CC BY
38
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.841.95:579.083.1]:577.21.08
Кормилицына М.И., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В.,
ПЕРВАЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ У КЛЕЩЕЙ IxODES TRIANGULICEPS BIR. В РОССИИ
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства
здравоохранения Российской Федерации, 123098, Москва
Мещерякова И.С.
С использованием метода полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) впервые исследованы на наличие ДНК Francisella tularensis иксодовые клещи Ixodes tri-anguliceps (140 взрослых особей и 211 пулов нимф), собранные с мелких лесных млекопитающих в лесах Среднего Урала (Чу-совской район Пермского края). C использованием гена-мишени 16S rRNA размером 1165—1170 п.н. ДНК Francisella выявлена у 12 взрослых клещей и в 4 пулах нимф. При амплификации более короткого участка того же гена (221—222 п.н.) дополнительно обнаружены ДНК-положительные образцы у 17 особей из 128 имаго и в 16 из 89 пулов нимф. Все 49 положительных образцов в ПЦР-РВ с праймерами и зондами, комплементарными участку гена lpnA (tul4) и ISFtu2-элементу, идентифицированы как F. tularensis. Полученные данные свидетельствуют о возможности вовлечении клещей I. trianguliceps в циркуляцию возбудителя туляремии в природных очагах лесного типа. Ключевые слова: идентификация; Francisella tularensis; иксодовые клещи; Ixodes trianguliceps; ПЦР в реальном времени; 16S rRNA; lpnA (tul4); ISFtu2; туляремия.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-67-70
Туляремия — зоонозная инфекция, природные очаги которой широко распространены в различных странах, включая Российскую Федерацию. Резервуарные хозяева туляремийной инфекции — главным образом грызуны и зайцеобразные, а переносчики — кровососущие членистоногие. К их числу относятся иксодовые клещи подсемейства Ixodinae. Francisella tularensis в иксодовых клещах способна размножаться и длительно сохраняться, чему способствует трансстадиальная (трансфазовая) передача от личинки до половозрелой особи [1—3].
Природные очаги лесного типа широко распространены в Евразии. Им свойствены сравнительно «вялый» эпизоотический процесс и слабое эпидемическое проявление [1, 4, 5]. Наравне с другими видами иксодовых клещей (Ixodes ricinus и I. persul-cates) I. trianguliceps, как считали Н.Г. Олсуфьев и Т.Н. Дунаева [1], может быть вероятным переносчиком и хранителем возбудителя туляремии. Клещи этого вида распространены в лесах значительной части Евразии. Все фазы его развития паразитируют на лесных мелких млекопитающих. I. trianguliceps не нападает на человека и может иметь только эпизоотическое значение [6]. Описан единственный случай выделения F. tularensis от клещей I.trianguliceps в Словакии в 1979 г. [7]. Предпринятые ранее попытки установить роль этого вида в циркуляции возбудителя туляремии в природных очагах лесной зоны России не дали положительных результатов [8, 9].
Возбудитель туляремии — F. tularensis входит в род Francisella, включающий несколько видов микроорганизмов — F. tularensis, F. guangzhouensis, F. halioticida, F. hispaniensis, F. noatunensis и F. philomiragia [10], основное значение из которых для инфекционной патологии человека имеет возбудитель туляремийной инфекции. В последние годы род Francisella пополнился так называемыми Francisella-like бактериями — эн-досимбионтами клещей. Значительная часть эндосимбионтов была обнаружена в иксодовых клещах (большей частью у клещей рода Dermacentor) молекулярно-биологическими методами, в том числе полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [11—13]. Подобные молекулярно-генетические исследования клещей I. trianguliceps ранее не проводились.
Цель работы - выяснение возможной роли клещей I. trianguliceps в циркуляции F. tularensis путем выявления ДНК этого возбудителя методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Материалы и методы
Исследованы нимфы и имаго I. trianguliceps, снятые с мелких лесных млекопитающих, отловленных в 2003—2011 гг. на стационаре (58°33' с.ш., 57°28' в.д.) в южнотаежных низкого-рьях Среднего Урала (Чусовской р-н Пермского края). Биоцено-тические особенности этой территории, а также приемы сбора клещей и их последующего хранения описаны ранее [14, 15]. Для исследования были отобраны 562 в разной степени напитавшиеся особи I. trianguliceps, снятые с 287 зверьков 9 видов. Все взрослые клещи (136 самок и 4 самца) тестированы индивидуально (от 1 до 38 особей в год). Нимфы были сгруппированы в 211 пулов по 2 клеща (от 7 до 43 пулов в год). Исследуемых клещей подвергали гомогогенизации в пробирках в объеме 200 мкл фосфатно-буферного раствора. Для экстракции ДНК использовали набор «Проба НК» (ДНК-Технология, Россия).
Родоспецифическую ген-мишень 16S rRNA Francisella определяли в образцах методом ПЦР-РВ с праймерными парами Forward/Revers: 1) Fr153F0,1/Fr1281R0,1 [16], 2) NC-Fran16Sr-F (5-3) ATGTTGGGTTAAGTCCCGCA (реверс одного из прайме-ров — NC-Fran16S-R [17]) и Fr1281R0,1 [16]. Размеры ампли-конов около 1167 пар нуклеотидов (п.н.) и 221—222 п.н. соответственно. Видоспецифическими ген-мишенями F. tularensis служили фрагмент гена tul4 (lpnA) (324—357 п.н.), кодирующего иммуногенный эпитоп белка с молекулярной массой 17 кД наружной мембраны F. tularensis [18], и элемент ISFtu2 (97 п.н.), представляющий собой подобие вставок, присутствующих во множестве копий в геномах F. tularensis [19]. Применяли прай-меры: Tul4GF/R, ISFtu2F/R и меченные флуоресцентными агентами олигонуклеотидные пробы (зонды): tul4-PR2 [20], ISFtu2P [19]. Праймеры и зонды были синтезированы ЗАО «Синтол» (Россия).
Для ПЦР-РВ использованы 2 готовые реакционные смеси: 1) в присутствии SYBR Green I; 2) с флюоресцентными зондами. К реакционным смесям добавляли MgCl2 до конечной концентрации 1,5 мМ, 10—12 pM каждого праймера, 5—6 pM флюоресцентной пробы, деионизированной воды («Синтол», Россия). Объем исследуемой ДНК-матрицы был 5 мкл (нимфы) или 10 мкл (имаго), конечный объем смеси — 25 мкл.
Контролем служили: деионизированная дистиллированная вода — отрицательный контроль; образец, содержащий ДНК-матрицу F. tularensis (штамм 503), — положительный контроль. В некоторых опытах дополнительно использовали ДНК-матрицу F. tularensis subsp. novicida (штамм Utah112 или D9876). ДНК для контролей получена из культур штаммов, хранящихся в коллекции лаборатории туляремии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
ПЦР-РВ проводили в приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия). Программа термоциклирования реакционных смесей (с зондом): I цикл — 94°С — 5 мин, II — (60°С — 60 с, 94°С — 30 с) х 45 циклов; при использовании праймеров Fr153F0,1/ Fr1281R0,1 или NC-Fran16SrF /Fr1281R0,1: I цикл — 94°С — 5 мин, II цикл (94°С — 30 с, 60 или 59°С — 30 с, 72°С — 60 с) х 40, III — 72°С — 3 мин. После амплификации проводили плавление в диапазоне между 68° до 94°С с повышением температуры на 1°С и удержанием ее на каждом шаге 5 с. Детекцию полученных фрагментов осуществляли гибридизационно-флюоресцентным методом. При анализе результатов использовали программу Rotor-Gene 6000 (версия 1.8.17.5). Специфичность амплифика-ционного продукта определяли по кинетическим кривым плавления в сравнении с контрольными образцами.
Для подтверждения положительных результатов применя-
Таблица 1
Результаты идентификации ДНК бактерий рода Francisella и вида F tularensis ПЦР-РВ у клещей I. trianguliceps по 3 ген-мишеням
16S rRNA tul4 (lpnA) ISFtu2
Фаза клещей родоспецифические праймеры видоспецифические праймеры и зонды
Fr153F0,1/ Fr1281R0,1 NC-Fran16Sr-F/ Fr1281R0,1 Tul4GF/R и tul4-PR2 ISFtu2F/R и ISFtu2P
Нимфы Имаго
4/211* 12/140
16/89 17/128
19/20 27/29
14/20 21/29
Примечание. * положительный результат амплификации / число исследованных образцов.
ли электрофоретический анализ в 1,5—2,0% агарозном геле в однократном ТВЕ буфере (pH 8,0) с окрашивающим раствором этидия бромида в концентрации 0,5 мкг/мл. Использовали камеру для горизонтального электрофореза («DNA Sub Cell», «BioRad», США). После электрофореза проводили последующее фотографирование (с помощью видеосистемы «DNA Analyzer», Россия) в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе ECX-15-.M с длиной волны УФ-ламп 312 нм («Vilber Lourmat», EEC).
Статистическая обработка выполнена для уровня значимости 0,95. В качестве доверительных интервалов при расчете % (P) приняты удвоенные значения ошибки выборочной доли (2mp).
Результаты и обсуждение
Использование ПЦР-РВ с праймерной парой Fr153F0,1/ Fr1281R0,1, направленной на выявление участка гена 16S rRNA, позволило определить в экстрагированной ДНК незначительные флюоресцентные сигналы — всего в 16 образцах из 351 (табл. 1). ПЦР-продукт, полученный с данными праймерами, имел значительное число пар нуклеотидов, при этом реакция обладала чувствительностью 103-4 КОЕ/мл, что не позволяло выявлять малые концентрации ДНК Francisella. В связи с этим была испытана другая праймерная пара NC-Fran16Sr-F/Fr1281R0,1, направленная на получение продукта амплификации меньшего участка того же гена 16S rRNA. Предварительно была определена чувствительность ПЦР-РВ с этими праймерами, которая составила 2^102 КОЕ/мл (эквивалентно ДНК-копиям/мл) для штамма F. tu-larensis 503 при средних значениях количества циклов (Ct) 35.
Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируе-мых участков гена 16S rRNA представителей рода Francisella показал высокую степень гомологии — 99—100%; количество
копий в ДНК некоторых штаммов могло быть от 1 до 3 [21]. Специфичность тест-системы была подтверждена реакцией с использованием ДНК нескольких штаммов Francisella: F. tula-rensis (21 штамм) четырех подвидов и F. philomiragia (2 штамма), а также гетерогенных — Brucella suis, B. abortus, B. meliten-sis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Enterococcus sp. (10 штаммов). Наличие амплификации отмечено со всеми 23 ДНК Francisella и ее отсутствие с ДНК других бактерий.
В связи с большей чувствительностью этой тест-системы проведены дополнительные исследования клещей. Для этого изучены образцы ДНК нимф и имаго, отрицательных по результатам первого скрининга (с праймерами Fr153F0,1/Fr1281R0,1). При использовании новых праймеров (NC-Fran16Sr-F/Fr1281R0,1) были получены еще 33 положительных результата (см. табл. 1). Однако анализ кривых плавления ПЦР-амплификата показал относительно малые количества субстратов всех образцов по сравнению с контролем.
Для видовой идентификации F. tularensis образцы, содержавшие родоспецифические 16S rRNA-мишени Francisella spp., исследованы методом ПЦР-РВ с помощью праймеров (Tul4GF/R, ISFtu2F/R) и зондов (tul4-PR2, ISFtu2P) (см. табл. 1). В результате выявлены ген-мишени tul4 (lpnA) или ISFtu2 во всех образцах. Имели обе ген-мишени 32 образца ДНК из 49. Выявление ПЦР-продуктов было подтверждено в большинстве случаев методом гельэлектрофореза. Обобщая эти данные, можно заключить, что все 49 обнаруженных ДНК Francisella с большей вероятностью принадлежали виду F. tularensis. Таким образом, результатом использования описанных праймеров и зондов было обнаружение ДНК F. tularensis в суспензиях имаго и нимф I. trianguliceps.
ДНК F. tularensis выявлена у клещей I. trianguliceps, которые были собраны со зверьков, отловленных на протяжении всех девяти весенне-летних сезонов сбора материала. При исследовании с родоспецифическими праймерами Fr153F0,1/Fr1281R0,1 ДНК F. tularensis обнаружена у нимф и имаго, снятых с мелких млекопитающих 5 видов (табл. 2). На втором этапе исследования (с праймерами NC-Fran16Sr-F/Fr1281R0,1) положительными оказались клещи, снятые со зверьков 8 видов: Myodes rutilus, M. glareolus, M. rufocanus, A. uralensis, M. oeconomus, S. araneus, S. caecutiens и N. fodiens. Три из них (M. rutilus, M. glareolus и S. araneus) относятся к основным прокормителям I. trianguliceps в районе исследований [22].
В литературе имеются данные обнаружения ДНК франци-селл молекулярно-генетическими методами у иксодовых клещей, собранных с мелких млекопитающих. Так, ДНК F. tular-ensis выявлена у 1,5—25% клещей I. ricinus при использовании различных методов ПЦР [23, 24]. Полученные нами данные для
Таблица 2
Обнаружение ДНК F tularensis методом ПЦР-РВ (с праймерами Fr153F0,1/Fr1281R0,1) у клещей I trianguliceps, снятых со зверьков
разных видов
Число зверьков, с которых Нимфы Имаго
Виды зверьков, с которых сняты исследованные клещи исследова- из них с ДНК F. tularensis исследова- из них с ДНК F. tularensis
сняты клещи но пулов абс. % но особей абс. %
Грызуны: Красная полевка (Myodes гиШт) 139 100 0 0 92 9 9,8 ± 6,2
Рыжая полевка (М фагеоЫя) 50 39 2 5,1 ± 7,0 11 1 9,1 ± 17,3
Красно-серая полевка (Ы. ги/осапж) 27 13 0 0 23 2 8,7 ± 11,8
Полевка-экономка (МкгоШз оесопотшу) 17 11 1 9,1 ± 17,3 8 0 0
Малая лесная мышь (Apodemus ига1ет1?) 23 17 0 0 6 0 0
Насекомоядные: Обыкновенная бурозубка ^огех агапе^) 24 24 1 4,2 ± 8,2 0 0 0
Средняя бурозубка (6. саесШет) 3 3 0 0 0 0 0
Равнозубая бурозубка (6. isodon) 1 1 0 0 0 0 0
Кутора обыкновенная (Neomys fodiens) 3 3 0 0 0 0 0
Всего... 287 211 68 4 1,9 ± 1,9 140 12 8,6 ± 4,7
I. Trianguliceps вполне укладываются в границы этого диапазона. Частота положительных результатов варьирует от единиц процентов у нимф (с праймерами Fr153F0,1/Fr1281R0,1) (см. табл. 2) до 20,7 ± 6,8% у имаго (с праймерными парами — Fr153F0,1/ Fr1281R0,1 и NC-Fran16Sr-F/Fr1281R0,1).
Условия заражения людей туляремией зависят от типа природного очага как сложного биоценотического комплекса. Лесные очаги, как уже отмечено выше, эпидемиологически малоактивны [1]. Роль клещей I. trianguliceps в циркуляции возбудителя туляремии в природном очаге лесного типа ранее практически оставалась не доказанной. Полученные нами данные демонстрируют, что ДНК F. tularensis у имаго I. trianguliceps выявляется чаще, чем у нимф (см. табл. 2). Это свидетельствует в пользу предположения о способности клещей I. trianguliceps трансфа-зово передавать F. tularensis. Наличие такой передачи — важное условие возможности участия I. trianguliceps в поддержании природных очагов туляремии.
Таким образом, метод ПЦР-РВ с использованием праймер-ных пар Fr153F0,1/Fr1281R0,1 и NC-Fran16Sr-F/Fr1281R0,1 с последующим применением двух чувствительных и специфических тест-систем с зондами (Tul4G + tul4-PR2 и ISFtu2 + IS-Ftu2P) позволил решить задачу выявления ДНК F. tularensis у клещей I. trianguliceps. Полученные данные свидетельствуют о возможности вовлечения иксодовых клещей I. trianguliceps в циркуляцию возбудителя туляремии в природных очагах лесного типа. Вместе с тем нужно учитывать, что по ряду причин обнаружение ДНК не всегда свидетельствует о зараженности биоматериала жизнеспособными клетками возбудителя в момент его исследования. Кроме того, большой осторожности требует оценка видоспецифичности ПЦР-продуктов небольшого размера, поскольку в природе могут циркулировать микроорганизмы сходной родовой принадлежности, весьма близкие по структуре генома, в том числе еще не описанные и не патогенные для человека [25]. Это относится и к бактериям рода Francisella, к которому принадлежит ряд микроорганизмов, сходных с F. tularensis (так называемых Francisella-like), описанных в последние годы и так или иначе связанных с иксодовыми клещами. Выявление их существования в составе разнообразных экосистем России и изучение генетической структуры представляются дальнейшей важной задачей, решение которой, несомненно, будет способствовать совершенствованию специфичности и эффективности молекулярных методов индикации возбудителя туляремии.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 13-04-00007).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах:
Кормилицына Марина Ильинична — канд. биол. наук, ст. научн. сотр. лаборатории туляремии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравая России. e-mail: mkormilits@mail.ru 123098, Москва, ул. Гамалеи,18. Коренберг Эдуард Исаевич — д-р биол. наук, зав. лаб. переносчиков инфекций ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Ковалевский Юрий Владимирович — канд. биол. наук, вед. научн. сотр. лаб. переносчиков инфекций ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Мещерякова Ирина Сергеевна I — д-р биол. наук, зав. лаб. туляремии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
ЛИТЕРАТУРА
1. Олсуфьев Н.Г., Дунаева Т.Н. Природная очаговость, эпидемиология и профилактика туляремии. М.: Медицина; 1970.
2. Keim P., Johansson A., Wagner D.M. Molecular epidemiology, evolution and ecology of Francisella. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105: 30—66.
3. Petersen J.M., Mead P.S., Schriefer M.E. Francisella tularensis: an arthropod-borne pathogen. Vet. Res. 2009; 40 (2): 7. doi: 10.1051/
vetres:2008045. Epub 2008 Oct 28.
4. Каменнова Л.С. Итоги сероаллергического обследования населения на туляремию по трассе БАМ в Хабаровской крае. В кн.: Природноочаговые инфекции зоны хозяйственного освоения БАМ. М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; 1987: 116—8.
5. Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В., Бусоедова Н.М. Природный очаг туляремии лесного типа в восточной части зоны БАМ. В кн.: Природноочаговые инфекции зоны хозяйственного освоения БАМ. М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; 1987: 106—15.
6. Korenberg E.I., Lebedeva N.N. Distribution and some general features of the ecology of Ixodes trianguliceps Bir. in the Soviet Union. Folia Parasitol. 1969; 16 (2): 143—52.
7. Gurycova D. Fist isolation of Francisella tularensis subsp. tularensis in Europe. Eur. J. Epidemiol. 1998; 14: 797—802.
8. Дунаева Т.Н., Петров В.Г., Кулик И.Л., Никитина Н.А., Угловой Г.П. Природные очаги туляремии на территории Коми АССР. Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. 1964; 69 (1): 28—42.
9. Олсуфьев Н.Г., Доброхотов Б.П., Дунаева Т.Н., Пчелкина А.А., Родионова И.В., Арсеньев В.П., Петров В.Г. О влиянии заповед-ности территории на природные очаги инфекции. Зоологический журнал. 1970; 49 (11): 1697—704.
10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi. (Assessed 26 October 2015).
11. Niebylski M.L., Peacock M.G., Fischer E.R., Porcella S.F., Schwan T.G. Characterization of an endosymbiont infecting wood ticks, Dermacentor andersoni, as a member of the genus Francisella. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63: 3933—40.
12. Scoles G.A. Phylogenetic analysis of the Francisella-like endosymbi-onts of Dermacentor ticks. J. Med. Entomol. 2004; 41 (3): 277—86.
13. Michelet L., Bonnet S., Madani N., Moutailler S. Discriminating Francisella tularensis and Francisella-like endosymbionts in Der-macentor reticulatus ticks: valuation of current molecular techniques. Vet. Microbiol. 2013; 163 (3—4): 399—403. doi: 10.1016/j. vetmic.2013.01.014. Epub 2013 Jan 29.
14. Ковалевский Ю.В., Коренберг Э.И., Горелова Н.Б. Многолетняя динамика эпизоотического процесса природных очагов иксодовых клещевых боррелиозов в горнотаежных лесах Среднего Урала. Паразитология. 2004; 38 (2): 105—21.
15. Korenberg E.I., Kovalevskii Yu.V., Gorelova N.B., Nefedova V.V. Comparative analysis of the roles of Ixodes persulcatus and I. trianguliceps ticks in natural foci of ixodid tick-borne borrelioses in the Middle Urals, Russia. Ticks Тck-borne Dis. 2015; 6 (4): 316—21.
16. Barns S.M., Grow C.C., Okinaka R.T., Keim P., Kuske C.R. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71: 5494—500.
17. Dergousoff S.J., Chilton N.B. Association of different genetic types of Francisella-like organisms with the rocky mountain wood tick (Dermacentor andersoni) and the American dog tick (Dermacentor variabilis) in localities near their northern distributional limits. Appl. Environ. Microbiol. 2012; 78 (4): 965—71.
18. Sjöstedt A., Sandström G., Tärnvik A., Jaurin B. Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis. J. Immunol. 1990; 145 (1): 311—7.
19. Versage J.L., Severin D.D.M., Chu M.C., Petersen J.M. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (12): 5492—9.
20. Кормилицына М.И., Мещерякова И.С., Михайлова Т.М., Добровольский А.А Полимеразная цепная реакция в реальном времени в лабораторной диагностике туляремии. Журн. микробиол. 2015; (3): 59—63.
21. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE BlastSearch&BLAST_SPEC = MicrobialGenomes (Assessed 26 October 2015).
22. Kovalevskii Yu.V., Korenberg E.I., Gorelova N.B., Nefedova V.V. The ecology of Ixodes trianguliceps ticks and their role in the natural foci of ixodid tick-borne borrelioses in the Middle Urals. Entomol. Rev. 2013; 93 (8): 1073—83.
23. Higgins J.A., Hubalek Z., Halouzka J., Elkins K.L., Sjostedt A., Shipley M., Ibrahim M.S. Detection of Francisella tularensis in infected mammals and vectors using a probe-based polymerase chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2000; 62 (2): 310—8.
24. Franke J., Fritzsch J., Tomaso H., Straube E., Dorn W., Hildebrandt A. Coexistence of pathogens in host-seeking and feeding ticks within a single natural habitat in Central Germany. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76 (20): 6829—36.
25. Коренберг Э.И. Молекулярно-биологические методы и изучение феномена природной очаговости болезней. Успехи современной биологии. 2012; 135 (5): 448—62.
Поступила 02.10.2015
REFERENCES
1. Olsuf'yev N.G., Dunaeva T.N. Natural Focality, Epidemiology and Prophilaxis of Tularemia. Moscow: Meditsina; 1970. (in Russian)
2. Keim P., Johansson A., Wagner D.M. Molecular epidemiology, evolution and ecology of Francisella. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2007; 1105: 30—66.
3. Petersen J.M., Mead P.S., Schriefer M.E. Francisella tularensis: an arthropod-borne pathogen. Vet. Res. 2009, 40 (2): 7. doi: 10.1051/ vetres:2008045. Epub 2008 Oct 28.
4. Kamennova L.S. The results of sero-allergic population surveys on tularemia along the route of BAM in the Khabarovsk Territory. In: Natural Focality Infections in the Economic Development Zone of the BAM. Moscow: NIIEM them. N. F. Gamalei; 1987: 116—8. (in Russian)
5. Korenberg E.I., Kovalevskiy Yu. V., Busoedova N.M. Natural foci of tularemia forest types in the eastern part of the BAM zone. In: Natural Focality Infections in the Economic Development Zone of the BAM. Moscow: NIIEM them. NF Gamalei, 1987: 106—15. (in Russian)
6. Korenberg E.I., Lebedeva N.N. Distribution and some general features of the ecology of Ixodes trianguliceps Bir. in the Soviet Union. Folia Parasitol. 1969; 16 (2):143—52.
7. Gurycova D. Fist isolation of Francisella tularensis subsp. tularensis in Europe. Eur. J. Epidemiol. 1998; 14: 797—802.
8. Dunaeva T.N., Petrov V.G., Kulik I.L., Nikitina N.A., Uglovoy G.P. Natural foci of tularemia in the Komi ASSR. Byulleten'. Moskovskogo Obshchestva ispytateley prirody. Otdel. biologicheskiy. 1964; 69 (1): 28—42. (in Russian)
9. Olsuf'yev N.G., Dobrokhotov B.P., Dunaeva T.N., Pchelkina A.A., Rodionova I.V., Arsen'yev V.P., Petrov V.G. The effect of protected areas on natural foci of infection. Zoologicheskiy Zhurnal. 1970; 49 (11): 1697—704. (in Russian)
10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi. (Assessed 26 October 2015).
11. Niebylski M.L., Peacock M.G., Fischer E.R., Porcella S.F., Schwan T.G. Characterization of an endosymbiont infecting wood ticks, Der-macentor andersoni, as a member of the genus Francisella. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63: 3933—40.
12. Scoles G.A. Phylogenetic analysis of the Francisella-like endosym-bionts of Dermacentor ticks. J. Med. Entomol. 2004; 41(3): 277-86.
13. Michelet L., Bonnet S., Madani N., Moutailler S. Discriminating Francisella tularensis and Francisella-like endosymbionts in Der-macentor reticulatus ticks: valuation of current molecular techniques. Vet. Microbiol. 2013; 163 (3—4): 399—403. doi: 10.1016/j. vetmic.2013.01.014. Epub 2013 Jan 29.
14. Kovalevskiy Yu.V., Korenberg E.I., Gorelova N.B. Long-term dynamics of the epizootic process in natural foci of ixodid tick-borne borrelioses in mountain taiga forests of the Middle Urals. Parazi-tologiya. 2004; 38 (2): 105—21. (in Russian)
15. Korenberg E.I., Kovalevskii Yu.V., Gorelova N.B., Nefedova V.V. Comparative analysis of the roles of Ixodes persulcatus and I. trian-guliceps ticks in natural foci of ixodid tick-borne borrelioses in the Middle Urals, Russia. Ticks Tick-borne Dis. 2015; 6 (4): 316—21.
16. Barns S.M., Grow C.C., Okinaka R.T., Keim P., Kuske C.R. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71: 5494—500.
17. Dergousoff S.J., Chilton N.B. Association of different genetic types of Francisella-like organisms with the rocky mountain wood tick (Dermacentor andersoni) and the American dog tick (Dermacentor
variabilis) in localities near their northern distributional limits. Appl. Environ. Microbiol. 2012; 78 (4): 965—71.
18. Sjöstedt A., Sandström G., Tärnvik A., Jaurin B. Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis. J. Immunol. 1990; 145 (1): 311—7.
19. Versage J.L., Severin D.D.M., Chu M.C., Petersen J.M. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (12): 5492—9.
20. Kormilitsyna M.I., Meshcheryakova I.S., Mikhaylova T.M. Dobrovolski A.A. Real time polymerase chain reaction in tularemia laboratory diagnostics. Zhurn. Mikrobiol. 2015; (3): 59—63. (in Russian)
21. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE BlastSearch&BLAST_SPEC = MicrobialGenomes (Assessed 26 October 2015).
22. Kovalevskii Yu.V., Korenberg E.I., Gorelova N.B., Nefedova V.V. The ecology of Ixodes trianguliceps ticks and their role in the natural foci of ixodid tick-borne borrelioses in the Middle Urals. Entomol. Rev. 2013; 93 (8): 1073—83.
23. Higgins J.A., Hubalek Z., Halouzka J., Elkins K.L., Sjostedt A., Shipley M., Ibrahim M.S. Detection of Francisella tularensis in infected mammals and vectors using a probe-based polymerase chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2000; 62 (2): 310—8.
24. Franke J., Fritzsch J., Tomaso H., Straube E., Dorn W., Hildebrandt A. Coexistence of pathogens in host-seeking and feeding ticks within a single natural habitat in Central Germany. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76 (20): 6829—36.
25. Korenberg E.I. Molecular biological methods and study of natural focality diseases. Uspekhi sovremennoy biologii. 2012; 135 (5): 448—62. (in Russian)
FIRST MOLECULAR IDENTIFICATION OF THE TULAREMIA AGENT IN THE TICKS IXODES TRIANGULICEPS BIR. IN RUSSIA
M. I. Kormilitsyna, E. I. Korenberg, Yu. V. Kovalevskii, \1. S. Meshcheryakova
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
The ticks Ixodes trianguliceps (140 nymph pool and 211 adults) collected from small forest mammals in the forests of the Middle Urals (Chusovskoy district of the Perm Region) were tested using real-time PCR for the presence of Francisella tularensis DNA. Using the target gene 16S rRNA, the locus size 1165-1170 bp Francisella DNA was detected in 12 adults and 4 pools of nymphs. DNA-positive samples from 17 individuals from 128 adults and in 16 of 89 nymph pools were additionally detected by amplification of a shorter locus of the same gene (221-222 bp). All 49 16S rRNA gene-positive samples of real-time Taqman PCR assays directed against the tul4 (lpnA) gene locus and ISFtu2 element were identified as F. tularensis. These data suggest the possible involvement of the ticks I. trianguliceps in the circulation of the causative agent of tularemia in the natural foci of the forest type.
Key words: identification, Francisella tularensis, ticks, Ixodes trianguliceps, real-time PCR, 16S rRNA, tul4 (lpnA), ISFtu2, tularemia
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-67-70
Funding. This work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 13-04-00007).
Conflicts of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.
