК, Francisella tularensis, полимеразная цепная реакция в реальном времени, праймеры, зонды
M.I.Kormilitsyna1, I.S.Mescheryakova1, T.V.Mikhailova1, A.A.Dobrovolsky2
REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION IN TULAREMIA LABORATORY DIAGNOSTICS
1Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow; 2Regional Clinical Hospital, Khanty-Mansiysk, Russia
Aim. Enhancement of tularemia laboratory diagnostics by F. tularensis DNA determination in blood sera of patients using real time polymerase chain reaction (RT-PCR). Materials and methods. 39 blood sera of patients obtained during transmissive epidemic outbreak of tularemia in Khanty-Mansiysk in 2013 were studied in agglutination reaction, passive hemagglutination, RT-PCR. Specific primers and fluorescent probes were used: ISFTu2F/R+ISFTu2P, Tul4GF/R+tul4-PR2. Results. Advantages of using RT-PCR for early diagnostics of tularemia, when specific antibodies are not detected using traditional immunologic methods, were established. Use of a combination of primers and ISFTu2F/R+ISFTu2P probe allowed to detect F. tularensis DNA in 100% of sera, whereas Tul4GF/R+tul4-PR2 combination — 92% ofsera. The data were obtained when DNA was isolated from sera using «Proba Rapid» express method. Clinical-epidemiologic diagnosis oftularemia was confirmed by both immune-serologic and RT-PCR methods when sera were studied 3 — 4
weeks after the onset of the disease. Conclusion. RT-PCR with ISFTu2F/R primers and fluorescent probe ISFTu2P, having high sensitivity and specificity, allows to determine F. tularensis DNA in blood sera of patients at both the early stage and 3 — 4 weeks after the onset of the disease.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 3, P. 59—63
Key words: tularemia laboratory diagnostics, blood sera, DNA, Francisella tularensis, real time polymerase chain reaction, primers, probes
В практике здравоохранения диагноз туляремии у больных людей устанавливают на основе клинико-эпидемиологических данных, подтвержденных лабораторными иммуно-серологическими методами. Клиническая диагностика туляремии в ранний период затруднена из-за наличия неспецифических симптомов, характерных для других инфекционных заболеваний. Серологическая диагностика, свидетельствующая о заболевании, основана на выявлении антител у больных в реакциях агглютинации (РА) и непрямой гемагглютинации (РНГА); антитела определяются, как правило, только через 7 — 15 суток. Дальнейшее нарастание этих титров антител выше диагностических (>1:100) подтверждает свежий случай туляремии [3]. Более ранняя диагностика (в течение первой недели болезни) возможна с помощью иммунофер-ментного анализа (ИФА). Между тем, до настоящего времени этот эффективный метод серологической диагностики туляремии не находит широкого применения из-за отсутствия диагностической тест-системы и доступен лишь специализированным научным лабораториям. Бактериологическая диагностика туляремии имеет вспомогательное значение. Высокочувствительный метод определения ДНК Francisella tularensis — полимеразная цепная реакция (ПЦР), его диагностические возможности недостаточно изучены и он не внедрен в клиническую практику [3]. Отмечено, что при исследовании крови больных в ПЦР чувствительность реакции составляла 103 — 104 КОЕ/мл [5]. Более эффективной оказалась ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), позволившая выявлять 101 — 102 КОЕ/мл [7]. Повышение специфичности и чувствительности ПЦР до 1 КОЕ/мл возможно при использовании меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб (зондов), комплементарных участку PCR-продукта [11]. Таким образом, наиболее эффективным методом выявления возбудителя может стать ПЦР-РВ в качестве дополнительного для ранней диагностики туляремии.
Цель работы — совершенствование лабораторной диагностики туляремии путем определения ДНК F.tularensis в сыворотке крови больных методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Исследование проводили на 39 образцах сывороток периферической крови, полученных от больных в период трансмиссивной эпидемической вспышки туляремии в г. Ханты-Мансийск летом 2013 года.
Сыворотки (n=13) были отобраны у больных в период 11 — 22 сут от начала заболевания (1 группы больных); 26 парных сывороток (2 группа) включали: первые сыворотки (n=13), взятые в начальный период заболевания до 7 — 10 сут, вторые (n=13) — через 7 — 28 сут после первого взятия. Сыворотки доставляли в лабораторию в течение 24 час. при 4 — 8°С, замораживали и хранили при —20°C. В качестве контроля использовали 6 сывороток больных с диагнозами: хронический бруцеллез (1), микоплазмоз (1) и неясной этиологии (4).
Сыворотки исследовали с помощью серологических реакций: РА с туляремийным диагностикумом (НПО Микроген) и РНГА (макро-метод) с эритроцитарным туляремийным антигенным диагностикумом ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, а также с помощью ПЦР-РВ. Для выделения ДНК использовали комплекты наборов «Проба НК» (НК), «Проба ГС» (ГС) и «Проба Рапид» (ПР) (ДНК-Технология, Россия). Выделение
ДНК проводили по инструкции производителя, соотношение отобранного образца сыворотки (100 мкл) и реагента ПР составляло 1:6. ДНК-мишенями в амплификации служили: участок ISFtu2 — элементно-подобный вставки в геноме F.tularensis и ген tul4 (lpnA), кодирующий иммуногенный эпитоп белка м.м. 17 кД наружной мембраны F.tularensis. В состав амплификационных смесей были включены выбранные нами видо-специфические праймеры: ISFTu2F/R [11] и Tul4GF/R [1], а также зонды: ISFTu2P [11] и tul4-PR2 (FAM) CTCCAGAAGGTTCTAAGTGCCATGAT-(RTQ1) для увеличения специфичности реакции. Последний зонд подобран совместно с сотрудниками ЗАО «Синтол» (Россия). Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ с флуоресцентными зондами состояла из 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера (рН 8,8), 1,5 мкл 25 mM MgCl2, 2,5 мкл смеси дНТФ по 2,5 mM каждого (2,0 мкл для тест-системы ISFTu2+ISFTu2P), 12 pM каждого праймера, 6 pM флуоресцентной пробы, деионизированной воды, фермента 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами и 5 мкл ДНК-матрицы (конечный объем смеси — 25 мкл).
Контролем служили: деионизированная дистиллированная вода — отрицательный контроль; образец, содержащий ДНК-матрицу F.tularensis (штамм 503) — положительный контроль. Предел определения ДНК F.tularensis составлял 3,9х102 КОЕ/мл (эквивалентный ДНК-копиям/мл).
ПЦР-РВ проводили в приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия). Программа термоциклирования реакционных смесей: I цикл — 94° — 5 мин, II — (94° — 30 сек, Т° отжига — 60 сек) х 45 циклов. После амплификации проводили плавление продукта в диапазоне 68 — 94°С. Использовали повышение температуры (на 1°) и удержание ее на каждом шаге по 5 сек. Детекцию полученных фрагментов осуществляли гибридизационно-флуоресцентным методом. При анализе результатов использовали программу Rotor-Gene 6000 (версия 1.8.17.5), специфичность амплификационного продукта определяли по кинетическим кривым плавления и контрольным образцам.
Для статистической обработки результатов использовали общепринятые биометрические методы. Доверительный интервал для средних величин рассчитывали с вероятностью при Р=0,05.
Первоначально сыворотки всех больных были исследованы серологическими методами для определения диагностических возможностей традиционных методов. Специфические антитела при исследовании сывороток 1 группы больных выявлены у 12 из 13 чел. (92,3±14,5%) в РА с титрами антител от 1:50 до 1:400 и в РНГА у всех 13 чел. (100±13%) с титрами от 1:400 до 1:1600. Антитела в сыворотках 2 группы больных обнаружены в РА в первые сутки от начала заболевания у 3 человек (23,1+23,4%) с титрами 1:50 — 1:800, в соответствующих парных сыворотках этой группы выявлены антитела с титрами 1:50 — 1:800 у 12 больных (92,3+14,5%); в РНГА у 4 (30,8+10,4%) с титрами 1:100 — 1:1600, в парных сыворотках — с титрами 1: 100 — 1:1600 у всех 13 больных (100+13%).
Для выявления наибольшей эффективности ПЦР-РВ были апробированы три метода экстракции ДНК из сывороток крови больных на примере 1 группы. ДНК из сывороток выделяли 3 методами: НК, ГС, ПР. При выделении ДНК методами НК и ГС положительные результаты получены с 4 образцами сывороток (30,8+25,6%) с праймерами и зондом Tul4GF/R+tul4-PR2 и 8 образцами (61,5+27%) с ISFTu2F/ R+ISFTu2P. При выделении ДНК методом ПР положительные результаты были получены с 11 сыворотками (92,3+14,8%) в реакции с Tul4GF/R+tul4-PR2 и 13 (100+13%) — с ISFTu2F/R+ISFTu2P. Полученные результаты свидетельствовали о лучшей экстракции ДНК методом ПР и предпочтительном использовании праймеров с зондом ISFTu2F/R+ISFTu2P. В связи с полученными результатами ДНК из сывороток 2 группы выделяли только методом ПР. ДНК F.tularensis обнаружена во всех 26 образцах (100+13%) в ПЦР-РВ с ISFTu2F/R+ISFTu2P, тогда как при использовании Tul4GF/
R+tul4-PR2 ДНК выявлена в 10 из 13 первых сывороток (76,9±23,4%) и 9 парных сывороток (69,2±25,6%).
В контрольных сыворотках больных с различной этиологией ДНК возбудителя туляремии не была выявлена.
Таким образом, ПЦР-РВ показала определенные преимущества перед серологическими методами особенно для диагностирования заболевания в первые сутки после заражения. Наиболее эффективным при исследовании сывороток больных в ПЦР-РВ было сочетание праймеров и зонда ISFTu2F/R+ISFTu2P. Использование другого сочетания праймеров и зонда Tul4G+tul4-PR2 оказалось менее перспективным в связи с более длительной амплификацией ПЦР-продукта длиной 357 пар нуклеотидов (п.н.), тогда как размер ампликонов при использовании ISFTu2+ISFTu2P составляет 97 п.н.
Так как мы использовали сыворотку крови больных, важно было понять, как бактерии (и ДНК) могли попасть в нее из форменных элементов крови. В эксперименте ex vivo показано, что вирулентный штамм F.tularensis мог быть обнаружен в лейкоцитах, плазме, эритроцитах крови человека [4, 6].
Впервые нами показано, что ПЦР-РВ является эффективным методом выявления ДНК F.tularensis в сыворотке крови больных для ранней диагностики туляремии, а также для диагностики на протяжении первого месяца заболевания. В организме больного человека, как показано ранее, туляремийные бактерии содержатся в очень малом количестве, культуры иногда выделяли в ранние сроки от начала заболевания из кожной язвы, бубона (лимфоузла), крови [2, 10]. Имеются данные о редких случаях изоляции возбудителя туляремии из крови больных в более поздние сроки болезни, чаще при наличии пневмонии или иммунодефицита. У данных больных отмечалась бактериемия с гематогенной диссеминацией возбудителя [8, 9].
Обобщая данные нашего исследования, можно заключить, что по времени выделения и количеству экстрагированной ДНК F.tularensis из сыворотки крови больных наиболее оптимальным оказался экспресс-метод «Проба Рапид». Использование праймеров с флуоресцентным зондом обеспечило высокую чувствительность, специфичность ПЦР-РВ, что позволило определять ДНК F.tularensis в сыворотках крови как в ранний период заболевания, когда не выявлены специфические антитела, так и в более отдаленные сроки — через 3 — 4 недели от начала заболевания, что подтверждает результаты иммуно-серологической диагностики туляремии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кормилицына М.И., Мещерякова И.С., Михайлова Т.В. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Francisella tularensis, различающихся по таксономической принадлежности и вирулентности. Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2013, 3: 2225.
2. Олсуфьев Н.Г. Бактериологические методы диагностики. В: Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М., Медицина, 1975,С. 118-143.
3. Руководство по медицинской микробиологии. Книга II. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Под редакцией Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой С.М. М., БИНОМ, 2010, С. 728-754.
4. Forestal C.A., Malik M., Catlett S.V. et al. Francisella tularensis has a significant extracellular phase in infected mice. J. Infect. Diseases. 2007. 196 (1):134-137.
5. Grunow R., Splettstoesser W., McDonald S. et al. Detection of Francisella tularensis in biological specimens. Using a capture enzyme-linked immunosorbent assay, an immunochroma-tographic handheld assay, and a PCR. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000, 7 (1): 86-90.
6. Horzempa J.J., O'Dee D.M., Stolz D.B. et al. Invasion of erythrocytes by Francisella tularensis. J. Infect. Diseases. 2011, 204: 51-59.
7. Johansson A., Forsman M., Sjöstedt A. The development of tools for diagnosis of tularemia and typing of Francisella tularensis. APMIS. 2004, 112: 898-907.
8. Karagöz S., Kiliç S., Berk E. et al. Francisella tularensis bacteremia: report of two cases and review of the literature. New Microbiologica. 2013, 36: 315-323.
9. Provenza J.M., Klotz S.A., Penn R.L. Isolation of Francisella tularensis from blood. J. Clin. Microbiol. 1986, 24 (3): 453-455.
10. Tärnvik A., Berglund L. Tularaemia. Eur. Respir. J. 2003, 21: 361-373.
11. Versage J.L., Severin D.D.M., Chu M.C., Petersen J.M. Development of a multitarget RealTime TaqMan PCR assay for enhanced detection ofFrancisella tularensis in complex specimens. J. Clin. Microbiology. 2003, 41 (12): 5492-5499.
Поступила 01.12.14
Контактная информация: Кормилицына Марина Ильинична, к.б.н., 123098, Москва, ул.Гамалеи,18. р.т.(499)193-73-51
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
М.В.Макарова, С.Г.Сафонова, Ю.Д.Исаева, Л.Ю.Крылова, Е.Ю.Носова, В.И.Литвинов
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРИТИЧЕСКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ХИМИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Sensititre MycoTB
Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом
Цель. Определение критической концентрации химиопрепаратов, широко применяющихся при лечении туберкулеза, для использования в оценке результатов лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью тест-системы Sensititre MycoTB. Материалы и методы. Изучена в тест-системе Sensititre MycoTB минимальная ингиби-рующая концентрация (МИК) изониазида, рифампицина, стрептомицина, этамбутола, амикацина, канамицина, офлоксацина и моксифлоксацина в отношении условно чувствительных и условно устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), выделенных из различного диагностического материала, полученного от больных разными формами туберкулеза легких, находившихся на лечении в стационаре МНПЦБТ и противотуберкулезных диспансерах Москвы. Результаты. Критическая концентрация химиопрепаратов для тест-системы MycoTB была определена в результате анализа полученных значений МИК препаратов как наименьшая концентрация, подавляющая рост 95% чувствительных штаммов и не препятствующая росту 95% устойчивых. Установлены следующие значения МИК: стрептомицина — 1,0, изониазида — 0,25, рифампицина — 1,0, этамбутола — 4,0, офлоксацина — 2,0, моксифлоксацина — 0,25, канамицина — 2,5 и амикацина — 1,0 мкг/мл. Заключение. Разработанная критическая концентрация указанных препаратов в настоящее время применяется для оценки чувствительности/устойчивости клинических изолятов МБТ в МНПЦБТ.
Журн. микробиол., 2015, № 3, С. 63—67
Ключевые слова: чувствительные и устойчивые штаммы Mycobacterium tuberculosis, критическая концентрация, химиопрепараты
M.V.Makarova, S.G.Safonova, Yu.D.Isaeva, L.Yu.Krylova, E.Yu.Nosova, V.I.Litvinov
DETERMINATION OF CRITICAL CONCENTRATION OF CHEMOTHERAPY DRUGS FOR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS SENSITIVITY EVALUATION USING Sensititre MycoTB TEST SYSTEM
Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control, Russia
Aim. Determination of critical concentration for chemotherapy drugs, widely used for tuberculosis treatment, for use in Mycobacterium tuberculosis drug sensitivity results evaluation by Sensititre MycoTB test-system. Materials and methods. Minimal inhibiting concentration (MIC) of isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, amikacin, kanamycin, ofloxacin and moxi-
